ภูมิคุ้มกันซับในการวินิจฉัยเอชไอวี Immune blotting กลไกการซับภูมิคุ้มกัน ใช้งานได้จริง

ภูมิคุ้มกันบกพร่อง –(จากภาษาอังกฤษ "blot" - จุด) - วิธีการระบุแอนติเจน (หรือแอนติบอดี) โดยใช้ซีรั่มที่รู้จัก (หรือแอนติเจน) เป็นการผสมผสานระหว่างเจลอิเล็กโตรโฟเรซิสและ ELISA ในขั้นแรกเซลล์แบคทีเรียหรือ virions จะถูกทำลายโดยใช้อัลตราซาวนด์ จากนั้นแอนติเจนทั้งหมดของไวรัสหรือเซลล์แบคทีเรียจะถูกแยกออกด้วยอิเล็กโตรโฟเรซิส และจะได้รีเอเจนต์เชิงพาณิชย์บนฟิล์มไนโตรเซลลูโลสชนิดพิเศษ เมื่อทำอิมมูโนลอตต์ เซรั่มของผู้ป่วยที่อยู่ระหว่างการศึกษาจะถูกนำไปใช้กับฟิล์มที่มีแอนติเจนที่รู้จัก หลังจากการฟักตัวและการล้างแอนติบอดีที่ไม่ถูกผูกไว้ ให้ดำเนินการ ELISA - แอนติซีรัมกับอิมมูโนโกลบูลินของมนุษย์ที่มีป้ายกำกับด้วยเอนไซม์และสารตั้งต้นโครโมจีนิกที่เปลี่ยนสีเมื่อมีปฏิกิริยากับเอนไซม์จะถูกนำไปใช้กับฟิล์ม ในกรณีที่มีแอนติเจน - แอนติบอดี - แอนติซีรัมถึงคอมเพล็กซ์อิมมูโนโกลบูลิน - เอนไซม์จุดสีจะปรากฏบนพาหะ วิธีการอิมมูโนบลูตติงช่วยให้คุณแยกการตรวจจับแอนติบอดีต่อแอนติเจนของเชื้อโรคต่างๆ (ตัวอย่างเช่นในการติดเชื้อเอชไอวีอิมมูโนบลูตติ้งจะตรวจจับแอนติบอดีต่อ gp120, gp24 และแอนติเจนของไวรัสอื่น ๆ )

การตรวจด้วยรังสี (RIA)

วิธีการนี้ขึ้นอยู่กับปฏิกิริยาแอนติเจน-แอนติบอดีโดยใช้แอนติเจนหรือแอนติบอดีที่ติดแท็กนิวไคลด์กัมมันตภาพรังสี 125I, 14C, 3H, 51Cr และนิวไคลด์กัมมันตรังสีอื่นๆ ใช้เป็นฉลาก คอมเพล็กซ์ภูมิคุ้มกันที่เกิดขึ้นจะถูกแยกออกจากระบบและกัมมันตภาพรังสีของพวกมันจะถูกกำหนดบนเคาน์เตอร์ (รังสีβ) ความเข้มของรังสีเป็นสัดส่วนโดยตรงกับจำนวนแอนติเจนและโมเลกุลแอนติบอดีที่จับกัน

RIA เวอร์ชันโซลิดเฟสที่ใช้แอนติบอดีหรือแอนติเจนที่มีป้ายกำกับซึ่งดูดซับในบ่อของแผงโพลีสไตรีนนั้นแพร่หลาย

RIA ใช้ในการตรวจหาแอนติเจนของจุลินทรีย์ ไวรัส ฮอร์โมนต่างๆ เอนไซม์ สารยาอิมมูโนโกลบูลิน รวมถึงสารอื่นๆ ที่มีอยู่ในวัสดุทดสอบที่มีความเข้มข้นเล็กน้อย 10-12–10-15 กรัม/ลิตร

คำถามควบคุม

ปฏิกิริยาการย่อยสลายแบคทีเรียในระบบภูมิคุ้มกัน: ปฏิกิริยาชนิดใด แอนติเจนคืออะไร แอนติบอดีคืออะไร กลไกการเกิดปฏิกิริยา วิธีการผลิต การนำไปใช้จริง ปฏิกิริยาเม็ดเลือดแดงแตกของภูมิคุ้มกัน: ส่วนผสมที่จำเป็น, ขั้นตอน; การควบคุม การนำไปใช้จริง ปฏิกิริยาภาวะเม็ดเลือดแดงแตกเฉพาะที่ในเจล (ปฏิกิริยาเจอร์น): หลักการของปฏิกิริยา วิธีการผสมสูตร และการใช้งานจริง ปฏิกิริยาการตรึงเสริม: หลักการของปฏิกิริยา สิ่งที่เกิดขึ้นเมื่อเซรั่มภูมิคุ้มกันทำปฏิกิริยากับแอนติเจนจำเพาะ จะเกิดอะไรขึ้นถ้าส่วนเสริมมีอยู่ในระหว่างการโต้ตอบนี้? ชะตากรรมของคอมพลีเมนต์จะเป็นอย่างไรหากไม่มีความสัมพันธ์ที่จำเพาะระหว่างแอนติเจนและแอนติบอดี? ปฏิกิริยาใดที่สามารถใช้เพื่อกำหนดสิ่งที่เกิดขึ้นกับส่วนเสริม เหตุใดจึงใช้ปฏิกิริยาเฉพาะนี้ ผลลัพธ์เชิงบวกที่มองเห็นได้ของ RSC คืออะไร? ทำไม ข้อใดเป็นคุณสมบัติของส่วนเสริมที่ใช้ในระยะแรกของ RSC ในระยะที่สอง? หากผลลัพธ์สุดท้ายของ RSC คือภาวะเม็ดเลือดแดงแตก หมายความว่าเป็นผลบวกหรือลบหรือไม่? อธิบายผลลัพธ์: RSK+ + + +, RSK+ + +, RSK+ +, RSK+ ตั้งชื่อส่วนผสมของระบบ RSK แรกและส่วนผสมของระบบ RSK ที่สอง เหตุใดจึงต้องปิดการใช้งานเซรั่มทดสอบ? การไตเตรทส่วนเติมเต็มเป็นอย่างไร? เซรั่มเม็ดเลือดแดงแตก: ประกอบด้วยอะไรบ้าง, ได้มาจากอะไร, ไตเตรทคืออะไรและพิจารณาได้อย่างไร? สัตว์ชนิดใดบ้างที่ใช้เพื่อให้ได้ส่วนประกอบ RSC ระเบียบวิธีการตั้งค่า RSC ในที่เย็น เมื่อแสดงปฏิกิริยาใดต่อไปนี้ที่ต้องอาศัยส่วนประกอบเสริม: การตกตะกอน การตกตะกอน การเกาะติดกัน การตรวจหาแอนติบอดีที่ไม่สมบูรณ์ การสลายตัวของแบคทีเรียในระบบภูมิคุ้มกัน ภาวะเม็ดเลือดแดงแตกทางภูมิคุ้มกัน, Jerne, RSC ปฏิกิริยาอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ (RIF) - ระบุลำดับของเหตุการณ์ในปฏิกิริยา Koons โดยตรง ส่วนผสมที่จำเป็น แอนติเจนคืออะไร, แอนติบอดีคืออะไร, แอนติบอดีคืออะไร, ผลของปฏิกิริยาคำนึงถึงอย่างไร, ผลลัพธ์เชิงบวกมีลักษณะอย่างไร? การใช้งานจริง - อะไรที่สามารถกำหนดได้โดยใช้ปฏิกิริยานี้? ปฏิกิริยาอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ทางอ้อม - ระบุลำดับของเหตุการณ์ระหว่างปฏิกิริยานี้, ส่วนผสมที่จำเป็น, แอนติเจนคืออะไร, ซีรั่มภูมิคุ้มกันชนิดใดที่ใช้; การใช้งานจริง ข้อดีของ RIF ทางอ้อมเมื่อเปรียบเทียบกับปฏิกิริยาโดยตรง การทดสอบอิมมูโนซอร์เบนท์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISA) - หลักการของปฏิกิริยา ส่วนผสมที่จำเป็น ระบุลำดับของเหตุการณ์เมื่อทำปฏิกิริยาเพื่อตรวจจับแอนติเจนในวัสดุที่กำลังทดสอบ ส่วนผสมที่จำเป็น จะเกิดอะไรขึ้นเมื่อผลเป็นบวกจะมีลักษณะอย่างไร? ระบุลำดับของการดำเนินการเมื่อทำ ELISA เพื่อตรวจหาแอนติบอดีในซีรั่มทดสอบ ส่วนผสมที่จำเป็น จะเกิดอะไรขึ้นถ้าผลลัพธ์เป็นบวก? Immunoblotting – หลักการของปฏิกิริยา ขั้นตอนหลัก ส่วนผสมที่จำเป็น คำนึงถึงผลลัพธ์อย่างไร ประโยชน์ของปฏิกิริยา Radioimmunoassay (RIA) - ขั้นตอนหลักของปฏิกิริยาคืออะไร แอนติบอดีหรือแอนติเจนติดฉลากด้วยอะไร ผลที่ได้จะนำมาพิจารณาอย่างไร? กล้องจุลทรรศน์อิมมูโนอิเล็กตรอน - หลักการของวิธีการ; ขั้นตอนหลัก ส่วนผสมที่จำเป็น แอนติบอดีมีป้ายกำกับว่าอะไร? คำนึงถึงผลของปฏิกิริยาอย่างไร ปฏิกิริยาการตรึง – หลักการของวิธีการ เทคนิคการตั้งค่า ส่วนประกอบ การบันทึกผลลัพธ์

