Centrifugácia v laboratóriu. Centrifugácia Účel a princíp frakčnej centrifugácie

Centrifugácia je separácia mechanických zmesí na ich zložky.
pôsobením odstredivej sily. Zariadenia, ktoré sa na to používajú
terče sa nazývajú centrifúgy.
Hlavnou časťou odstredivky je rotor s namontovaným
Má otvory pre odstredivkové skúmavky. Rotor sa otáča s
vysoká rýchlosť, čo má za následok vznik významných
veľkosti odstredivých síl, pod vplyvom ktorých
mechanické zmesi sa separujú napr
sedimentácia častíc suspendovaných v kvapaline.

Procesy prebiehajúce v centrifúge

V odstredivkách sú oddelené nasledujúce procesy:
1) Odstredivá filtrácia.
2) Odstredivé usadzovanie.
3) Odstredivé čírenie.

Odstredivá filtrácia

Odstredivá filtrácia je
proces oddeľovania suspenzií v odstredivkách s
dierované bubny. Vnútorný povrch
takéhoto bubna je pokrytý filtračnou tkaninou.
Záves je hodený smerom k
steny bubna, zatiaľ čo tuhá fáza zostáva zapnutá
povrchu tkaniny a kvapaliny pod vplyvom
odstredivá sila prechádza vrstvou sedimentu a
tkanina sa vyberie cez otvory v bubne.
Odstredivá filtrácia zvyčajne pozostáva z
tri po sebe idúce fyzikálne procesy:
1)filtrácia s tvorbou zrazeniny;
2) zhutnenie sedimentu;
3) odstránenie tekutiny zadržanej zo sedimentu
molekulárne sily;

Odstredivé usadzovanie

Odstredivé usadzovanie
Odstredivé usadzovanie - separačný proces
suspenzie v odstredivkách s bubnami s
pevné steny. Suspenzia sa vstrekuje do spodnej časti
časti bubna a vplyvom odstredivej sily
hodené o steny. Na stenách sa vytvorí vrstva
sediment, a kvapalina tvorí vnútornú vrstvu a
je vytlačený z bubna a vstupuje do separácie
pozastavenie. Kvapalina stúpa nahor,
vyleje cez okraj bubna a odstráni sa
von.
V tomto prípade prebiehajú dva fyzikálne procesy:
1) Sedimentácia tuhej fázy.
2) Zhutňovanie sedimentov.

Odstredivé čírenie

Odstredivé čírenie - separačný proces
riedke suspenzie a koloidné roztoky. Takže
vykonáva sa v pevných bubnoch.
Podľa svojej fyzikálnej podstaty odstredivý
objasnenie je proces
voľné usadzovanie pevných častíc v teréne
odstredivé sily.
V bubnoch s pevnými stenami
oddeľujú sa aj emulzie. Pod
komponenty vplyvom odstredivej sily
emulzie podľa hustoty
sú usporiadané vo forme ohraničených vrstiev:
vonkajšia vrstva kvapaliny s vyššou hustotou
a vnútorná vrstva svetlejšej kvapaliny.
Kvapaliny sa z bubna vypúšťajú oddelene.

V klinických a sanitárnych laboratóriách
používa sa odstreďovanie
na oddelenie červených krviniek z
krvná plazma, krvné zrazeniny z
sérum, husté častice z
tekutá časť moču a pod
slúži na tento účel resp
ručné odstredivky, príp
elektricky poháňané odstredivky,
rýchlosť otáčania z toho
možno upraviť.
Ultracentrifúgy, rýchlosť
rotácia rotorov ktorej
presahuje 40 000 otáčok za minútu,
zvyčajne sa používa v
experimentálna prax
na separáciu organel
bunky, koloidné kompartmenty
častice, makromolekuly,
polyméry.

Využitie centrifugácie v parazitológii

Metóda sa používa na odlíšenie komplexu
krvnej zmesi, moču alebo výkalov a následne
izolovať od nej helmintov pre ďalšie
štúdium pod mikroskopom a fixovanie materiálu. IN
centrifugačný proces prítomný vo vzorke
parazity prechádzajú cez filter a hromadia sa v
spodný kužeľovitý oddiel skúmavky. Filtračná sieťka
s bunkami špeciálnej veľkosti
v skúmavke je v dôsledku toho umiestnená vertikálne
čo sa stane horizontálne (laterálne)
filtrácia vzorky. V dôsledku toho neslušné
častice nestrávenej potravy, vláknina sa usadzujú v
miešacej komory a parazitov a ich vajíčok
prejsť cez filter bez prekážok. Takže
Parazity sa teda koncentrujú v
povrchová vrstva jemného sedimentu, a
laboratórny lekár môže len starostlivo vyberať
vzorka na mikroskopické použitie
automatickú pipetu a naneste ju na
šmykľavka.

Centrifugačná metóda v cytológii

Diferenciálna metóda
používa sa odstreďovanie
frakcionácia buniek, teda ich separácia
obsahy na zlomky v závislosti od špecif
hmotnosť rôznych organel a bunkových inklúzií.
Na tento účel sa jemne rozomleté ​​bunky otáčajú dovnútra
špeciálne zariadenie - ultracentrifúga. IN
vznikajúce pri odstreďovaní bunkových zložiek
zrazenina z roztoku, nachádzajúca sa v
podľa jeho hustoty. Viac hustejšie
štruktúry sa usadzujú nižšími sadzbami
odstreďovanie a menej husté - pri vysokej
rýchlosti Výsledné vrstvy sa oddelia a študujú
samostatne.

10. Centrifugácia v botanike a fyziológii rastlín

Centrifugácia umožňuje získať rôzne
frakcie subcelulárnych častíc a preskúmať
vlastnosti a funkcie každej frakcie v
samostatne. Napríklad zo špenátových listov môžete
izolujte chloroplasty, umyte ich
opakované odstreďovanie vo vhodnom prostredí
prostredia z bunkových fragmentov a skúmať ich
správanie v rôznych experimentálnych
podmienok alebo určiť ich chemické zloženie.
Ďalej môžete pomocou rôznych úprav
techniky, zničte tieto plastidy a izolujte
cez
diferenciálna centrifugácia (opakovane).
depozície častíc pri rôznych hodnotách
zrýchlenie) ich základné prvky. Takže
pomocou ktorých bolo možné ukázať, že plastidy obsahujú
štruktúry vyznačujúce sa veľmi usporiadaným
štruktúra - takzvaná grana; všetky zrná
sa nachádzajú v limitujúcom chloroplaste
membrány (chloroplastová škrupina). Výhody
táto metóda je jednoducho neoceniteľná, pretože to
nám umožňuje odhaliť existenciu
funkčné podjednotky, ktoré tvoria
väčšie subcelulárne častice; najmä
pomocou metódy

11. Centrifugačná metóda vo virológii

Metóda odstreďovania s gradientom hustoty Bracquet môže byť
použiť na výber aj vyhľadávanie
kvantitatívne charakteristiky rastlinných vírusov. Ako sa ukázalo,
Táto metóda je plná mnohých možností aj dnes
široko používané v oblasti virológie a molekulárnej
biológia. Pri vykonávaní výskumu pomocou
hustotný gradient centrifugácia centrifugačná skúmavka
čiastočne naplnené roztokom, ktorého hustota klesá v
smerom zdola k menisku. Ak chcete vytvoriť gradient, keď
najčastejšie používané pri frakcionácii rastlinných vírusov
sacharóza. Pred začatím centrifugácie môžu vírusové častice
byť buď distribuované v celom objeme roztoku, alebo nanesené na
vrchol gradientu. Brakke navrhol tri rôzne techniky
centrifugácia v hustotnom gradiente. S izopikou
(rovnovážny) proces odstreďovania pokračuje až do
kým všetky častice v gradiente nedosiahnu úroveň, kde je hustota
prostredie sa rovná ich vlastnej hustote. teda
frakcionácia častíc prebieha v tomto prípade v súlade s
rozdiely v ich hustote. Roztoky sacharózy nemajú
dostatočná hustota na izopyknálnu separáciu mnohých
vírusy. Počas vysokorýchlostnej zónovej centrifugácie sa vírus
Najprv sa použije predtým vytvorený gradient. Častice
každý typ sedimentuje cez gradient vo forme zóny,
alebo pásiky, rýchlosťou v závislosti od ich veľkosti, tvaru a
hustota. Centrifugácia je dokončená, keď častice
naďalej sedimentovať. Rovnováha zonálna
centrifugácia je podobná vysokorýchlostnej zónovej
odstreďovanie, ale v tomto prípade odstreďovanie

12. Ťažkosti pri použití metódy odstreďovania

Aplikácia metódy diferenciálnej centrifugácie
je spojená s mnohými metodologickými ťažkosťami. Po prvé, kedy
Uvoľňovanie častíc môže poškodiť ich štruktúru. Preto
bolo potrebné vyvinúť špeciálne metódy na ničenie buniek,
ktoré by nespôsobili poškodenie štruktúry subcelulárneho
frakcie. Po druhé, keďže subcelulárne častice majú
membrány, v procese ich sekrécie môžu vzniknúť
rôzne osmotické účinky. Preto, aby sa
aby nedošlo k zničeniu ultraštruktúry skúmaných objektov
aj pri ich izolácii je potrebné starostlivo vyberať zloženie
prostredie, v ktorom dochádza k deštrukcii a sedimentácii buniek
častice. Nakoniec odplavenie subcelulárnych častíc
(ich resuspendovanie v médiu a následné opakované
centrifugácia) môže viesť k strate niektorých
látky v nich obsiahnuté, ktoré pod vplyvom difúznych síl
ísť do riešenia.
Z tohto dôvodu môže byť niekedy ťažké pochopiť, ktoré malé molekuly
sú skutočne prvkami skúmaných štruktúr a ktoré
boli jednoducho adsorbované na ich povrchu počas procesu uvoľňovania.
Táto situácia sťažuje presné určenie niektorých
funkčné vlastnosti vybraných objektov.

Popis prezentácie Centrifugácia. Jeho využitie v rôznych oblastiach biológie. pomocou diapozitívov

Centrifugácia. Jeho využitie v rôznych oblastiach biológie. Doplnili: Levikov, D. A.

Centrifugácia Ide o separáciu mechanických zmesí na ich zložky pôsobením odstredivej sily. Zariadenia používané na tento účel sa nazývajú centrifúgy. Hlavnou časťou odstredivky je rotor, v ktorom sú namontované hniezda pre odstredivkové skúmavky. Rotor sa otáča vysokou rýchlosťou, v dôsledku čoho vznikajú značné odstredivé sily, pod vplyvom ktorých sa oddeľujú mechanické zmesi, napríklad sa usadzujú častice suspendované v kvapaline.

Procesy prebiehajúce v centrifúge Nasledujúce procesy sa delia na centrifúgy: 1) Odstredivá filtrácia. 2) Odstredivé usadzovanie. 3) Odstredivé čírenie.

Odstredivá filtrácia Odstredivá filtrácia je proces oddeľovania suspenzií v odstredivkách s perforovanými bubnami. Vnútorný povrch takéhoto bubna je pokrytý filtračnou tkaninou. Suspenzia je vrhaná odstredivou silou smerom k stenám bubna, pričom tuhá fáza zostáva na povrchu tkaniny a kvapalina pod vplyvom odstredivej sily prechádza cez vrstvu sedimentu a tkanina je odvádzaná von cez otvory v bubne. Odstredivá filtrácia zvyčajne pozostáva z troch po sebe nasledujúcich fyzikálnych procesov: 1) filtrácia s tvorbou sedimentu; 2) zhutnenie sedimentu; 3) odstránenie kvapaliny zadržiavanej molekulárnymi silami zo sedimentu;

Odstredivá sedimentácia Odstredivá sedimentácia je proces oddeľovania suspenzií v odstredivkách s bubnami s pevnými stenami. Suspenzia sa zavádza do spodnej časti bubna a pod vplyvom odstredivej sily sa vrhá smerom k stenám. Na stenách sa vytvára vrstva sedimentu a kvapalina tvorí vnútornú vrstvu a je vytláčaná z bubna suspenziou vstupujúcou do separácie. V tomto prípade kvapalina stúpa nahor, preteká cez okraj bubna a je odstránená. V tomto prípade nastávajú dva fyzikálne procesy: 1) Depozícia tuhej fázy. 2) Zhutňovanie sedimentov.

Odstredivé čírenie Odstredivé čírenie je proces oddeľovania jemných suspenzií a koloidných roztokov. Vykonáva sa aj v pevných bubnoch. Odstredivé čírenie je vo svojej fyzikálnej podstate proces voľnej sedimentácie pevných častíc v poli odstredivých síl. V bubnoch s pevnými stenami sa oddeľujú aj emulzie. Vplyvom odstredivej sily sú zložky emulzie v súlade so svojou hustotou usporiadané vo forme ohraničených vrstiev: vonkajšia vrstva kvapaliny s vyššou hustotou a vnútorná vrstva ľahšej kvapaliny. Kvapaliny sa z bubna vypúšťajú oddelene.

V klinických a sanitárnych laboratóriách sa centrifugácia používa na oddelenie červených krviniek z krvnej plazmy, krvných zrazenín zo séra, hustých častíc z tekutej časti moču a pod. Na tento účel sa používajú buď manuálne centrifúgy alebo centrifúgy s elektrickým pohonom, rotácia ktorého rýchlosť je možné regulovať. Ultracentrifúgy, ktorých rýchlosť rotora presahuje 40 000 otáčok za minútu, sa zvyčajne používajú v experimentálnej praxi na separáciu bunkových organel, separáciu koloidných častíc, makromolekúl a polymérov.

Centrifugačná metóda v cytológii Metóda diferenciálnej centrifugácie sa používa na frakcionáciu buniek, t.j. stratifikáciu ich obsahu do frakcií v závislosti od špecifickej hmotnosti rôznych organel a bunkových inklúzií. Na tento účel sa jemne mleté ​​bunky otáčajú v špeciálnom zariadení - ultracentrifúge. V dôsledku centrifugácie sa z roztoku vyzrážajú zložky buniek usporiadané podľa ich hustoty. Hustejšie štruktúry sa ukladajú pri nižších rýchlostiach odstreďovania a menej husté štruktúry sa ukladajú pri vysokých rýchlostiach. Výsledné vrstvy sa oddelia a študujú oddelene.

Centrifugácia v botanike a fyziológii rastlín Centrifugácia umožňuje získať rôzne frakcie subcelulárnych častíc a študovať vlastnosti a funkcie každej frakcie samostatne. Napríklad chloroplasty možno izolovať z listov špenátu, zmyť z bunkových fragmentov opakovanou centrifugáciou vo vhodnom médiu a študovať ich správanie v rôznych experimentálnych podmienkach alebo určiť ich chemické zloženie. Potom pomocou rôznych modifikácií techniky je možné tieto plastidy zničiť a izolovať ich základné prvky diferenciálnou centrifugáciou (opätovná sedimentácia častíc pri rôznych hodnotách zrýchlenia). Týmto spôsobom bolo možné ukázať, že plastidy obsahujú štruktúry charakterizované veľmi usporiadanou štruktúrou - takzvané grana; Všetky grana sa nachádzajú v membráne obmedzujúcej chloroplast (chloroplastový obal). Výhody tejto metódy sú jednoducho neoceniteľné, pretože nám umožňuje identifikovať existenciu funkčných podjednotiek, ktoré sú súčasťou väčších subcelulárnych častíc; najmä pomocou metódy diferenciálneho odstreďovania bolo možné preukázať, že grana sú hlavným štruktúrnym prvkom chloroplastu.

Metóda odstreďovania vo virológii Metóda odstreďovania s gradientom hustoty Bracquet sa môže použiť na izoláciu aj na získanie kvantitatívnych charakteristík rastlinných vírusov. Ako sa ukázalo, táto metóda je plná mnohých možností a v súčasnosti je široko používaná v oblasti virológie a molekulárnej biológie. Pri vykonávaní štúdií s použitím centrifugácie v hustotnom gradiente je centrifugačná skúmavka čiastočne naplnená roztokom, ktorého hustota klesá v smere od dna k menisku. Sacharóza sa najčastejšie používa na vytvorenie gradientu pri frakcionácii rastlinných vírusov. Pred začatím centrifugácie môžu byť vírusové častice buď distribuované v celom objeme roztoku, alebo môžu byť aplikované na vrchol gradientu. Brakke navrhol tri rôzne techniky centrifugácie v hustotnom gradiente. Pri izopypickom (rovnovážnom) odstreďovaní proces pokračuje, kým všetky častice v gradiente nedosiahnu úroveň, pri ktorej sa hustota média rovná ich vlastnej hustote. K frakcionácii častíc teda v tomto prípade dochádza v súlade s rozdielmi v ich hustote. Roztoky sacharózy nie sú dostatočne husté na izopyknickú separáciu mnohých vírusov. Pri vysokorýchlostnej zónovej centrifugácii sa vírus najskôr aplikuje na vopred vytvorený gradient. Častice každého typu sedimentujú cez gradient vo forme zóny alebo pásu rýchlosťou závislou od ich veľkosti, tvaru a hustoty. Centrifugácia je dokončená, keď častice stále pokračujú v sedimentácii. Rovnovážna zónová centrifugácia je podobná vysokorýchlostnej zónovej centrifugácii, ale v tomto prípade centrifugácia pokračuje, kým sa nedosiahne izopyknálny stav. Úlohou hustotného gradientu pri vysokorýchlostnej centrifugácii je brániť konvekcii a fixovať rôzne typy molekúl v určitých zónach. Teória odstreďovania v hustotnom gradiente je zložitá a nie je úplne pochopená. V praxi ide o jednoduchú a elegantnú metódu, ktorá má široké využitie pri práci s rastlinnými vírusmi.

Ťažkosti pri použití metódy centrifugácie Použitie metódy diferenciálnej centrifugácie je spojené s mnohými metodologickými ťažkosťami. Po prvé, pri uvoľnení častíc môže dôjsť k poškodeniu ich štruktúry. Preto bolo potrebné vyvinúť špeciálne metódy na ničenie buniek, ktoré by nespôsobili poškodenie štruktúry subcelulárnych frakcií. Po druhé, keďže subcelulárne častice majú membrány, počas ich uvoľňovania môžu nastať rôzne osmotické účinky. V dôsledku toho, aby sa zabezpečilo, že ultraštruktúra skúmaných objektov nebude zničená ani počas ich izolácie, je potrebné starostlivo vybrať zloženie média, v ktorom dochádza k deštrukcii buniek a ukladaniu častíc. A napokon premytím subcelulárnych častíc (ich resuspendovaním v médiu a následnou opakovanou centrifugáciou) môže dôjsť k strate niektorých látok v nich obsiahnutých, ktoré vplyvom difúznych síl prechádzajú do roztoku. V tomto ohľade je niekedy ťažké pochopiť, ktoré z malých molekúl sú v skutočnosti prvkami skúmaných štruktúr a ktoré boli jednoducho adsorbované na ich povrchu počas procesu izolácie. Táto situácia sťažuje presné určenie niektorých funkčných vlastností vybraných objektov.