งานที่ต้องทำให้เสร็จในระหว่างกระบวนการศึกษาด้วยตนเอง

กรอกตาราง “ปฏิกิริยาภูมิคุ้มกัน” ที่เกี่ยวข้องกับปฏิกิริยาที่กล่าวถึงในหัวข้อนี้

ปฏิกิริยาภูมิคุ้มกัน

งานของนักเรียนระหว่างบทเรียนภาคปฏิบัติ

เริ่มงานทันทีด้วยการตั้งค่าเฟสที่ 1 ของ RSK แต่จดบันทึกไว้ในสมุดบันทึกของคุณในภายหลัง (ดูด้านล่าง)

1. ปฏิกิริยาเม็ดเลือดแดงแตกของภูมิคุ้มกัน ดูปฏิกิริยาสาธิตของภาวะเม็ดเลือดแดงแตกทางภูมิคุ้มกัน ร่างเป็นแผนภาพ อธิบายผลลัพธ์ในหลอดทดลองและหลอดควบคุม

2. ปฏิกิริยาการตรึงเสริม

ก) แยกวิเคราะห์ RSK ตามตาราง

b) วาดไดอะแกรมของการตั้งค่า RSC ในรูปแบบของตารางในสมุดบันทึก

c) ใส่เฟสที่สองของ RSK (เฟสแรกวางไว้ที่จุดเริ่มต้นของบทเรียน)

d) วิเคราะห์การเตรียมการวินิจฉัยที่จำเป็นสำหรับ RSC

d) คำนึงถึงผลลัพธ์ กำหนดข้อสรุปเกี่ยวกับการมีอยู่ของแอนติบอดีจำเพาะในซีรั่มทดสอบ

3. ปฏิกิริยาอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ ศึกษาตารางสร้างไดอะแกรมปฏิกิริยาลงในสมุดบันทึกของคุณ ดู ซีรั่มการวินิจฉัย- ตรวจสอบว่าซีรั่มประกอบด้วยอะไรบ้าง เตรียมอย่างไร สำหรับปฏิกิริยาใด (RIF โดยตรงหรือโดยอ้อม) ที่ใช้ ดูผลการสาธิต RIF ในกล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรสเซนต์

4. การทดสอบอิมมูโนซอร์เบนท์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISA) ในสมุดบันทึกของคุณ ให้จัดทำโครงร่างสำหรับการตั้งค่าปฏิกิริยาในสองเวอร์ชัน: สำหรับการตรวจหาแอนติเจนในวัสดุที่กำลังศึกษา และการตรวจหาแอนติบอดีในซีรั่ม ทบทวนชุดส่วนผสมสำหรับเอชไอวีและไวรัสตับอักเสบบี ระบุว่าส่วนผสมแต่ละอย่างมีอะไรบ้างและใช้ทำอะไร

5. อิมมูโนล็อตติง สร้างแผนภาพปฏิกิริยาลงในสมุดบันทึกของคุณ ชมการสาธิต-ผลของปฏิกิริยา

6. การตรวจด้วยรังสี (RIA) สร้างแผนภาพปฏิกิริยาลงในสมุดบันทึกของคุณ

7. กล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบภูมิคุ้มกัน (IEM) ชมการสาธิต - ผลลัพธ์ของปฏิกิริยา จัดทำไดอะแกรมของปฏิกิริยาในสมุดบันทึกของคุณ ระบุด้วยลูกศรถึงแอนติเจน (ไวรัส) และแอนติบอดีที่มีป้ายกำกับ

อิมมูโนล็อตติงเป็นวิธีการที่มีความไวสูงในการตรวจหาโปรตีน โดยอาศัยการรวมกันของอิเล็กโตรโฟรีซิสและ ELISA หรือ RIA Immunoblotting ถูกใช้เป็น วิธีการวินิจฉัยสำหรับการติดเชื้อเอชไอวี ฯลฯ

ในความหมายทั่วไป อิมมูโนล็อตติงหมายถึงการวิเคราะห์ของผสมของโปรตีนที่ถูกถ่ายโอนไปยังส่วนรองรับเมมเบรนแข็ง ซึ่งพวกมันถูกผูกมัดด้วยพันธะโควาเลนต์ ตามด้วยการตรวจจับภูมิคุ้มกัน

คุณสามารถวิเคราะห์ส่วนผสมของโปรตีนที่นำไปใช้กับซับสเตรตโดยตรง - การวิเคราะห์ดอทบล็อต - หรือหลังการแยกส่วนเบื้องต้นด้วยอิเล็กโตรโฟกัสing, ดิสก์อิเล็กโทรโฟเรซิส หรืออิเล็กโตรโฟรีซิสสองมิติ - การวิเคราะห์เวสเทิร์นบล็อต

แอนติเจนของเชื้อโรคจะถูกแยกออกโดยใช้โพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส จากนั้นจึงย้ายจากเจลไปยังกระดาษกัมมันต์หรือเมมเบรนไนโตรเซลลูโลส และพัฒนาโดยใช้ ELISA

บริษัทต่างๆ ผลิตแถบดังกล่าวโดยมี "รอยเปื้อน" ของแอนติเจน ซีรั่มของผู้ป่วยถูกนำไปใช้กับแถบเหล่านี้ . จากนั้น หลังจากการฟักตัว ผู้ป่วยจะถูกล้างออกจากแอนติบอดีที่ไม่ได้จับตัวกัน และนำซีรั่มไปใช้กับอิมมูโนโกลบูลินของมนุษย์ที่มีฉลากด้วยเอนไซม์ . สารเชิงซ้อนที่เกิดขึ้นบนแถบ (แอนติเจน + แอนติบอดีผู้ป่วย + แอนติบอดีต่อ Ig ของมนุษย์) ถูกตรวจพบโดยการเพิ่มสารตั้งต้น chromogenic ที่เปลี่ยนสีภายใต้การกระทำของเอนไซม์

วิธีการนี้ยังใช้ในการเลือกโคลนของแบคทีเรีย ฟาจ หรือไวรัสที่แสดงผลิตภัณฑ์ยีนที่ถูกโคลนเป้าหมายอีกด้วย

การถ่ายโอนโปรตีนไปยังเมมเบรนนั้นดำเนินการแบบพาสซีฟหรือใช้อุปกรณ์ถ่ายโอนด้วยไฟฟ้า ประสิทธิภาพของการถ่ายโอนโปรตีนไปยังเมมเบรนได้รับอิทธิพลจากหลายปัจจัย เช่น น้ำหนักโมเลกุลของโปรตีน ความพรุนของเจล เวลาในการถ่ายโอน และองค์ประกอบของสารละลายบัฟเฟอร์ (ทรานส์บัฟเฟอร์) ที่ใช้

ขึ้นอยู่กับวัตถุประสงค์และเงื่อนไขของการทดลอง เงื่อนไขการถ่ายโอนจะถูกเลือกเพื่อให้แน่ใจว่า ผลลัพธ์ที่ดีที่สุด- ไนโตรเซลลูโลส, โพลีไวนิลดีนไดฟลูออไรด์ (PVDF) หรือเมมเบรนไนลอนที่มีประจุบวกมักใช้เป็นพื้นผิว ไนโตรเซลลูโลสสามารถจับโปรตีนได้มากถึง 80 - 100 ไมโครกรัมต่อ 1 ตารางลูกบาศก์เซนติเมตร