Prednáška č.5

Separácia kvapalných heterogénnych zmesí sa efektívne uskutočňuje centrifugačnou metódou, založenou na použití odstredivej sily. Zariadenia, v ktorých sa vplyvom odstredivej sily oddeľujú kvapalné heterogénne zmesi, sa nazývajú odstredivky.

Metóda odstreďovania je široko používaná v rôznych oblastiach techniky; Počet typov a prevedení centrifúg je veľmi veľký.

Hlavnou časťou odstredivky je bubon (rotor s pevnými alebo perforovanými stenami), rotujúci vysokou rýchlosťou na vertikálnom alebo horizontálnom hriadeli. Separácia heterogénnych zmesí v odstredivkách sa môže uskutočňovať buď na princípe usadzovania alebo na princípe filtrácie. V prvom prípade sa používajú bubny s pevnými stenami, v druhom - s otvormi; bubny s otvormi sú pokryté filtrom. Ak sú steny bubna pevné, potom je materiál pod vplyvom odstredivej sily usporiadaný do vrstiev podľa svojej špecifickej hmotnosti a vrstva materiálu s vysokou špecifickou hmotnosťou sa nachádza priamo pri stenách bubna. . Ak majú steny bubna otvory a sú na vnútornom povrchu vybavené filtračnou prepážkou, napríklad filtračnou tkaninou, potom pevné častice zmesi zostanú na filtračnej prepážke a kvapalná fáza prechádza cez póry tuhej látky. sedimentu a filtračnej priečky a vyberie sa z bubna. Kvapalná fáza oddelená v odstredivke sa nazýva tzv centrovať.

Odstredivá sila; separačný faktor. Keď sa bubon odstredivky a kvapalina v ňom otáčajú, odstredivá sila vzniká ako zotrvačná sila.

C=m W 2 / r (1)

m-hmotnosť rotujúceho telesa (kvapaliny) v kgf;

r - polomer otáčania v m

W - obvodová rýchlosť otáčania v m/s;

Obvodová rýchlosť otáčania je definovaná ako:

W=ω r = 2 π n r/60 (2)

n- počet otáčok za minútu;

ω-uhlová rýchlosť rotácie v radiánoch

g-gravitačné zrýchlenie v m/s 2, ak m=G/g, potom odstredivá sila S, pôsobiace na rotujúce teleso s hmotnosťou m a hmotnosťou G, sa rovná C= G(2π n r/60) 2 /rg Alebo C ≈ G n 2 r/900 (3)

Rovnica (2.3) ukazuje, že zvýšenie odstredivej sily sa ľahšie dosiahne zvýšením počtu otáčok ako zvýšením priemeru bubna. Bubny s malým priemerom s vysokým počtom otáčok dokážu vyvinúť väčšiu odstredivú silu ako bubny s veľkým priemerom s nízkym počtom otáčok.

Odstredivá sila pôsobiaca na časticu teda môže byť väčšia ako gravitačná sila toľkokrát, koľkokrát je zrýchlenie odstredivej sily väčšie ako gravitačné zrýchlenie. Pomer týchto zrýchlení je tzv separačný faktor a označuje Kr:

W 2 / r – zrýchlenie odstredivej sily.

Ak vezmeme G=1n, dostaneme: Kr=n 2 r /900

Napríklad pre odstredivku s rotorom s priemerom 1000 mm (r=0,5 m) rotujúcim rýchlosťou n=1200 ot./min bude separačný faktor 800. Separačný účinok odstredivky sa zvyšuje úmerne s hodnotou z Kp.

Hodnota K pre cyklóny je rádovo v stovkách. A pre odstredivky - asi 3000, teda hnacia sila sedimentačného procesu v cyklónoch a odstredivkách je o 2-3 rády väčšia ako v usadzovacích nádržiach. Vďaka tomu je produktivita cyklónov a odstrediviek vyššia ako produktivita usadzovacích nádrží a možno v nich efektívne oddeľovať malé častice: v odstredivkách s veľkosťou okolo 1 mikrónu. V cyklónoch - asi 10 mikrónov.

Z porovnania rovníc je zrejmé, že separačný faktor K p sa číselne rovná odstredivej sile, ktorá vzniká pri rotácii telesa s hmotnosťou 1 kg.

Charakteristika procesov odstreďovania . Ako bolo uvedené vyššie, odstreďovanie sa môže vykonávať na princípe usadzovania (v pevných sudoch) alebo na princípe filtrácie (v perforovaných sudoch). Vo svojej fyzikálnej podstate sa oba procesy od seba líšia. Okrem toho existujú samostatné varianty každého z týchto procesov, ktoré sú určené obsahom pevnej fázy a stupňom jej disperzie, ako aj fyzikálnymi vlastnosťami suspenzie.

Centrifugácia v usadzovacích bubnoch sa vykonáva na čistenie kvapalín od kontaminantov obsiahnutých v malých množstvách (čistenie kvapalín), ako aj na oddelenie suspenzií obsahujúcich značné množstvo tuhej fázy (odstreďovanie usadzovaním).

Centrifugácia v usadzovacích bubnoch vo všeobecnosti pozostáva z dvoch fyzikálnych procesov: sedimentácia tuhej fázy (proces sa riadi hydrodynamickými zákonmi) a zhutnenie sedimentu; Pre posledný uvedený proces platia základné zákony mechaniky pôdy (dispergované médiá).

Do určitého koncentračného limitu tuhej fázy (rovnajúcej sa približne 3-4 % obj.) dochádza k jej usadzovaniu v usadzovacom bubne bez vytvorenia rozhrania medzi pevnou látkou a kvapalinou. So zvyšujúcou sa koncentráciou vzniká takýto povrch v dôsledku zväčšovania a sedimentácie pevných častíc v kvapaline.

Proces odstreďovania v usadzovacích bubnoch je zásadne odlišný od procesu separácie v usadzovacích nádržiach. V druhom prípade možno rýchlosť ukladania prakticky považovať za konštantnú, pretože proces prebieha v gravitačnom poli, ktorého zrýchlenie nezávisí od súradníc padajúcej častice.

Zrýchlenie poľa odstredivých síl je premenlivá veličina a závisí pri konštantnej uhlovej rýchlosti od polomeru rotácie častice. Okrem toho siločiary odstredivého poľa nie sú navzájom rovnobežné, a preto bude smer pôsobenia odstredivých síl pre rôzne častice (neležiace na rovnakom polomere otáčania) odlišný.

Preto zákony usadzovacích procesov nemožno rozšíriť na proces odstreďovania v usadzovacích bubnoch.

Separačná kapacita usadzovacích centrifúg je charakterizovaná výkonnostným indexom (sigma) Σ, ktorý je súčinom plochy valcovej usadzovacej plochy F v rotore a separačného faktora Kp.

Σ=F Kr (1), Kr= W2/rg ≈n2 r/900, odkiaľ Σ /F=Kr (2)

Vzhľadom na to, že separačný faktor vyjadruje pomer rýchlostí usadzovania častíc v usadzovacej odstredivke a usadzovacej nádrži, v súlade s rovnosťou (2), hodnotu Σ treba považovať za rovnú ploche usadzovacej nádrže, ekvivalentnú v výkon pre danú suspenziu príslušnej centrifúgy. Výkonnostný index odráža vplyv všetkých konštrukčných prvkov zrážacej odstredivky, ktoré určujú jej separačnú schopnosť.

Pri určovaní produktivity odstrediviek na usadzovanie vsádzky je potrebné vziať do úvahy čas potrebný na spustenie, brzdenie a vyloženie odstredivky Stanovenie produktivity filtračnej odstredivky je rovnako náročné ako určenie produktivity akéhokoľvek filtra.

Ešte zložitejší je proces odstreďovania v filtračné bubny. Proces prebieha v troch etapách:

tvorba sedimentu, zhutnenie sedimentu a nakoniec odstránenie sedimentu z pórov kvapaliny zadržanej kapilárnymi a molekulárnymi silami.

V dôsledku toho nie je možné stotožniť celý proces odstredivej filtrácie s klasickou filtráciou, ku ktorej dochádza pod vplyvom gravitácie. Len jej prvá perióda je zásadne blízka klasickej filtrácii a líši sa od nej iba veľkosťou hydraulického tlaku kvapaliny pretekajúcej vrstvou sedimentu vplyvom odstredivých síl. Počas tohto obdobia je vlhkosť v sedimente vo voľnej forme a najintenzívnejšie sa z neho odstraňuje. Druhá perióda je podobná obdobnej perióde pri usadzovacej centrifugácii a napokon tretia je charakterizovaná prienikom vzduchu do zhutneného sedimentu, t.j. mechanickým vysušením sedimentu.

Trvanie vyššie uvedených období závisí od fyzikálnych vlastností a koncentrácie suspenzií, ako aj od charakteristík odstredivky.

Zložitosť a rôznorodosť procesov odstreďovania sťažuje vypracovanie teórie procesu (najmä jeho kinetiky) a presných metód na výpočet odstrediviek.

Výkon centrifúgy. Typicky sa produktivita centrifúg vyjadruje objemom suspenzie vstupujúcej do centrifúgy za jednotku času (l/hod.), alebo hmotnosť sedimentu získaného po odstredení (kg/hod).