โปรตีนที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำ (ที่มีน้ำหนักโมเลกุลน้อยกว่า 20 kDa) อาจสูญเสียไปเนื่องจากการล้าง ซึ่งทำให้สามารถศึกษาเบื้องต้นเกี่ยวกับความหลากหลายของตำแหน่งทางพันธุกรรมโดยพิจารณาจากความยาวของชิ้นส่วนข้อจำกัด DNA ที่เกี่ยวข้อง

นอกจากนี้ เมื่อใช้ Southern Hybridization คุณสามารถค้นหาได้อย่างง่ายดายว่ายีนเป้าหมายมีบริเวณของการไฮโดรไลซิสโดยเอนไซม์จำกัดเฉพาะในส่วนภายในหรือไม่ ซึ่งช่วยให้คุณเลือกกลยุทธ์ที่เหมาะสมที่สุดสำหรับการโคลนบริเวณจีโนมที่ศึกษา

เมื่อใช้รูปแบบที่คล้ายกัน โมเลกุล RNA สามารถถ่ายโอนจากเจลอะกาโรสไปยังตัวกรองไนโตรเซลลูโลสได้ วิธีการนี้เรียกว่า Northern blotting ซึ่งต่างจาก Southern blotting เนื่องจากนามสกุล Southern ใช้ ภาษาอังกฤษแปลว่า "ภาคใต้"

การถ่ายโอนโปรตีนไปยังตัวกรองจากเจลจึงเรียกว่า Western blotting โปรตีนขนาดใหญ่ (>100 kDa) ที่ถูกแปลงสภาพในสารละลายโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS) อาจถูกถ่ายโอนไปยังเมมเบรนได้ไม่ดีหากมีเอทานอลอยู่ในทรานส์บัฟเฟอร์ แอลกอฮอล์ช่วยเพิ่มการถ่ายโอนโปรตีนจากเจล SDS-polyacrylamide ได้อย่างมีนัยสำคัญ แต่ทำให้รูขุมขนในเจลแคบลง ซึ่งนำไปสู่การกักเก็บโปรตีนขนาดใหญ่

เมมเบรน PVDF ได้รับการปรับให้เหมาะสมสำหรับการตรวจจับภูมิคุ้มกัน และสามารถกักเก็บโปรตีนที่จับกันเป็นพิเศษได้สูงถึง 160 μg/cm2 โดยมีการจับแบบไม่จำเพาะในระดับต่ำมาก

ภูมิคุ้มกันบกพร่อง

คุณสมบัติที่สำคัญของเมมเบรนนี้คือความเป็นไปได้ในการใช้งานซ้ำ เยื่อไนลอน Zeta-Probe จับโปรตีน SDS ได้อย่างมีประสิทธิภาพในกรณีที่ไม่มีแอลกอฮอล์ และการจับนี้ทนทานต่อการบำบัดในภายหลัง โปรตีนที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำจะถูกเก็บรักษาไว้อย่างมีประสิทธิภาพเช่นกัน ด้วยความสามารถในการจับยึดสูงที่ประมาณ 480 ไมโครกรัมของโปรตีนต่อตารางเซนติเมตร เมมเบรน Zeta-Probe ช่วยให้สามารถตรวจจับปริมาณโปรตีนในส่วนผสมทดสอบได้

เมื่อแอนติเจนถูกตรึงบนเมมเบรน ตำแหน่งการจับที่เหลือจะถูกปิดกั้นด้วยสารละลายของเจลาติน ซีรั่มอัลบูมินของวัว หรือนมพร่องมันเนย

จากนั้นเมมเบรนจะถูกบ่มในสารละลายโพลีโคลนอลหรือโมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อแอนติเจนที่กำลังศึกษาอยู่ หลังจากล้างแอนติบอดีที่ไม่ถูกผูกไว้ออก เมมเบรนจะถูกบ่มในสารละลายของแอนติบอดีทุติยภูมิ ซึ่งเป็นคอนจูเกตของเอนไซม์อัลคาไลน์ฟอสฟาเตส (AP) หรือฮอสแรดิชเปอร์ออกซิเดส (HRP) พร้อมด้วยแอนติบอดีต่อต้านสายพันธุ์ (แอนติบอดีของแพะต่อกระต่าย หนู หรืออิมมูโนโกลบุลินของมนุษย์ ) หรือโปรตีน A (โปรตีนของ Staphylococcus aureus) หรือ G (โปรตีนของ Streptococcus sp.) ซึ่งมีสัมพรรคภาพสูงสำหรับบริเวณ Fc ของอิมมูโนโกลบูลิน

การตรวจหาคอมเพล็กซ์ภูมิคุ้มกันที่เกิดขึ้นนั้นดำเนินการทางเคมีหรือทางเคมี พื้นผิวสำหรับ ปฏิกิริยาเคมีเมื่อใช้คอนจูเกตอัลคาไลน์ฟอสฟาเตส ให้ใช้ 5-โบรโม-4-คลอโร-3-อินโดลิลฟอสเฟต (BCIP) หรือบลูเตตราโซเลียม (NBT) และเมื่อใช้คอนจูเกตฮอสแรดิชเปอร์ออกซิเดส ให้ใช้ 4-คลอโร-1-แนฟทอลและไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์

อันเป็นผลมาจากปฏิกิริยาของเอนไซม์จะมีแถบสีหรือจุดสีเกิดขึ้นบนเมมเบรนในบริเวณที่มีการแปลแอนติเจนและแอนติบอดีที่ซับซ้อน

ความไวของวิธีนี้คือ 100 pg ของโปรตีนเมื่อใช้คอนจูเกต AP และ 100-500 pg เมื่อใช้คอนจูเกต HRP การตรวจหาสารเชิงซ้อนภูมิคุ้มกันโดยใช้สารเคมีช่วยให้สามารถตรวจพบแอนติเจนได้น้อยกว่า 5 pg หลักการของวิธีนี้ก็คือ เมื่อ HRP ทำปฏิกิริยากับไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์และไซคลิก ไดเอซิลไฮดราซีน ลูมินอล แสงจะถูกปล่อยออกมาที่ความยาวคลื่น 428 นาโนเมตร ซึ่งสามารถบันทึกลงบนฟิล์มไวแสงได้

ปฏิกิริยาอิมมูโนลอตต์ (IB) ได้รับการพัฒนาบนพื้นฐานของ ELISA เป็นวิธีการวิเคราะห์ทางอิมมูโนเคมีที่เฉพาะเจาะจงและละเอียดอ่อนที่สุด Immunoblotting (จากภาษาอังกฤษ blot - blot, stain) ผสมผสาน ELISA กับอิเล็กโตรโฟรีซิส ใช้ในการตรวจหาแอนติบอดีที่ไม่ซับซ้อนต่อเอชไอวี แต่เป็นแอนติบอดีต่อโปรตีนโครงสร้างส่วนบุคคล (โปรตีน p24, ไกลโคโปรตีน gp120, gp 41 ฯลฯ ) หมายถึงปฏิกิริยาของผู้เชี่ยวชาญ (ยืนยัน) ในการวินิจฉัยการติดเชื้อเอชไอวี

ปฏิกิริยาจะดำเนินการในหลายขั้นตอน:

ไวรัสถูกทำลายเป็นส่วนประกอบ - แอนติเจน (p24, gp120, gp 41 ฯลฯ ) ซึ่งอยู่ภายใต้อิเล็กโตรโฟรีซิสในเจลโพลีอะคริลาไมด์นั่นคือการแยกแอนติเจนออกเป็นเศษส่วนตามน้ำหนักโมเลกุล

2. เจลถูกหุ้มด้วยเมมเบรนไนโตรเซลลูโลสและเศษส่วนของแอนติเจนจะถูกถ่ายโอนไปโดยใช้อิเล็กโทรโฟรีซิส ไนโตรเซลลูโลสมีพฤติกรรมเหมือนกระดาษซับ เมมเบรนถูกตัดเป็นเส้น บริษัทต่างๆ ผลิตแถบดังกล่าวโดยมี "รอยเปื้อน" ของแอนติเจน

Immunoblotting - วิธีทางอ้อมเพิ่มเติม

แถบที่เคลือบด้วยแอนติเจนของเอชไอวีจะถูกจุ่มลงในซีรั่มของผู้ถูกทดสอบแล้วจึงนำไปล้างเพื่อเอาวัสดุที่หลุดออกมาออก

4. แถบจะถูกบ่มด้วยเซรั่มแอนติโกลบูลินที่มีป้ายกำกับเปอร์ออกซิเดสแล้วล้าง

เพิ่มวัสดุพิมพ์และจำนวนเศษส่วนสี (จุด) ที่สอดคล้องกับโซนการแปลของคอมเพล็กซ์ AG-AT

การมีอยู่ของแถบในบางพื้นที่ของแถบเป็นการยืนยันการมีอยู่ของซีรั่มของแอนติบอดีที่ทดสอบแล้วเพื่อกำหนดแอนติเจนของเอชไอวีอย่างเคร่งครัด ผลลัพธ์ของอิมมูโนลอตต์จะถือว่าเป็นบวกหากมองเห็นแถบที่สอดคล้องกับแอนติเจนของเอชไอวีสองในสามชนิด - p24, gp41 และ gp 120 บนเมมเบรน (รูปที่ 37)

ภาพวาด

รายการอ้างอิงที่ใช้

วรรณกรรมหลัก

จุลชีววิทยาทางการแพทย์ ไวรัสวิทยา และภูมิคุ้มกันวิทยา: หนังสือเรียนสำหรับนักศึกษาแพทย์ มหาวิทยาลัย ฉบับที่ 2, รศ. และเพิ่มเติม — 702 หน้า เอ็ด เอเอ โวโรบิโอวา อ.: MIA, 2012.

2. จุลชีววิทยา ไวรัสวิทยา และภูมิคุ้มกันวิทยา: คู่มือสำหรับชั้นเรียนในห้องปฏิบัติการ: หนังสือเรียน/(V.B. Sboychakov และอื่นๆ); แก้ไขโดย V.B. Sboychakova, M.M. – อ.: GEOTAR-Media, 2014.- 320 หน้า: ป่วย.

3. จุลชีววิทยาทางการแพทย์ ภูมิคุ้มกันวิทยา และไวรัสวิทยา [แหล่งข้อมูลอิเล็กทรอนิกส์]: หนังสือเรียนเกี่ยวกับน้ำผึ้ง

มหาวิทยาลัย - 760 หน้า — โหมดการเข้าถึง: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Korotyaev A.I., Babichev S.A. เซนต์ปีเตอร์สเบิร์ก: Spetslit, 2010

4. จุลชีววิทยาทางการแพทย์ ไวรัสวิทยา และภูมิคุ้มกันวิทยา [ทรัพยากรอิเล็กทรอนิกส์]: หนังสือเรียน: มี 2 เล่ม / เล่ม 1. - 448 หน้า — โหมดการเข้าถึง: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.

อ.: Geotar Media, 2010. .

5. จุลชีววิทยาทางการแพทย์ ไวรัสวิทยา และภูมิคุ้มกันวิทยา [ทรัพยากรอิเล็กทรอนิกส์]: หนังสือเรียน: ใน 2 เล่ม ต. 2. - 480 หน้า โหมดการเข้าถึง: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. อ.: Geotar Media, 2010.

วรรณกรรมเพิ่มเติม

1. ปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันบกพร่อง: บทช่วยสอน/ เรียบเรียงโดย: G.K.Davletshina, Z.G.Gabidullin, A.A.Akhtarieva, M.M.Tuigunov, A.K.Bulgakov, T.A.Savchenko, R.F.

Khusnarizanova, Yu.Z. Gabidullin, M.M. Alsynbaev - Ufa: สำนักพิมพ์ของสถาบันการศึกษางบประมาณระดับอุดมศึกษา BSMU ของกระทรวงสาธารณสุขของรัสเซีย, 2016 - 86 หน้า

2. คุณสมบัติของคุณสมบัติบางอย่างที่กำหนดศักยภาพในการทำให้เกิดโรคของแบคทีเรีย Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E.coli, Proteus ที่ปลูกร่วมกัน: สิ่งพิมพ์ทางวิทยาศาสตร์ / Yu. Z. Gabidullin, R. S. Sufiyarov, I. I. Dolgushin - Ufa, 2015. - 250 วิ

หน้าแรก » Immunoblot – มันคืออะไร? Immunoblot ในการวินิจฉัยโรคติดเชื้อ

Immunoblot - มันคืออะไร? Immunoblot ในการวินิจฉัยโรคติดเชื้อ

อิมมูโนลอตคืออะไร? นี่เป็นวิธีการทั่วไปสำหรับการวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการเกี่ยวกับการติดเชื้อไวรัสในมนุษย์ นี่เป็นวิธีหนึ่งที่แม่นยำและเชื่อถือได้ที่สุดในการตรวจจับการติดเชื้อเอชไอวี

เพื่อความน่าเชื่อถือ การทดสอบนี้มีขนาดใหญ่กว่าการทดสอบอิมมูโนซอร์เบนท์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (เอลิซา) ผลลัพธ์ของ Immunoblot ถือเป็นข้อมูลสรุปและเป็นข้อสรุป

Immunoblot - มันคืออะไร? เพื่อที่จะรับรู้ว่าบุคคลนั้นมีเชื้อเอชไอวีคุณต้องผ่าน วิธีห้องปฏิบัติการการตรวจซีรั่มในเลือดเพื่อหาแอนติบอดี

ส่วน Western blot เรียกอีกอย่างว่า Western blots ใช้เพื่อตรวจหาการติดเชื้อไวรัสในมนุษย์เป็นวิธีการของผู้เชี่ยวชาญเพิ่มเติม นี่เป็นสิ่งจำเป็นเพื่อยืนยัน ELISA - การทดสอบในห้องปฏิบัติการที่ช่วยให้คุณตรวจสอบการมีอยู่ของแอนติบอดีต่อ HIV ในเลือด Immunoblot ตรวจสอบ ELISA เชิงบวกอีกครั้ง

ถือว่ามีความละเอียดอ่อนซับซ้อนและมีราคาแพงที่สุด

เป้า

อิมมูโนลอตคืออะไร? เทคนิคนี้ การวิจัยในห้องปฏิบัติการซีรั่มในเลือดสำหรับการมีแอนติบอดีต่อไวรัส

ในระหว่างการศึกษาพิเศษ พบโปรตีนของไวรัสทั้งหมดในเจลและเยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลส

Immunoblotting (การตรวจหาแอนติบอดีในซีรั่มของผู้ป่วยต่อแอนติเจนของเชื้อโรคบางชนิด)

ขั้นตอนการตัด Western blot มีวัตถุประสงค์เพื่อตรวจสอบการติดเชื้อ HIV ขั้นตอนที่แตกต่างกัน- ในระยะแรก ไวรัสบริสุทธิ์จากส่วนที่เป็นส่วนประกอบจะถูกอิเล็กโตรโฟรีซิส และแอนติเจนที่รวมอยู่ในนั้นจะถูกหารด้วยน้ำหนักโมเลกุล

ไวรัสโรคภูมิคุ้มกันบกพร่องของมนุษย์แพร่พันธุ์ในเซลล์ที่มีชีวิตซึ่งฝังอยู่ในข้อมูลทางพันธุกรรม ในขั้นตอนนี้ บุคคลจะกลายเป็นพาหะของไวรัส HIV หากคุณติดเชื้อ

ลักษณะเฉพาะของโรคนี้ก็คือว่า เป็นเวลานานไม่ปรากฏ ไวรัสทำลายลิมโฟไซต์ ภูมิคุ้มกันจึงลดลงและร่างกายไม่สามารถต่อสู้กับการติดเชื้อได้

หากได้รับการรักษาเอชไอวีอย่างถูกต้องและทันท่วงทีผู้ป่วยก็จะมีชีวิตอยู่ได้ อายุเยอะ- การขาดการรักษาย่อมนำไปสู่ความตายอย่างหลีกเลี่ยงไม่ได้ ตั้งแต่ติดเชื้อแต่ไม่มีการรักษา ระยะเวลาสูงสุดไม่เกินสิบปี

ลักษณะเฉพาะ

การวิเคราะห์อิมมูโนล็อตคือ วิธีการที่เชื่อถือได้ซึ่งช่วยให้คุณตรวจสอบการมีอยู่ของแอนติบอดีต่อแอนติเจนของเอชไอวีในประเภทที่หนึ่งและสอง

หากบุคคลหนึ่งติดเชื้อ หลังจากผ่านไปสองสัปดาห์ แอนติบอดีอาจถูกตรวจพบในภายหลังมาก ลักษณะพิเศษของเอชไอวีคือปริมาณแอนติบอดีเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วและยังคงอยู่ในเลือดของผู้ป่วย แม้ว่าจะมีอยู่ แต่โรคนี้อาจไม่ปรากฏให้เห็นเป็นเวลาสองปีหรือมากกว่านั้น วิธี ELISA ไม่ได้บ่งชี้การมีอยู่ของโรคอย่างถูกต้องเสมอไป โดยต้องมีการยืนยันผลลัพธ์จาก PCR และ Western blot หากเอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์ให้ผลลัพธ์ที่เป็นบวก

บ่งชี้สำหรับ

“อิมมูโนล็อต” ชนิดใดที่ถูกค้นพบแล้ว แต่ชนิดใดที่กำลังถูกนำมาใช้ในการศึกษา?