Centrifugácia je separácia mechanických zmesí na ich zložky pôsobením odstredivej sily. Zariadenia používané na tento účel sa nazývajú centrifúgy. Hlavnou časťou odstredivky je rotor, v ktorom sú namontované hniezda pre odstredivkové skúmavky. Rotor sa otáča vysokou rýchlosťou, v dôsledku čoho vznikajú značné odstredivé sily, pod vplyvom ktorých sa oddeľujú mechanické zmesi, napríklad sa usadzujú častice suspendované v kvapaline.

Centrifúgy: 1 - ručné: 2 - elektricky poháňané.

V klinických a sanitárnych laboratóriách sa centrifugácia používa na oddelenie z krvnej plazmy, od, hustých častíc z tekutej časti moču a pod. Na tento účel sa používajú buď manuálne odstredivky (obr. 1), alebo elektricky poháňané odstredivky, rotácia ktorých rýchlosť je možné regulovať (obr., 2).

Ultracentrifúgy, ktorých otáčky rotora presahujú 40 000 ot./min., sa v experimentálnej praxi zvyčajne používajú na separáciu bunkových organel, separáciu koloidných častíc, makromolekúl atď.

Centrifugácia je oddeľovanie hrubých systémov pozostávajúcich z kvapalných a pevných zložiek s rôznou hustotou pomocou špeciálnych zariadení nazývaných centrifúgy. Princíp činnosti odstredivky je založený na vytvorení veľkej odstredivej sily, pod vplyvom ktorej sa rýchlosť oddeľovania zložiek zmesi umiestnenej v odstredivke mnohonásobne zvyšuje v porovnaní s rýchlosťou ich oddeľovania pod vplyvom gravitácie.

Metóda odstreďovania je široko používaná v biológii, medicíne a technológii, pričom často nahrádza procesy filtrovania, usadzovania a stláčania.

Odstredivka má kryt, pohonný mechanizmus, rotor, pracovnú (uzavieraciu) komoru a ovládací panel. Niektoré odstredivky sú vybavené elektrickými hodinami, ktoré zabezpečujú automatické vypnutie a brzdenie v rozsahu od 5 do 60 minút. Špeciálne centrifúgy majú chladiace a vákuové jednotky s monitorovacím a automatickým riadiacim zariadením. Hlavnou časťou každej odstredivky je rotor (v laboratórnych odstredivkách býva umiestnený na zvisle uloženom hriadeli elektromotora alebo sa otáča cez rôzne prevody z hriadeľa motora, niekedy aj ručne). Rotor odstredivky je disk (kríž) s kĺbovými objímkami pre kovové puzdrá, v ktorých sú umiestnené skúmavky, ktoré pri otáčaní zaujmú vodorovnú polohu.

Niekedy je rotor vyrobený vo forme pevného kovového zrezaného kužeľa s bunkami pre skúmavky (uhlový rotor); rúrky v ňom sú umiestnené v konštantnom uhle k osi otáčania (zvyčajne 40 °). Keď sú rúrky naklonené, zložky zmesi sa oddeľujú rýchlejšie. Zmes sa rozdelí do skúmaviek rôznych tvarov a objemov (obr. 1). Pri práci pri vysokých rýchlostiach sa používajú polyetylénové skúmavky, pretože sklenené skúmavky prasknú. Rúry so spracovávaným materiálom umiestnené v rotore, jedna proti druhej, musia byť vyvážené. To zaisťuje rovnomerné zaťaženie hriadeľa rotora a zabezpečuje rovnomerné otáčanie hriadeľa odstredivky. Na vyváženie skúmaviek sa používajú špeciálne váhy (obr. 2).

Ryža. 1. Odstredivé skúmavky.

Ryža. 2. Odstredivé váhy.

Odstredivky používané v priemysle sa od laboratórnych líšia zložitejšou konštrukciou rotora, ktorá umožňuje odstreďovanie veľkého množstva materiálu súčasne alebo kontinuálne separačné procesy.

Centrifúgy s nízkou rýchlosťou rotora sa používajú v medicíne na separáciu močových sedimentov, krvného séra od zrazenín, sedimentáciu červených krviniek, na sérologické štúdie atď.

Mikrocentrifúga (obr. 4) je ovládaná ručne; vybavený dvoma vymeniteľnými nástavcami, z ktorých jeden má objímky pre mikroskúmavky a používa sa na stanovenie krvnej kompatibility; druhý - s hrdlom na vloženie odmernej mikropipety (hematokrit) - je určený na stanovenie percenta krviniek.

Ryža. 3. Ručná odstredivka.

Ryža. 4. Mikrocentrifúga.

Manuálna odstredivka (obr. 3) má štyri kovové alebo plastové návleky na 15 ml skúmavky.

Laboratórna klinická centrifúga TsLK-1 (obr. 5, 7) má tri rýchlosti otáčania (1000, 1500, 3000 ot./min.). Priečka rotora je prispôsobená pre 12 bežných odstredivkových skúmaviek. Najväčší objem odstredenej kvapaliny je 150 ml.

Centrifúgy s vysokými otáčkami rotora sú vo väčšine prípadov vybavené vymeniteľnými rotormi určenými pre rôzne objemy kvapaliny a používajú sa na oddeľovanie jemných suspenzií.

Laboratórna stolná centrifúga TsLN-2 (obr. 5, 2) má uhlový rotor pre šesť krátkych skúmaviek s celkovou kapacitou 72 ml. Maximálna rýchlosť otáčania -9000 ot./min.

Ryža. 5. Rôzne laboratórne centrifúgy: 1 - klinické; 2 - stolová doska; 3 - rohový malý; 4 - stacionárne; 5 - chladené.

Uhlová malá odstredivka TsUM-1 (obr. 5, 3) má tri vymeniteľné uhlové rotory s rôznym počtom skúmaviek a hematokritom: rotor na 6 skúmaviek s celkovou kapacitou 150 ml, rotor na 10 skúmaviek s celkovým objem 120 ml, rotor pre 24 skúmaviek s celkovou kapacitou 120 ml, hematokrit pre dve kapiláry. Maximálna rýchlosť otáčania je 10 000 ot./min.

Centrifúga je vybavená elektrickým hodinovým mechanizmom.

Laboratórna stacionárna odstredivka TsLS-2 (obr. 5, 4) má dva vymeniteľné rotory. Krížový rotor je vybavený štyrmi oceľovými objímkami s objemom 500 ml a štyrmi sklenenými trubicami s objemom 250 ml. Uhlový rotor je vybavený 8 polyetylénovými a oceľovými trubicami s objemom 50-75 ml. Maximálne otáčky rotora sú až 6000 ot./min. Centrifúga je vybavená elektrickým hodinovým mechanizmom.

Medzi špeciálne centrifúgy patrí laboratórna chladená centrifúga TsLR-1 (obr. 5.5), určená na odstreďovanie pri nízkych teplotách (-5° a viac) rôznych látok, ktoré sa menia aj pri izbovej teplote - väčšinou sú to proteínové suspenzie. Odstredivka má tri vymeniteľné rotory, ktoré poskytujú rôzne režimy odstreďovania. Dva rotory sú zhodné s technickými charakteristikami rotorov odstredivky typu TsLS-2, tretí rotor, namontovaný na prídavnej osi, vyvíja 18 000 - 18 500 ot./min. Maximálny objem študovaného lieku je 48 ml. Centrifúga je vybavená elektrickým hodinovým mechanizmom. Pracovná komora je chladená pomocou chladiaceho stroja.

Pozri tiež Ultracentrifugácia.

Kurzy

Centrifugácia

1. Princíp metódy

Separácia látok pomocou centrifugácie je založená na rozdielnom správaní častíc v odstredivom poli. Suspenzia častíc umiestnená v skúmavke sa vloží do rotora namontovaného na hnacom hriadeli odstredivky.

V odstredivom poli sa častice s rôznymi hustotami, tvarmi alebo veľkosťami usadzujú rôznymi rýchlosťami. Rýchlosť sedimentácie závisí ododstredivé zrýchleniepriamo úmerné uhlovej rýchlosti rotora a vzdialenosti medzi časticou a osou rotácie:

a odstredivé zrýchlenie bude potom rovnaké)

Od jednej otáčky rotora je2p radiánov, uhlovú rýchlosť rotora v otáčkach za minútu možno zapísať takto:

Odstredivé zrýchlenie sa zvyčajne vyjadruje v jednotkáchg a volá sarelatívne odstredivé zrýchlenie , t.j.

alebo

Pri uvádzaní podmienok separácie častíc uveďte rýchlosť otáčania a polomer rotora, ako aj čas odstreďovania. Odstredivé zrýchlenie sa zvyčajne vyjadruje v jednotkáchg , vypočítané z priemerného polomeru otáčania stĺpca kvapalinyVcentrifugačná skúmavka. Dole a Kotzias na základe rovnice zostavili nomogram vyjadrujúci závislosť OCP od rýchlosti otáčania rotora a polomeru r.

Ryža. 2 .1. Nomogram na výpočet odstredivého zrýchlenia.

Na určenie O spojte hodnoty polomeru a rýchlosti otáčania rotora na extrémnych mierkach s priamkou; priesečník tejto priamky s priemernou stupnicou udáva požadovanú hodnotu odstredivého zrýchlenia. Upozorňujeme, že pravý stĺpec čísel na stupnici O zodpovedá pravému stĺpcu čísel na stupnici otáčok rotora; vľavo - vľavo.