เหตุผลในการตรวจหาไวรัสเอชไอวี (HIV) จะเป็นผลบวกจาก ELISA จำเป็นต้องผ่านการทดสอบอิมมูโนซอร์เบนท์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ในผู้ป่วยที่กำลังจะเข้ารับการผ่าตัด นอกจากนี้คุณควรวิเคราะห์ผู้หญิงที่วางแผนจะตั้งครรภ์ตลอดจนผู้หญิงที่สำส่อนด้วย ส่วน Western blot ถูกกำหนดให้กับผู้ป่วยที่ติดเชื้อ HIV หากผลลัพธ์ของ elisa ไม่ชัดเจน

ต่อไปนี้อาจเป็นเหตุผลที่ควรปรึกษาแพทย์: อาการที่น่าตกใจ: การสูญเสียอย่างรวดเร็วน้ำหนัก ความอ่อนแอการสูญเสียการทำงาน ความผิดปกติของลำไส้ (ท้องเสีย) ซึ่งกินเวลาสามสัปดาห์ ภาวะขาดน้ำ การพัฒนาของต่อมน้ำเหลืองโต, วัณโรค, โรคปอดบวม, อาการกำเริบของโรคเริม

คนไข้ไม่จำเป็นต้องเตรียมตัวก่อนบริจาคเลือดดำ

อย่ากิน 8-10 ชั่วโมงก่อนการทดสอบ วันก่อนบริจาคเลือด ไม่แนะนำให้ดื่มแอลกอฮอล์หรือดื่มกาแฟ ออกกำลังกายหนักๆ หรือวิตกกังวล

จะทำการวิเคราะห์ที่ไหน?

ฉันจะไปตรวจหาเชื้อ HIV ได้ที่ไหน?

ELISA การวิเคราะห์อิมมูโนลอต ดำเนินการในคลินิกเอกชนในเมือง ให้ผลลัพธ์ภายในหนึ่งวัน การวินิจฉัยอย่างเร่งด่วนก็เป็นไปได้เช่นกัน ในสถาบันสาธารณะ การทดสอบทางการแพทย์ของ Elisa และ Western blot นั้นไม่มีค่าใช้จ่าย ตามกฎหมายของสหพันธรัฐรัสเซีย

การตรวจสอบบังคับสำหรับ โรคติดเชื้อสตรีมีครรภ์ และผู้ป่วยที่ต้องเข้ารับการรักษาในโรงพยาบาลหรือการผ่าตัด มีการดำเนินการอย่างไร?

วิธีการทำ ELISA ทำอย่างไร? Immunoblot บวก/ลบยืนยันหรือหักล้างผลลัพธ์ของเอลิซา ขั้นตอนค่อนข้างง่าย ผู้เชี่ยวชาญจะเจาะเลือดดำซึ่งใช้เวลาไม่ถึงห้านาที

หลังจากการสุ่มตัวอย่าง ควรฆ่าเชื้อบริเวณที่ฉีดและปิดด้วยผ้าพันแผล การสุ่มตัวอย่างจะดำเนินการในขณะท้องว่างดังนั้นหลังจากขั้นตอนนี้จะไม่เจ็บที่จะกินดาร์กช็อกโกแลตแท่งหรือเครื่องดื่มร้อนหวาน

หากต้องการรับการส่งตัวเข้ารับการตรวจฟรีที่สถานพยาบาล คุณต้องไปพบแพทย์

โดยทั่วไป อิมมูโนลอตไม่แตกต่างจากการตรวจเลือดอื่นๆ ตามการเก็บตัวอย่าง วิธีการวิจัยนั้นเรียบง่าย หากมีไวรัสอยู่ในเลือดของบุคคล ร่างกายจะเริ่มผลิตแอนติบอดีเพื่อทำลายไวรัส สำหรับไวรัสแต่ละตัวจะมีแอนติเจนโปรตีนจำนวนมาก การตรวจหาแอนติบอดีเหล่านี้เป็นพื้นฐานของวิธีการแบบ Western blot ราคา

การวิเคราะห์ใช้เวลานานเท่าใด? HIV immunoblot เป็นหนึ่งในการทดสอบที่ถูกที่สุด

โดยเฉลี่ยแล้ววิธีการคัดกรองอิมมูโนแอสเสย์อยู่ระหว่าง 500 ถึง 900 รูเบิล ส่วน Western blot คือการศึกษาการทดสอบซึ่งมีราคาตั้งแต่สามถึงห้าพันรูเบิล มากกว่า วิธีการที่ซับซ้อนมีราคาแพงกว่ามาก ตัวอย่างเช่น สำหรับการวิเคราะห์โพลีเมอเรส ปฏิกิริยาลูกโซ่(PCR) คุณจะต้องจ่ายประมาณ 12,000 รูเบิล

การตีความผลลัพธ์

วิธีการวินิจฉัยการติดเชื้อเอชไอวีที่พบบ่อยที่สุดคือการตรวจวิเคราะห์ด้วยเอนไซม์ที่เชื่อมโยงกับอิมมูโนซอร์เบนท์และอิมมูโนลอต

พวกมันถูกใช้เพื่อตรวจหาแอนติบอดีต่อไวรัสโรคภูมิคุ้มกันบกพร่องของมนุษย์ในซีรั่ม โดยปกติการติดเชื้อจะได้รับการยืนยันด้วยการทดสอบ 2 แบบ ได้แก่ การตรวจคัดกรองและการยืนยัน ผลลัพธ์จะต้องได้รับการตีความโดยแพทย์ผู้วินิจฉัยและสั่งการรักษา หากอิมมูโนลอตเป็นบวกก็หมายความว่าเป็นเช่นนั้น ร่างกายมนุษย์ไวรัส.

ผลลัพธ์ที่เป็นบวกไม่ควรมีเหตุผล การรักษาด้วยตนเองเนื่องจากผู้ป่วยแต่ละรายอาจมีภาพโรคของตนเอง

การวิเคราะห์เชิงคุณภาพรวมถึงการคัดกรองและการรับรอง หากตรวจไม่พบไวรัสในผู้ป่วย ผลที่ได้คือ “ผลลบ” เมื่อตรวจพบใบรับรองนี้ จะมีการคัดกรอง การวิจัยเพิ่มเติม- การวิเคราะห์อิมมูโนล็อต ซึ่งยืนยันหรือหักล้างการตรวจคัดกรอง หากแถบทดสอบปรากฏในบริเวณที่มืด (การแปลโปรตีนเป็นภาษาท้องถิ่น) จะทำการวินิจฉัยเอชไอวี

หากผลลัพธ์ไม่ชัดเจน จะทำการทดสอบภายในสามเดือน

เพื่อป้องกันการติดเชื้อไวรัสภูมิคุ้มกันบกพร่องในมนุษย์ เป็นไปได้หากคุณปฏิบัติตามกฎบางประการ: หลีกเลี่ยงการมีเพศสัมพันธ์แบบไม่เป็นทางการ ใช้ถุงยางอนามัยในระหว่างการสัมผัส ห้ามใช้ยา

หากตรวจพบโรคในหญิงตั้งครรภ์ควรปฏิบัติตามคำแนะนำของแพทย์ที่เข้ารับการรักษาและอย่าลืมตรวจหาเชื้อไวรัสด้วย

Western blotting คืออะไร?

การจำแนกโปรตีนในส่วนผสมที่ซับซ้อนหรือสารสกัดจากเนื้อเยื่อต่างๆ เป็นปัญหาหนึ่งที่พบบ่อย การใช้เครื่องมือ เช่น แอนติบอดีจำเพาะ ทำให้สามารถระบุโปรตีนภายใต้การศึกษาได้โดยใช้เวลาและต้นทุนทางการเงินน้อยที่สุด

ในวิธีการซับแบบตะวันตก ในระยะแรก ส่วนผสมของโปรตีนจะถูกแยกโดยอิเล็กโตรโฟรีซิสโดยมีโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS) จากนั้นจึงถ่ายโอนไปยังเมมเบรนไนโตรเซลลูโลสโดยอิเล็กโตรโฟเรซิส

สาระสำคัญของวิธีนี้คือหลังจากอิเล็กโตรโฟรีซิส เจลจะถูกวางบนเมมเบรนไนโตรเซลลูโลสระหว่างชั้นของกระดาษกรอง “แซนวิช” ที่ประกอบในลักษณะนี้จะถูกวางในสนามไฟฟ้าเพื่อให้คอมเพล็กซ์โปรตีน-SDS เคลื่อนที่ผ่านแผ่นเจลและถูกตรึงไว้ (อันเป็นผลมาจากการดูดซับแบบไม่จำเพาะ) บนพื้นผิวของเยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลส

การจับกันของโปรตีน-SDS เชิงซ้อนกับเมมเบรนไนโตรเซลลูโลสเกี่ยวข้องกับแรงที่มีลักษณะทางไฟฟ้าเป็นส่วนใหญ่ และปฏิกิริยานี้มีหลายจุดและนำไปสู่การ "แพร่กระจาย" ของโปรตีนบนพื้นผิวของเมมเบรน ดังนั้น หลังจากการถ่ายโอนด้วยไฟฟ้า เราจะได้แบบจำลองของเจลบนไนโตรเซลลูโลสที่มีโปรตีนอยู่ในลักษณะเดียวกับในเจลโพลีอะคริลาไมด์

หลังจากอิเล็กโตรโฟเรซิส SDS การถ่ายโอนด้วยไฟฟ้าและการดูดซับโปรตีนจากเจลไปยังเยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลส โครงสร้างตติยภูมิของโปรตีนจะเปลี่ยนไปอย่างมาก หากโดยทั่วไปถูกต้องที่จะพูดคุยเกี่ยวกับการมีอยู่ของโครงสร้างตติยภูมิของโปรตีนหลังจากการรักษาที่รุนแรงเช่นนี้ ดังนั้น สำหรับการตรวจหาโปรตีนทางอิมมูโนเคมีภายใต้การศึกษา โดยปกติจะใช้เฉพาะแอนติบอดีโมโนหรือโพลีโคลนอลแอนติบอดีที่จำเพาะต่อบริเวณเชิงเส้นของโมเลกุลโปรตีนเท่านั้น

51. เอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์, อิมมูโนลอตต์ กลไก ส่วนประกอบ การใช้งาน

แอนติบอดีจำเพาะสำหรับอีพิโทปที่มีโครงสร้าง (หรือบริเวณที่เกี่ยวข้องกับการสัมผัสระหว่างยูนิตย่อย) โดยทั่วไปไม่เหมาะสำหรับการใช้ในการซับแบบเวสเทิร์น

หลังจากการถ่ายโอนโปรตีน เมมเบรนจะถูกบ่มตามลำดับด้วยแอนติบอดีจำเพาะต่อโปรตีนภายใต้การศึกษา และจากนั้นด้วยแอนติบอดีทุติยภูมิซึ่งจำเพาะต่อชิ้นส่วน Fc ของแอนติบอดีปฐมภูมิ คอนจูเกตด้วยฉลากเอนไซม์ (หรืออื่นๆ) (รูปที่

1 ก) ในกรณีที่แอนติบอดีปฐมภูมิที่จำเพาะต่อแอนติเจนภายใต้การศึกษาถูกรวมเข้ากับฉลากโดยตรง ไม่จำเป็นต้องมีแอนติบอดีทุติยภูมิ (รูปที่ 1 B) คอมเพล็กซ์ภูมิคุ้มกันที่เกิดขึ้นในบริเวณที่มีการแปลโปรตีนภายใต้การศึกษานั้น "ปรากฏ" โดยใช้สารตั้งต้นของโครโมจีนิก (ขึ้นอยู่กับประเภทของฉลาก)

ความไวและความจำเพาะของวิธีการขึ้นอยู่กับแอนติบอดีที่ใช้ในการวิจัยอย่างมาก

แอนติบอดีที่ใช้ต้องมีความจำเพาะต่อลำดับกรดอะมิโนเฉพาะซึ่งเป็นลักษณะเฉพาะของโปรตีนที่กำลังศึกษาอยู่เท่านั้น มิฉะนั้น อาจเกิดปฏิกิริยาโต้ตอบ (โดยเฉพาะอย่างยิ่งในกรณีของสารสกัดโปรตีนหยาบ) ของแอนติบอดีที่มีโมเลกุลโปรตีนหลายโมเลกุลได้ ซึ่งจะนำไปสู่การปรากฏแถบสีหลายแถบบนเมมเบรน

การจำแนกโปรตีนภายใต้การศึกษาในกรณีนี้มักจะทำได้ยากหรือเป็นไปไม่ได้เลยด้วยซ้ำ

ปัจจัยสำคัญอันดับสองที่ต้องคำนึงถึงเมื่อเลือกแอนติบอดีคือความสัมพันธ์ ยิ่งความสัมพันธ์ของแอนติบอดีที่ใช้สูงเท่าไร แถบโปรตีนก็จะยิ่งสว่างและชัดเจนมากขึ้นเท่านั้น ความไวของวิธีการก็จะยิ่งสูงขึ้นตามไปด้วย เมื่อใช้แอนติบอดีที่มีสัมพรรคภาพสูง ความไวของ 1 ng หรือสูงกว่านั้นสามารถทำได้

เพื่อให้เห็นภาพผลลัพธ์ของปฏิสัมพันธ์ระหว่างแอนติเจนและแอนติบอดีที่จับกับเมมเบรน จะใช้แอนติบอดีทุติยภูมิ ควบคู่กับสารที่สามารถสร้างสัญญาณบางอย่างภายใต้เงื่อนไขบางประการได้

โดยทั่วไปแล้ว เอนไซม์ (เปอร์ออกซิเดสหรือฟอสฟาเตส) ถูกใช้เป็นสารดังกล่าว ผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาซึ่งมีสีและตกตะกอนบนเมมเบรนในรูปของตะกอนที่ไม่ละลายน้ำ

นอกจากนี้ยังสามารถใช้ฉลากเรืองแสงในวิธีนี้ได้อีกด้วย

ข้าว. 1. โครงการการย้อมสีอิมมูโนเคมีของโปรตีนภายใต้การศึกษา: A - การใช้แอนติบอดีทุติยภูมิที่เชื่อมต่อกับฉลากเอนไซม์ B - แอนติบอดีปฐมภูมิถูกเชื่อมต่อโดยตรงกับแท็กเอนไซม์

มาตรการ:

I. การเตรียมเจลและเมมเบรนและการถ่ายโอนโปรตีนด้วยไฟฟ้า

หลังจากอิเล็กโตรโฟรีซิส เจลโพลีอะคริลาไมด์จะถูกวางในอ่างที่มีบัฟเฟอร์สำหรับซับ (ทริส 25 มิลลิโมลาร์, pH 8.3, ไกลซีน 192 มิลลิโมลาร์, เอทานอล 10%)

กระดาษกรองสองแผ่นที่ตัดเป็นรูปทรงของตลับซับและชุบด้วยบัฟเฟอร์ซับจะถูกวางไว้บนส่วนของตลับที่จะหันไปทางขั้วบวก จากนั้นจึงวางเมมเบรนไนโตรเซลลูโลสที่ชุบบัฟเฟอร์ไว้ล่วงหน้าไว้บนกระดาษกรอง เพื่อให้แน่ใจว่าไม่มีฟองอากาศระหว่างเมมเบรนกับกระดาษ

จากนั้นควรวางเจลลงบนเมมเบรนอย่างระมัดระวัง โดยให้ความสนใจเป็นพิเศษอีกครั้งเพื่อให้แน่ใจว่าไม่มีฟองอากาศระหว่างเจลและเมมเบรน การก่อตัวของแซนวิชเสร็จสมบูรณ์ด้วยกระดาษกรองชุบน้ำสองชั้นซึ่งวางอยู่บนพื้นผิวของเจล (รูปที่ 2) แซนด์วิชที่ได้จะถูกยึดไว้ในคาสเซ็ตต์และวางไว้ระหว่างอิเล็กโทรดเพื่อให้เมมเบรนหันไปทางขั้วบวก