Rýchlosť sedimentácie guľovitých častíc závisí nielen od odstredivého zrýchlenia, ale aj od hustoty a polomeru samotných častíc a od viskozity suspenzného média. Čas potrebný na sedimentáciu guľovej častice v kvapalnom médiu z tekutého menisku na dno centrifugačnej skúmavky je nepriamo úmerný rýchlosti sedimentácie a je určený nasledujúcou rovnicou:

Kdet - čas sedimentácie v sekundách,rj- viskozita média,Gh- polomer častice, strh- hustota častíc, p - stredná hustota, gm- vzdialenosť od osi otáčania k menisku tekutiny, gd- vzdialenosť od osi otáčania po dno skúmavky.

Ako vyplýva z rovnice, pri danej rýchlosti rotora je čas potrebný na usadenie homogénnych guľových častíc nepriamo úmerný druhej mocnine ich polomerov a rozdielu hustôt častíc a média a je priamo úmerný viskozite stredná. Preto sa zmes heterogénnych, približne guľovitých častíc, líšiacich sa hustotou a veľkosťou, môže oddeliť buď v dôsledku rôznych časov ich ukladania na dno skúmavky pri danom zrýchlení, alebo v dôsledku distribúcie sedimentujúcich častíc pozdĺž skúmavka, založená po určitom čase. Pri oddeľovaní látok je potrebné brať do úvahy také dôležité faktory, ako je hustota a viskozita média. Pomocou opísaných metód je možné oddeliť bunkové organely z tkanivových homogenátov. Hlavné zložky bunky sú uložené v nasledujúcom poradí: najprv celé bunky a ich fragmenty, potom jadrá, chloroplasty, mitochondrie, lyzozómy, mikrozómy a nakoniec ribozómy. Usádzanie nesférických častíc sa neriadi rovnicou, takže častice rovnakej hmotnosti, ale rôznych tvarov sa usadzujú rôznymi rýchlosťami. Táto vlastnosť sa používa pri štúdiu konformácie makromolekúl pomocou ultracentrifugácie.

pozostáva z izolácie biologického materiálu pre následné biochemické štúdie. V tomto prípade je možné odobrať veľké množstvá počiatočného biologického materiálu, napríklad naočkovanie mikrobiálnych buniek zo vsádzkových alebo kontinuálnych kultúr, ako aj naočkovanie rastlinných a živočíšnych buniek z tkanivových kultúr a krvnej plazmy. Pomocou preparatívnej centrifugácie sa izoluje veľké množstvo bunkových častíc, aby sa študovala ich morfológia, štruktúra a biologická aktivita. Metóda sa tiež používa na izoláciu biologických makromolekúl, ako je DNA a proteíny, z vopred purifikovaných prípravkov.

Analytická centrifugácia používa sa predovšetkým na štúdium čistých alebo v podstate čistých prípravkov makromolekúl alebo častíc, ako sú ribozómy. V tomto prípade sa používa malé množstvo materiálu a sedimentácia skúmaných častíc sa nepretržite zaznamenáva pomocou špeciálnych optických systémov. Metóda umožňuje získať údaje o čistote, molekulovej hmotnosti a štruktúre materiálu. Na workshopoch pre študentov sa preparatívna centrifugácia používa oveľa častejšie ako analytická, preto sa jej budeme venovať podrobnejšie, hoci obe metódy sú založené na všeobecných princípoch.

2. Preparatívna centrifugácia

2 .1 Diferenciálne odstreďovanie

Táto metóda je založená na rozdieloch v rýchlostiach sedimentácie častíc, ktoré sa líšia veľkosťou a hustotou. Materiál, ktorý sa má oddeliť, napríklad tkanivový homogenát, sa odstreďuje s postupným zvyšovaním odstredivého zrýchlenia, ktoré sa volí tak, že v každom stupni sa určitá frakcia usadí na dne skúmavky. Na konci každého kroku sa zrazenina oddelí od supernatantu a niekoľkokrát sa premyje, aby sa nakoniec získala čistá frakcia zrazeniny. Bohužiaľ je takmer nemožné získať absolútne čistý sediment; Aby sme pochopili, prečo sa to deje, pozrime sa na proces, ktorý sa vyskytuje v centrifugačnej skúmavke na začiatku každej fázy centrifugácie.

Najskôr sú všetky častice homogenátu rovnomerne rozložené v celom objeme centrifugačnej skúmavky, takže nie je možné získať čisté prípravky sedimentov najťažších častíc v jednom cykle centrifugácie: prvý vytvorený sediment obsahuje najmä najťažšie častice, ale navyše , tiež určité množstvo všetkých pôvodných komponentov. Dostatočne čistý prípravok ťažkých častíc možno získať len resuspendovaním a odstredením pôvodného sedimentu. Ďalšie odstreďovanie supernatantu s následným zvýšením odstredivého zrýchlenia vedie k sedimentácii častíc strednej veľkosti a hustoty a následne k sedimentácii najmenších častíc s najnižšou hustotou. Na obr. Obrázok 2.3 ukazuje diagram frakcionácie homogenátu pečene potkana.

Ryža. 2.2. Diferenciálna centrifugácia suspenzie častíc v odstredivom poli.

Najprv sa častice rovnomerne rozložia po celom objeme centrifugačnej skúmavky (A): Počas odstreďovania častice sedimentujú podľa ich veľkosti a tvaru (b - d).

Ryža. 2.3. Schéma frakcionácie homogenátu pečene potkana na subcelulárne frakcie.

Diferenciálna centrifugácia je pravdepodobne najbežnejšou metódou izolácie bunkových organel z tkanivových homogenátov. Táto metóda sa najúspešnejšie používa na oddelenie bunkových organel, ktoré sa navzájom výrazne líšia veľkosťou a hustotou. Ale ani v tomto prípade nie sú výsledné frakcie nikdy absolútne homogénne a na ich ďalšiu separáciu sa používajú iné metódy popísané nižšie. Tieto metódy, založené na rozdieloch v hustote organel, poskytujú efektívnejšie separácie vykonávaním centrifugácie v roztokoch s kontinuálnym alebo stupňovitým gradientom hustoty. Nevýhodou týchto metód je, že získanie gradientu hustoty roztoku si vyžaduje čas.

2.2 Odstreďovanie pri zónovej rýchlosti

Metóda zónovej rýchlosti, alebo, ako sa tiež nazýva,s-zonálna centrifugácia pozostáva z vrstvenia testovanej vzorky na povrch roztoku s kontinuálnym hustotným gradientom. Vzorka sa potom odstreďuje, kým sa častice nerozdelia pozdĺž gradientu v diskrétnych zónach alebo pásoch. Vytvorením gradientu hustoty sa zabráni zmiešaniu zón, ktoré sú výsledkom konvekcie. Metóda centrifugácie v zóne rýchlosti sa používa na oddelenie hybridov RNA-DNA, ribozomálnych podjednotiek a iných bunkových zložiek.

Ryža. 2 .4. Rýchlosť a izopyknálna separácia častíc v hustotnom gradiente. Pred začatím odstreďovania sa suspenzia častíc navrství na gradient hustoty kvapaliny (A). Pri vysokorýchlostnom odstreďovaní častice nedosiahnu izopyknický bod a pri izopyknálnej separácii sa v odstreďovaní pokračuje, kým študované častice nedosiahnu zónu s vhodnou hustotou. (b).

2.3 Izopyknické odstreďovanie

Izopyknické odstreďovanie sa uskutočňuje v hustotnom gradiente aj obvyklým spôsobom. Ak sa odstreďovanie neuskutočňuje v hustotnom gradiente, prípravok sa najskôr odstredí tak, aby sa usadili častice, ktorých molekulová hmotnosť je väčšia ako molekulová hmotnosť skúmaných častíc. Tieto ťažké častice sa odstránia a vzorka sa suspenduje v médiu, ktorého hustota je rovnaká ako hustota frakcie, ktorá sa má izolovať, a potom sa odstreďuje, kým sa príslušné častice neusadia na dne skúmavky a častice s nižšou hustotou plávajú na povrch kvapaliny..

Ryža. 2.5. Izopyknálna separácia bez hustotného gradientu.

Pred centrifugáciou sa častice rovnomerne rozložia po celom objeme centrifugačnej skúmavky (A). Po odstredení ľahšie častice plávajú nahor, zatiaľ čo ťažšie častice sa usadzujú na dne skúmavky (b)

Ďalšou metódou je navrstvenie vzorky na povrch roztoku s kontinuálnym hustotným gradientom pokrývajúcim rozsah hustôt všetkých zložiek zmesi. Odstreďovanie sa uskutočňuje dovtedy, kým sa hustota častíc nerovná hustote zodpovedajúcich zón, t.j. kým sa častice nerozdelia do zón. Metóda sa nazýva zonálna izopyknálna alebo rezonančná centrifugácia, pretože hlavným bodom je tu vztlaková hustota a nie veľkosť alebo tvar častíc. Hustota, pri ktorej častice tvoria izopyknické pásy, je ovplyvnená povahou suspenzného média; častice môžu byť priepustné pre niektoré zlúčeniny v roztoku a nepriepustné pre iné, alebo môžu pripájať molekuly roztoku. Pri použití zonálneho rotora sa mitochondrie, lyzozómy, peroxizómy a mikrozómy koncentrujú v pásoch so 42 %, 47 %, 47 % a 27 % sacharózy, čo zodpovedá hustotám 1,18, 1,21, 1,21 a 1,10 g-cm-3 resp. Hustota subcelulárnych organel závisí aj od ich selektívnej absorpcie určitých zlúčenín. Podávanie nehemolytického detergentu Triton potkanomWR-1339 vedie k zvýšeniu veľkosti a zníženiu hustoty pečeňových lyzozómov; hustota mitochondrií a peroxizómov zostáva nezmenená. Napriek tomu, že sedimentačné vlastnosti lyzozómov sa spravidla nemenia, ich rovnovážna hustota v sacharózovom gradiente klesá z 1,21 na 1,1, čo vedie k zodpovedajúcej separácii lyzozomálno-peroxizomálnej frakcie. Táto vlastnosť sa využíva pri kvantitatívnej separácii lyzozómov, mitochondrií a peroxizómov, založenej na odstránení z homogénneho média všetkých častíc s hustotou väčšou ako je hustota mikrozómov a následnej izopyknálnej centrifugácii vyzrážaných ťažkých častíc.

2.4 Odstreďovanie s gradientom rovnovážnej hustoty

Na vytvorenie hustotného gradientu sa používajú soli ťažkých kovov, ako je rubídium alebo cézium, ako aj roztoky sacharózy. Vzorka, napríklad DNA, sa zmieša s koncentrovaným roztokom chloridu cézneho. Rozpustená látka aj rozpúšťadlo sú na začiatku rovnomerne distribuované v celom objeme. Počas odstreďovania sa ustanoví rovnovážna distribúcia koncentrácie, a teda aj hustotyCsCl, keďže cézne ióny majú veľkú hmotnosť. Vplyvom odstredivého zrýchlenia dochádza k redistribúcii molekúl DNA, ktoré sa zhromažďujú vo forme oddelenej zóny v časti skúmavky so zodpovedajúcou hustotou. Metóda sa používa predovšetkým pri analytickej centrifugácii a použili ju Meselson a Stahl na štúdium mechanizmu replikácie DNAE. coli . Odstreďovanie s rovnovážnym hustotným gradientom je tiež jednou z metód separácie a štúdia lipoproteínov z ľudskej krvnej plazmy.

2. 5 Generovanie a extrahovanie gradientov

2.5.1 Povaha gradientov

Na vytvorenie hustotných gradientov v roztokoch sa najčastejšie používajú roztoky sacharózy, niekedy s pevným pH. V niektorých prípadoch sa dosiahne dobré oddelenie, keď sa použije namiesto obyčajnej vodyD2 0. V tabuľke. V tabuľke 2.1 sú uvedené vlastnosti niektorých roztokov sacharózy.

Koncentrácia, %

Vlastnosti roztokov sacharózy

Voľba gradientu je daná špecifickými cieľmi frakcionácie. Napríklad ficol, ktorý vyrába spolPharmacia Dobre Chemikálie, môže nahradiť sacharózu v prípadoch, keď je potrebné vytvoriť gradienty s vysokou hustotou a nízkym osmotickým tlakom. Ďalšou výhodou Fica je, že neprechádza cez bunkové membrány. Na vytvorenie gradientov vyššej hustoty sa však používajú soli ťažkých kovov, ako je rubídium a cézium, avšak kvôli korozívnemu účinku.CsCltakéto gradienty sa používajú iba v rotoroch vyrobených z odolných kovov, ako je titán“

2.5.2 Metóda vytvárania stupňovitého gradientu hustoty

Na vytvorenie hustotného gradientu sa do centrifugačnej skúmavky opatrne napipetuje niekoľko roztokov s postupne klesajúcou hustotou. Potom sa vzorka navrství na najvrchnejšiu vrstvu, ktorá má najnižšiu hustotu, vo forme úzkej zóny, a potom sa skúmavka odstredí. Hladké lineárne gradienty možno získať vyhladzovaním stupňovitých gradientov, keď roztok dlho sedí. Proces je možné urýchliť jemným premiešaním obsahu skúmavky drôtom alebo jemným potrasením skúmavky.

2.5.3 Metóda na vytvorenie hladkého gradientu hustoty

Vo väčšine prípadov sa na vytvorenie hladkého gradientu hustoty používa špeciálne zariadenie. Skladá sa z dvoch valcových nádob presne definovaného identického priemeru, ktoré spolu na dne komunikujú pomocou sklenenej trubice s regulačným ventilom, čo umožňuje regulovať pomery, v ktorých sa obsah oboch nádob mieša. Jedna z nich je vybavená miešadlom a má výstup, ktorým roztok prúdi do centrifugačných skúmaviek. Hustší roztok sa umiestni do mixéra; druhý valec je naplnený roztokom nižšej hustoty. Výška kolóny roztoku v oboch valcoch je nastavená tak, aby hydrostatický tlak v nich bol rovnaký. Hustší roztok sa postupne uvoľňuje z miešačky do centrifugačných skúmaviek a súčasne sa nahrádza rovnakým objemom roztoku nižšej hustoty vstupujúcim do miešačky z druhého valca cez regulačný ventil. Homogenita roztoku v miešačke sa zaisťuje neustálym miešaním roztoku pomocou miešadla. Keď sa roztok naleje do centrifugačných skúmaviek, jeho hustota sa zníži a v skúmavkách sa vytvorí lineárny gradient hustoty. Nelineárne gradienty môžu byť vytvorené pomocou systému pozostávajúceho z dvoch valcov nerovnakého priemeru.

Na vytváranie hustotných gradientov rôznej strmosti sa používa systém dvoch mechanicky ovládaných striekačiek, ktoré sú naplnené roztokmi s nerovnakou hustotou. Zmenou relatívnej rýchlosti piestov možno vytvoriť rôzne gradienty.

2.5.4 Odstránenie gradientov z centrifugačných skúmaviek

Po dokončení odstreďovania a separácie častíc sa musia výsledné zóny odstrániť. To sa deje niekoľkými spôsobmi, najčastejšie posunom. Odstredivková skúmavka sa prepichne na dne a do jej spodnej časti sa pomaly zavedie veľmi husté médium, napríklad 60-70% roztok sacharózy. Roztok na vrchu sa premiestni a frakcie sa odoberú pomocou injekčnej striekačky, pipety alebo špeciálneho zariadenia pripojeného cez hadičku k zberaču frakcií. Ak sú rúrky vyrobené z celuloidu alebo nitrocelulózy, frakcie sa odstránia rozrezaním rúrky špeciálnou čepeľou. Za týmto účelom sa odstredivková skúmavka upevnená v stojane nareže priamo pod požadovanú oblasť a frakcia sa odsaje injekčnou striekačkou alebo pipetou. Pri vhodnej konštrukcii rezacieho zariadenia budú straty roztoku minimálne. Frakcie sa zbierajú aj prepichnutím základne skúmavky tenkou dutou ihlou. Kvapky vytekajúce z trubice cez ihlu sa zbierajú v zberači frakcií na ďalšiu analýzu.

2.5.5 Preparatívne centrifúgy a ich aplikácie

Preparatívne centrifúgy možno rozdeliť do troch hlavných skupín: centrifúgy na všeobecné použitie, vysokorýchlostné centrifúgy a preparatívne ultracentrifúgy.Odstredivky na všeobecné použitie dajte maximálnu rýchlosť 6000 ot./min-1 a OCU do 6000g . Líšia sa od seba iba kapacitou a majú množstvo vymeniteľných rotorov: hranatých a so závesnými pohárikmi. Jednou z vlastností tohto typu odstredivky je jej veľká kapacita – od 4 do 6 dm3 , ktorá umožňuje ich naplnenie nielen centrifugačnými skúmavkami 10,50 a 100 cm3 , ale aj nádoby s objemom do 1,25 dm3 . Vo všetkých odstredivkách tohto typu sú rotory pevne namontované na hnacom hriadeli a skúmavky odstredivky spolu s ich obsahom musia byť starostlivo vyvážené a ich hmotnosť sa nesmie líšiť o viac ako 0,25 g naložené do rotora, a ak rotor nie je plne zaťažený, rúrky by mali byť umiestnené symetricky, jedna proti druhej, čím sa zabezpečí rovnomerné rozloženie rúrok vzhľadom na os otáčania rotora.

Vysokorýchlostné odstredivky uveďte maximálnu rýchlosť 25 000 ot./min-1 a OCU do 89 000g. Komora rotora je vybavená chladiacim systémom, ktorý zabraňuje teplu, ktoré vzniká v dôsledku trenia pri otáčaní rotora. Typicky majú vysokorýchlostné odstredivky kapacitu 1,5 dm33 a sú vybavené vymeniteľnými rotormi, ako hranatými, tak aj závesnými miskami.

Preparatívne ultracentrifúgy dávajú maximálnu rýchlosť až 75 000 ot./min-1 a maximálne odstredivé zrýchlenie 510 000g . Sú vybavené chladničkou aj vákuovou jednotkou, aby sa zabránilo prehriatiu rotora v dôsledku trenia o vzduch. Rotory takýchto centrifúg sú vyrobené z vysokopevnostného hliníka alebo zliatin titánu. Používajú sa hlavne rotory vyrobené z hliníkových zliatin, ale v prípadoch, kde sa vyžadujú obzvlášť vysoké otáčky, sa používajú rotory vyrobené z titánu. Na zníženie vibrácií spôsobených nevyváženosťou rotora v dôsledku nerovnomerného plnenia centrifugačných skúmaviek majú ultracentrifúgy ohybný hriadeľ. Skúmavky centrifúgy a ich obsah musia byť starostlivo vyvážené s presnosťou na 0,1 g. Podobné požiadavky sa musia dodržiavať aj pri plnení rotorov centrifúg na všeobecné použitie.