ข้าว. 2. โครงการถ่ายโอนโปรตีนด้วยไฟฟ้าไปยังเมมเบรน

ครั้งที่สอง การถ่ายโอนไฟฟ้า

การถ่ายโอนด้วยไฟฟ้าของโปรตีนไปยังเมมเบรนไนโตรเซลลูโลสจะดำเนินการในบัฟเฟอร์ที่ประกอบด้วย Tris 25 mM, pH 8.3, glycine 192 mM, เอทานอล 10% เป็นเวลา 30-50 นาทีที่แรงดันไฟฟ้าคงที่ 100 V

เวลาของการถ่ายโอนด้วยไฟฟ้าขึ้นอยู่กับขนาดของโปรตีนที่ถูกถ่ายโอน ยิ่งโปรตีนมีขนาดใหญ่เท่าไร การถ่ายโอนด้วยไฟฟ้าก็จะใช้เวลานานขึ้นเท่านั้น ประเมินคุณภาพของการถ่ายโอนด้วยไฟฟ้าและตำแหน่งของแถบโปรตีนโดยการย้อมเมมเบรนไนโตรเซลลูโลสด้วยสารละลาย Ponceau S 0.3% ใน 1% กรดน้ำส้ม- ก่อนการย้อมด้วยอิมมูโนเคมี ควรล้างเมมเบรนหลายครั้งด้วยความเป็นด่างอ่อน สารละลายที่เป็นน้ำทริสเพื่อขจัดสีย้อมที่จับกับโปรตีน

สาม. การย้อมสีทางอิมมูโนเคมีของโปรตีนที่ถูกตรึงบนเยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลส

ในการปิดกั้นตำแหน่งของการจับแอนติบอดีแบบไม่จำเพาะ เมมเบรนจะถูกบ่มด้วยการกวนอย่างต่อเนื่องที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาทีใน PBST (เพื่อการปิดกั้นที่ดีขึ้น สามารถใช้สารละลาย PBST ที่มีนมผงพร่องมันเนย 10% ได้)

หลังจากการปิดกั้น เมมเบรนจะถูกบ่มเป็นเวลาหนึ่งชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องโดยกวนอย่างต่อเนื่องใน PBST ที่มีแอนติบอดีจำเพาะ 1-10 ไมโครกรัม/มิลลิลิตร

ความเข้มข้นที่เหมาะสมที่สุดของแอนติบอดีจะถูกเลือกโดยการทดลองและขึ้นอยู่กับความสัมพันธ์ของอันตรกิริยาของแอนติบอดีกับแอนติเจน

ในตอนท้ายของการฟักตัว ให้ล้างเมมเบรน 5 ครั้งด้วย PBST แล้วถ่ายโอนไปยังสารละลายของแอนติบอดีทุติยภูมิที่เชื่อมต่อกับมะรุมเปอร์ออกซิเดส ผู้ผลิตมักจะระบุการเจือจางของคอนจูเกตบนบรรจุภัณฑ์ หรือเลือกโดยผู้วิจัย บ่มเมมเบรนในสารละลายแอนติบอดีทุติยภูมิเป็นเวลา 1 ชั่วโมงโดยคนอย่างต่อเนื่อง

หลังจากการล้างอย่างละเอียด (เปลี่ยนบัฟเฟอร์อย่างน้อย 5-6 ครั้ง) เมมเบรน PBST จะถูกถ่ายโอนไปยังสารละลายสารตั้งต้น chromogenic ที่ประกอบด้วย diaminobenzidine (DAB) 3 มก. และไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 30% 10 μlใน 10 มล. ของ 0.1 M Tris-HCl , pH 7.6.

การฟักตัวจะดำเนินการโดยกวนเป็นเวลา 5 - 10 นาที หลังจากการบ่มด้วยสารตั้งต้นเสร็จสมบูรณ์ ควรล้างเมมเบรนด้วย PBST เช็ดให้แห้งโดยใช้กระดาษกรอง และควรทำสำเนาอิเล็กทรอนิกส์ทันทีโดยการสแกนสี หากเมมเบรนแห้งสนิท แถบโปรตีนที่ทาสีจะจางลง และภาพจะมีความสว่างและคอนทราสต์น้อยลง

หมายเหตุ: DAB คือ สารพิษและอาจเป็นสารก่อมะเร็ง ใช้งานได้กับถุงมือยางเท่านั้น!

Immunoblotting เป็นขั้นตอนการวินิจฉัยที่ดำเนินการในห้องปฏิบัติการซึ่งผลลัพธ์จะเปิดเผยแอนติบอดีต่อเชื้อโรค โรคต่างๆ- หนึ่งในนั้นคือไวรัสภูมิคุ้มกันบกพร่องของมนุษย์ เป็นที่น่าสังเกตทันทีว่ามีการศึกษาเช่น immunoblotting สำหรับ HIV กิจกรรมเพิ่มเติมซึ่งกำหนดไว้เพื่อยืนยันผล ELISA ที่เป็นบวก

ไวรัสโรคภูมิคุ้มกันบกพร่องของมนุษย์เป็นการติดเชื้อที่ลุกลามอย่างช้าๆ นับตั้งแต่เวลาที่เชื้อโรคเข้าสู่ร่างกายจนกระทั่งมีอาการแรกเกิดขึ้น มักจะผ่านไปค่อนข้างนานซึ่งอาจนานหลายปี

บน ชั้นต้นการพัฒนา อาการทางคลินิกอาจจะหายไป การเพิ่มขึ้นของอุณหภูมิโดยทั่วไป, อาการป่วยไข้, เจ็บคอ, ลักษณะอาการของการติดเชื้อเอชไอวีจะสับสนโดยผู้ที่เป็นไข้หวัด แต่การติดเชื้อยังคงดำเนินไป ดังนั้นผู้เชี่ยวชาญที่ศูนย์เอชไอวีแนะนำให้ทำการวินิจฉัยที่ครอบคลุมในกรณีต่อไปนี้:

• หากคุณมีเพศสัมพันธ์โดยไม่มีการป้องกันกับคู่ครองใหม่
• หากมีการใช้เข็มฉีดยาหรือเข็มทางการแพทย์แบบใช้แล้วทิ้งซ้ำ
• หากคุณเพิ่งมีรอยสักหรือเจาะ
• หากตรวจพบการติดเชื้ออื่นเส้นทางการแพร่เชื้อทางเพศ (เช่นซิฟิลิส, ภาวะช่องคลอดอักเสบจากเชื้อแบคทีเรีย, โรคหนองใน);
• หากมีการสัมผัสกับผู้ติดเชื้อ

Immunoblot สำหรับ HIV ดำเนินการโดยใช้ซีรั่มหรือพลาสมา การศึกษาในหนึ่งแถบต้องใช้เลือด 1.5-2 มล. หรือซีรั่ม 15-25 ไมโครลิตร

การทดสอบวินิจฉัยทำให้สามารถตรวจพบแอนติบอดีไม่เพียงแต่กับไวรัสโรคภูมิคุ้มกันบกพร่องของมนุษย์เท่านั้น แต่ยังรวมถึงเชื้อโรคอื่นๆ ด้วย ในระหว่างการศึกษาจะใช้ชุดอุปกรณ์พิเศษเฉพาะสำหรับโรคต่างๆ เช่น

• HSV1 และ HSV2 IgM/IgG (เพื่อตรวจหาการติดเชื้อไวรัสเริม);
• โปรไฟล์ TORCH IgM (เพื่อตรวจหาท็อกโซพลาสโมซิส, หัดเยอรมัน, การติดเชื้อไซโตเมกาโลไวรัส, HSV 1 และ HSV 2);
• EBV IgMTIgG (เพื่อตรวจหาการติดเชื้อไวรัส Epstein-Barr);
• HCV IgG (เพื่อตรวจหา ไวรัสตับอักเสบประเภทค)

ผลลัพธ์ของอิมมูโนลอตต์อาจเป็นค่าบวก (เมื่อตรวจพบแอนติบอดี) และค่าลบ (เมื่อไม่มีแอนติบอดีในวัสดุทางชีวภาพ) เช่นเดียวกับผลบวกที่ไม่แน่นอน ผลบวกลวง และผลลบลวง

คุณสามารถตรวจหาการติดเชื้อไวรัสได้ที่ไหน และต้องทำอย่างไรต่อไป?