2.6 Konštrukcia rotora

2.6.1 Uhlové rotory a rotory so zavesenými miskami

Rotory prípravných odstrediviek sú zvyčajne dvoch typov - hranaté a so závesnými miskami. Nazývajú sa uhlové, pretože odstredivkové trubice v nich umiestnené sú vždy v určitom uhle k osi otáčania. V rotoroch so závesnými kadičkami sú skúmavky inštalované vertikálne a pri otáčaní pôsobením výslednej odstredivej sily sa pohybujú do horizontálnej polohy; uhol sklonu k osi otáčania je 90°.

V pravouhlých rotoroch je vzdialenosť, ktorú prejdú častice k zodpovedajúcej stene skúmavky, veľmi malá, a preto k sedimentácii dochádza pomerne rýchlo. Po zrážke so stenami skúmavky častice skĺznu dolu a na dne vytvoria sediment. Pri odstreďovaní vznikajú konvekčné prúdy, ktoré značne komplikujú separáciu častíc s podobnými sedimentačnými vlastnosťami. Napriek tomu sa rotory podobnej konštrukcie úspešne používajú na separáciu častíc, ktorých rýchlosť sedimentácie sa značne líši.

V rotoroch so zavesenými pohármi sa tiež pozorujú konvekčné javy, ale nie sú také výrazné. Konvekcia je výsledkom skutočnosti, že pod vplyvom odstredivého zrýchlenia sa častice usadzujú v smere, ktorý nie je striktne kolmý na os rotácie, a preto, ako pri uhlových rotoroch, narážajú na steny skúmavky a skĺznu k dno.

Konvekčným a vírovým efektom je možné do určitej miery zabrániť použitím sektorových rúrok v závesných rotoroch misy a nastavením rýchlosti rotora; Metóda odstreďovania s hustotným gradientom tiež nemá nevýhody uvedené vyššie.

2.6.2 Priebežné rotory

Kontinuálne rotory sú určené na vysokorýchlostnú frakcionáciu relatívne malých množstiev pevného materiálu z veľkoobjemových suspenzií, napríklad na izoláciu buniek z kultivačných médií. Počas odstreďovania sa do rotora kontinuálne pridáva suspenzia častíc; Kapacita rotora závisí od charakteru ukladaného produktu a pohybuje sa od 100 cm3 do 1 dm3 za 1 min. Zvláštnosťou rotora je, že ide o izolovanú komoru špeciálnej konštrukcie; jeho obsah nekomunikuje s vonkajším prostredím, a preto sa neznečisťuje ani nerozptyľuje.

2.6.3 Zónové rotory alebo Andersonove rotory

Ryža. 2 .6. Stupne odstreďovania (a- e) v zónovom rotore

Zonálne rotory sú vyrobené z hliníka alebo zliatin titánu, ktoré sú schopné odolávať veľmi významným odstredivým zrýchleniam. Zvyčajne majú valcovú dutinu, ktorá je uzavretá odnímateľným vekom. Vo vnútri dutiny je na osi otáčania axiálna rúrka, na ktorej je umiestnená tryska s lopatkami, ktorá rozdeľuje dutinu rotora na štyri sektory. Lopatky alebo usmerňovače majú radiálne kanály, cez ktoré je vytláčaný gradient od axiálnej rúrky k obvodu rotora. Vďaka tomuto dizajnu lopatiek je konvekcia znížená na minimum.

Rotor sa naplní, keď sa otáča rýchlosťou asi 3000 ot./min-1 . Do rotora sa čerpá vopred vytvorený gradient, počínajúc vrstvou s najnižšou hustotou, ktorá je rovnomerne rozložená po obvode rotora a je udržiavaná na jeho vonkajšej stene kolmej na os otáčania v dôsledku odstredivej sily.. Keď sa následne pridávajú gradientové vrstvy s vyššou hustotou, dochádza k kontinuálnemu posunu smerom k stredu vrstiev s nižšou hustotou. Po načerpaní celého gradientu do rotora sa rotor naplní do svojho plného objemu roztokom nazývaným „vankúš“, ktorého hustota zodpovedá alebo mierne presahuje najvyššiu hustotu vopred vytvoreného gradientu.

Potom sa cez axiálnu trubicu navrství skúšobná vzorka, ktorý je vytlačený z rúrky do objemu rotora pomocou roztoku s nižšou hustotou, v tomto prípade sa rovnaký objem „vankúšika“ odstráni z periférie. Po všetkých týchto postupoch sa rýchlosť otáčania rotora upraví na prevádzkovú rýchlosť a počas požadovaného časového obdobia sa vykonáva buď zonálna rýchlosť alebo zonálna izopyknálna frakcionácia.. Extrakcia frakcií sa uskutočňuje pri rýchlosti rotora 3000 ot./min-1 . Obsah rotora sa premiestni pridaním „vankúše“ z okraja, najskôr sa premiestnia menej husté vrstvy. Vďaka špeciálnej konštrukcii axiálneho kanála Andersonovho rotora nedochádza k miešaniu zón pri ich premiestnení. Výstupný gradient prechádza cez záznamové zariadenie, napríklad kyvetu spektrofotometra, pomocou ktorej je možné stanoviť obsah proteínu absorbanciou pri 280 nm, alebo cez špeciálny detektor rádioaktivity, po ktorom sa zbierajú frakcie.

Kapacita zónových rotorov používaných pri stredných rýchlostiach sa pohybuje od 650 do 1600 cm3 , čo umožňuje získať pomerne veľké množstvo materiálu. Zónové rotory sa používajú na odstránenie proteínových nečistôt z rôznych prípravkov a na izoláciu a čistenie mitochondrií, lyzozómov, polyzómov a proteínov.

2.6.4 Analýza subcelulárnych frakcií

Vlastnosti subcelulárnych častíc získaných pri frakcionácii liečiva možno pripísať vlastnostiam samotných častíc iba vtedy, ak liečivo neobsahuje nečistoty. Preto je vždy potrebné hodnotiť čistotu výsledných prípravkov. Účinnosť homogenizácie a prítomnosť nečistôt v prípravku možno určiť pomocou mikroskopického vyšetrenia. Neprítomnosť viditeľných nečistôt však zatiaľ nie je spoľahlivým dôkazom čistoty lieku. Na kvantifikáciu čistoty sa výsledný prípravok podrobí chemickej analýze, ktorá umožňuje určiť obsah proteínu alebo DNA, prípadne enzymatickú aktivitu a imunologické vlastnosti.

Analýza distribúcie enzýmov vo frakcionovaných tkanivách je založená na dvoch všeobecných princípoch. Prvým z nich je, že všetky častice danej subcelulárnej populácie obsahujú rovnakú sadu enzýmov. Druhý predpokladá, že každý enzým je lokalizovaný na špecifickom mieste v bunke. Ak by bola táto poloha pravdivá, potom by enzýmy mohli pôsobiť ako markery pre zodpovedajúce organely: napríklad cytochrómoxidáza a monoaminooxidáza by slúžili ako markerové enzýmy pre mitochondrie, kyslé hydrolázy ako markery pre lyzozómy, kataláza ako marker pre peroxizómy a glukóza- 6-fosfatáza - marker mikrozomálnych membrán. Ukázalo sa však, že niektoré enzýmy, ako je malátdehydrogenáza,R -glukuronidáza, NADP'H-cytochróm c-reduktáza, sú lokalizované vo viac ako jednej frakcii. Preto by sa k výberu enzýmových markerov pre subcelulárne frakcie v každom konkrétnom prípade malo pristupovať veľmi opatrne. Okrem toho neprítomnosť markerového enzýmu neznamená absenciu zodpovedajúcich organel. Je pravdepodobné, že počas frakcionácie sa enzým stráca z organel alebo je inhibovaný alebo inaktivovaný; preto sa pre každú frakciu zvyčajne stanovujú aspoň dva markerové enzýmy.

Zlomok

2.7 Frakcionácia diferenciálnym odstreďovaním

2.7.1 Prezentácia výsledkov

Výsledky získané z frakcionácie tkaniva sú najvhodnejšie prezentované vo forme grafov. Pri štúdiu distribúcie enzýmov v tkanivách sa teda údaje najlepšie prezentujú vo forme histogramov, ktoré umožňujú vizuálne vyhodnotiť výsledky experimentov.

Obsah proteínu enzymatickej aktivity vo vzorke sa stanovuje tak v pôvodnom homogenáte, ako aj v každej izolovanej subcelulárnej frakcii samostatne. Celková enzymatická aktivita a obsah bielkovín vo frakciách by sa nemali výrazne líšiť od zodpovedajúcich hodnôt v pôvodnom homogenáte.

Potom sa vypočíta enzymatická aktivita a obsah bielkovín v každej frakcii ako percento z celkového výťažku, na základe čoho sa zostaví histogram. Relatívne množstvo proteínu v každej frakcii v poradí ich izolácie je postupne vynesené pozdĺž osi x a relatívna špecifická aktivita každej frakcie je vynesená pozdĺž osi y. Enzymatická aktivita každej frakcie je teda určená plochou stĺpcov.

2.7.2 Analytická ultracentrifugácia

Na rozdiel od preparatívnej centrifugácie, ktorej účelom je separácia látok a ich čistenie, analytická ultracentrifugácia sa používa najmä na štúdium sedimentačných vlastností biologických makromolekúl a iných štruktúr. Preto sa pri analytickej centrifugácii používajú rotory a záznamové systémy špeciálnej konštrukcie: umožňujú nepretržité monitorovanie sedimentácie materiáluV odstredivé pole.

Analytické ultracentrifúgy môžu dosahovať rýchlosť až 70 000 otáčok za minútu -1 , čím vzniká odstredivé zrýchlenie až 500 000g . Ich rotor má spravidla tvar elipsoidu a je cez reťazec pripojený k motoru, čo umožňuje meniť rýchlosť otáčania rotora. Rotor sa otáča vo vákuovej komore vybavenej chladiacim zariadením a má dve bunky, analytickú a vyvažovaciu, ktoré sú v centrifúge inštalované striktne vertikálne, rovnobežne s osou otáčania. Vyvažovacia bunka slúži na vyváženie analytickej bunky a je to kovový blok s presným systémom. Má tiež dva indexové otvory umiestnené v presne definovanej vzdialenosti od osi otáčania, pomocou ktorých sa určujú zodpovedajúce vzdialenosti v analytickej bunke. Analytická bunka, ktorej kapacita je zvyčajne 1 cm 3 , má sektorový tvar. Pri správnej inštalácii do rotora, napriek tomu, že stojí zvislo, funguje na rovnakom princípe ako rotor so závesnými miskami, čím vytvára takmer ideálne sedimentačné podmienky. Na koncoch analytickej cely sú okienka s kremennými sklami. Analytické ultracentrifúgy sú vybavené optickými systémami, ktoré umožňujú pozorovanie sedimentácie častíc počas celej doby centrifugácie. V určených intervaloch je možné sedimentovaný materiál fotografovať. Pri frakcionácii proteínov a DNA sa sedimentácia monitoruje absorpciou v ultrafialovom žiarení a v prípadoch, keď skúmané roztoky majú rôzne indexy lomu - pomocou Schlierenovho systému alebo Rayleighovho interferenčného systému. Posledné dve metódy sú založené na skutočnosti, že pri prechode svetla cez priehľadný roztok pozostávajúci zo zón s rôznou hustotou dochádza k lomu svetla na hranici zón. Počas sedimentácie sa medzi zónami s ťažkými a ľahkými časticami vytvorí hranica, ktorá pôsobí ako refrakčná šošovka; v tomto prípade sa na fotografickej platni používanej ako detektor objaví vrchol. Počas sedimentácie sa pohybuje hranica a tým aj vrchol, podľa rýchlosti ktorého sa dá posúdiť rýchlosť sedimentácie materiálu. Interferometrické systémy sú citlivejšie ako Schlierenove systémy. Analytické cely sú jednosektorové, ktoré sa používajú najčastejšie, a dvojsektorové, ktoré sa používajú na porovnávacie štúdium rozpúšťadla a rozpustenej látky.

V biológii sa analytická ultracentrifugácia používa na stanovenie molekulových hmotností makromolekúl, kontrolu čistoty výsledných vzoriek a tiež na štúdium konformačných zmien makromolekúl.

2.8 Aplikácie analytickej ultracentrifugácie

2.8.1 Stanovenie molekulových hmotností

Existujú tri hlavné metódy na stanovenie molekulových hmotností pomocou analytickej ultracentrifugácie: stanovenie rýchlosti sedimentácie, metóda sedimentačnej rovnováhy a metóda aproximácie sedimentačnej rovnováhy.

Stanovenie molekulovej hmotnosti sedimentačnou rýchlosťou - toto je najbežnejšia metóda. Odstreďovanie sa vykonáva pri vysokých rýchlostiach, takže častice, spočiatku rovnomerne rozložené v celom objeme, sa začnú usporiadane pohybovať pozdĺž polomeru od stredu otáčania. Medzi oblasťou rozpúšťadla, ktorá už neobsahuje častice, a časťou, ktorá ich obsahuje, sa vytvorí jasné rozhranie. Táto hranica sa pri odstreďovaní pohybuje, čo umožňuje určiť rýchlosť sedimentácie častíc pomocou niektorej z vyššie uvedených metód, pričom tento pohyb zaznamenávame na fotografickú platňu.

Rýchlosť sedimentácie je určená nasledujúcim vzťahom:

KdeX - vzdialenosť od osi otáčania v cm,

t - čas v s,

w- uhlová rýchlosť v rad-s -1 ,

s - sedimentačný koeficient „molekuly.

Sedimentačný koeficient je rýchlosť na jednotku zrýchlenia, meria sa vSeedbergove jednotky ; 1 Svedbergova jednotka sa rovná 10 _13 s. Číselná hodnotaszávisí od molekulovej hmotnosti a tvaru častíc a je to hodnota charakteristická pre danú molekulu alebo supramolekulárnu štruktúru. Sedimentačný koeficient lyzozýmu je napríklad 2,15S; catal aza má sedimentačný koeficient 11,35S, podjednotky bakteriálnych ribozómov - od 30 do 50Sa eukaryotické ribozomálne podjednotky - od 40 do 60S.

KdeM - molekulová hmotnosť molekuly,R - plynová konštanta,T - absolútna teplota,s- koeficient sedimentácie molekúl,D - difúzny koeficient molekuly,v - čiastočný špecifický objem, ktorý možno považovať za objem, ktorý zaberá jeden gram rozpustenej látky, p - hustota rozpúšťadla.

Sedimentačná rovnovážna metóda. Stanovenie molekulových hmotností touto metódou sa vykonáva pri relatívne nízkych otáčkach rotora, približne 7 000 až 8 000 ot./min. -1 aby sa molekuly s vysokou molekulovou hmotnosťou neusadzovali na dne. Ultracentrifugácia sa vykonáva dovtedy, kým častice nedosiahnu rovnováhu, ktorá sa ustanoví vplyvom odstredivých síl na jednej strane a difúznych síl na strane druhej, t.j. kým sa častice neprestanú pohybovať. Potom sa z výsledného koncentračného gradientu vypočíta molekulová hmotnosť látky podľa vzorca

KdeR - plynová konštanta,T - absolútna teplota, ω - uhlová rýchlosť, p - hustota rozpúšťadla,v - čiastočný špecifický objem,s X As 2 - koncentrácia rozpustenej látky na vzdialenostiG G a g 2 od osi otáčania.

Nevýhodou tejto metódy je, že dosiahnutie sedimentačnej rovnováhy trvá dlho - od niekoľkých dní až po niekoľko týždňov pri nepretržitej prevádzke odstredivky.

Metóda na priblíženie sa k sedimentačnej rovnováhe bola vyvinuté, aby sa zbavili nevýhod predchádzajúcej metódy spojených s veľkým množstvom času potrebného na „nastolenie rovnováhy“. Pomocou tejto metódy možno určiť molekulové hmotnosti, keď je odstredený roztok blízko rovnováhy. Spočiatku sú makromolekuly distribuované rovnomerne v celom objeme analytickej bunky; potom, ako pokračuje centrifugácia, molekuly sa usadia a hustota roztoku v oblasti menisku postupne klesá. Zmena hustoty sa starostlivo zaznamená a potom sa pomocou zložitých výpočtov zahŕňajúcich veľké množstvo premenných určí molekulová hmotnosť danej zlúčeniny pomocou vzorcov:

KdeR - plynová konštanta,T - absolútna teplota,v - čiastočný špecifický objem, p - hustota rozpúšťadla,dcldr - gradient koncentrácie makromolekúl, g ma g d- vzdialenosť k menisku a dnu skúmavky, s ma s d- koncentrácia makromolekúl v menisku a na dne skúmavky,M m AM R - hodnoty molekulovej hmotnosti stanovené z distribúcie koncentrácie látky v menisku a na dne skúmavky.

2.8.2 Hodnotenie čistoty liečiva

Analytická ultracentrifugácia sa široko používa na hodnotenie čistoty DNA, vírusov a proteínových prípravkov. Čistota prípravkov je nepochybne veľmi dôležitá v prípadoch, keď je potrebné presne určiť molekulovú hmotnosť molekuly. Vo väčšine prípadov možno homogenitu prípravku posúdiť podľa povahy sedimentačnej hranice, pričom sa použije metóda stanovenia rýchlosti sedimentácie: homogénny prípravok zvyčajne poskytuje jednu ostro definovanú hranicu. Nečistoty prítomné v prípravku sa javia ako ďalší vrchol alebo rameno; určujú aj asymetriu hlavného vrcholu.

2.8.3 Štúdium konformačných zmien v makromolekulách

Ďalšou oblasťou použitia analytickej ultracentrifugácie je štúdium konformačných zmien v makromolekulách. Molekula DNA môže byť napríklad jednovláknová alebo dvojvláknová, lineárna alebo kruhová. Vplyvom rôznych zlúčenín alebo pri zvýšených teplotách dochádza v DNA k množstvu reverzibilných a ireverzibilných konformačných zmien, ktoré možno určiť zmenami rýchlosti sedimentácie vzorky. Čím je molekula kompaktnejšia, tým je jej koeficient trenia v roztoku nižší a naopak: čím je menej kompaktná, tým je koeficient trenia väčší, a preto bude sedimentovať pomalšie. Rozdiely v rýchlosti sedimentácie vzorky pred a po rôznych vplyvoch na ňu teda umožňujú odhaliť konformačné zmeny vyskytujúce sa v makromolekulách.

V alosterických proteínoch, ako je aspartáttranskarbamoyláza, dochádza ku konformačným zmenám v dôsledku ich väzby na substrát a malé ligandy. Disociácia proteínu na podjednotky môže byť spôsobená jeho pôsobením látok, ako je močovina alebo parachlórmerkuribenzoát. Všetky tieto zmeny možno ľahko monitorovať pomocou analytickej ultracentrifugácie.