แต่ละคลินิก ห้องปฏิบัติการส่วนตัว โรงพยาบาล คลินิกมีความเชี่ยวชาญในการตรวจวินิจฉัยดังกล่าว คุณสามารถเข้ารับการตรวจได้ที่ศูนย์ตรวจเอชไอวี คลินิกเอกชนบางแห่งให้คำปรึกษาและตรวจโรคเอดส์และเอชไอวีที่บ้าน

สำคัญ! หลังจากได้รับผลการศึกษาแล้ว คุณต้องติดต่อแพทย์เพื่อสั่งการรักษาที่เหมาะสม

การทดสอบเชิงบวก

หากผลอิมมูโนลอตเป็นบวก ไม่ได้หมายความว่าการติดเชื้อเอชไอวีกำลังพัฒนาในร่างกาย เพื่อยืนยันการวินิจฉัยจึงมีการกำหนดการศึกษาอื่น ๆ เช่นอิมมูโนฟลูออเรสเซนต์ทางอ้อม

แม้ว่าวิธีอิมมูโนลอตจะมีความไวสูง แต่เนื่องจากการตรวจหาอิมมูโนโกลบูลินคลาส G ผลบวกลวงก็เป็นไปได้ใน 3 สัปดาห์แรกหลังการติดเชื้อ ในกรณีนี้ ให้ทำการทดสอบซ้ำหลังจากช่วงระยะเวลาหนึ่ง

ไม่ทราบสาเหตุทั้งหมดในการได้รับผลบวกลวง แหล่งที่มาที่พบบ่อยที่สุดคือการตั้งครรภ์และการให้วัคซีนกดภูมิคุ้มกันเมื่อเร็วๆ นี้ หากผ่านไประยะหนึ่งหลังจากได้รับปัจจัยดังกล่าวแล้ว immunoblot สำหรับ HIV ยังคงเป็นบวก นั่นหมายความว่าบุคคลนั้นติดเชื้อ

ผลลัพธ์เชิงลบ

อิมมูโนลอตอาจให้ผลลบซึ่งส่งสัญญาณว่าไม่มีแอนติบอดีต่อการติดเชื้อเอชไอวีในร่างกายและผลที่ตามมาคือ มีสุขภาพแข็งแรงสมบูรณ์.

มักพบอิมมูโนลอตเชิงลบในช่วง "ช่วงหน้าต่าง" (3 เดือนแรกระหว่างการติดเชื้อและการปรากฏตัวของแอนติบอดีในเลือด) ในช่วงเวลานี้ การทดสอบจะไม่ตรวจพบแอนติบอดีที่เกี่ยวข้อง แต่สามารถตรวจพบได้ในของเหลวอื่นๆ (อสุจิ ตกขาว) ในปริมาณมาก

การวิเคราะห์ดำเนินการอย่างไร?

Immunoblot ช่วยให้สามารถระบุแอนติบอดีได้โดยการตรวจเลือดและใช้เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส

ประการแรกเซลล์แบคทีเรียหรือ virions จะถูกทำลายด้วยอัลตราซาวนด์ หลังจากนั้นแอนติเจนทั้งหมดของไวรัสหรือเซลล์แบคทีเรียจะถูกแยกออกด้วยอิเล็กโตรโฟรีซิส ผลลัพธ์ที่ได้คือรีเอเจนต์เชิงพาณิชย์วางอยู่บนฟิล์มไนโตรเซลลูโลสชนิดพิเศษ

ในระหว่างอิมมูโนลอตต์ เซรั่มทดสอบจะถูกนำไปใช้กับวัสดุที่มีแอนติเจนที่รู้จักด้วย หลังจากการฟักตัวและการล้างแอนติบอดีที่ไม่ถูกผูกไว้ จะเริ่มการทดสอบอิมมูโนซอร์เบนท์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ อิมมูโนโกลบูลินซึ่งมีป้ายกำกับว่าเอนไซม์ และสารตั้งต้นของโครโมจีนิกซึ่งเปลี่ยนสีเมื่อสัมผัสกับเอนไซม์จะถูกนำไปใช้กับซีรั่ม

หากมีแอนติบอดี จะมีจุดเกิดขึ้นบนพาหะ

ตัวอย่างเลือดจะใช้ในการดำเนินการกระตุ้นภูมิคุ้มกันสำหรับเอชไอวี

วิธีการเชิงเส้น

Linear blot สำหรับ HIV คือการทดสอบทางภูมิคุ้มกันทางอ้อมซึ่งเป็นวิธีการสร้างตัวบ่งชี้เชิงคุณภาพของ autoantibodies ในระดับ IgG

ในระหว่างการวิจัยทางภูมิคุ้มกันวิทยา มีการใช้สารไวรัสหรือแอนติเจนในรูปแบบเอชไอวี ในห้องปฏิบัติการ โปรตีนของเอชไอวีจะถูกรวมเข้ากับแอนติบอดีแต่ละตัวที่ได้รับจากซีรัมในเลือด ถัดไป การฟักตัวจะดำเนินการโดยการเพิ่มแอนติบอดีที่มีป้ายกำกับและอิมมูโนโกลบูลินของมนุษย์

การวินิจฉัยเอชไอวีในทารกแรกเกิด

ในร่างกายของเด็กอายุต่ำกว่า 9 เดือนที่เกิดจากผู้หญิงที่ติดเชื้อมีแอนติบอดีต่อเอชไอวีของแม่ซึ่งทำให้เกิดผลบวกลวง ELISA ด้วยเหตุนี้จึงให้ความสำคัญกับการทดสอบทางไวรัสวิทยา - การวิเคราะห์เชิงปริมาณของ RNA และ DNA PCR วิธีการเพาะเลี้ยงเพื่อวินิจฉัยการติดเชื้อมีความละเอียดอ่อนมากกว่า

สำคัญ! ข้อบ่งชี้ในการดำเนินมาตรการวินิจฉัยเพื่อตรวจหาการติดเชื้อเอชไอวีในทารกแรกเกิด ได้แก่ การเกิดของสตรีที่ติดเชื้อซึ่งได้รับผลลัพธ์ที่น่าสงสัยจากการวิเคราะห์ที่ดำเนินการก่อนหน้านี้

การทดสอบการตั้งครรภ์

เนื่องจากการติดเชื้อเอชไอวีที่เกิดขึ้นในหญิงตั้งครรภ์สามารถแพร่เชื้อไปยังทารกในครรภ์ได้จึงเป็นสิ่งจำเป็น การวินิจฉัยเบื้องต้นสำหรับไวรัสภูมิคุ้มกันบกพร่อง

ประการแรก การทดสอบแบบคัดกรองด้วยเอนไซม์ที่เชื่อมโยงกับอิมมูโนซอร์เบนท์จะใช้เป็นการทดสอบแบบคัดกรอง มาตรการวินิจฉัยช่วยในการตรวจหาแอนติบอดีต่อการติดเชื้อในเลือด แม้ว่าผลลัพธ์การวิเคราะห์จะแม่นยำในระหว่างตั้งครรภ์ แต่ก็จำเป็นต้องมีการทดสอบซ้ำ

ELISA ชนิดหนึ่งคือ immunoblotting ซึ่งมักใช้ในระหว่างตั้งครรภ์ จากผลการวินิจฉัย สามารถระบุแอนติบอดีต่อแอนติเจนบางชนิดได้ ซึ่งกระจายตามน้ำหนักโมเลกุลโดยใช้อิเล็กโตรโฟรีซิส

ทำอย่างไรจึงจะผ่านการทดสอบได้อย่างถูกต้อง

ซับภูมิคุ้มกันต้องมีการตรวจเอชไอวี การฝึกอบรมพิเศษเช่นเดียวกับวิธีอื่นๆ ในการวินิจฉัยโรค หากคุณสามารถทำการศึกษาและรับผลลัพธ์ของตัวชี้วัดบางอย่างได้ตลอดทั้งวัน (เช่น การตอบสนองต่อสารก่อภูมิแพ้) คุณจะต้องบริจาคเลือดเพื่อตรวจภูมิคุ้มกันในตอนเช้าเท่านั้น

ถอดรหัสผลลัพธ์

การถอดรหัสผลลัพธ์ของอิมมูโนลอตดำเนินการโดยเจ้าหน้าที่ห้องปฏิบัติการ หากตรวจพบโปรตีน HIV-1 หรือ HIV-2 2 ใน 3 แสดงว่าร่างกายมีการติดเชื้อที่เกี่ยวข้อง การศึกษานี้ดำเนินการเพื่อยืนยันเอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์ที่เป็นบวก ดังนั้น ปฏิกิริยาจึงได้รับการทดสอบสำหรับโปรตีน เช่น gp120/160, gp41 ร่วมกับ p24 ด้วย ส่วนหลังเป็นส่วนหนึ่งของยีนเอดส์สามยีน - gag pol และ env

การแสดงแผนผังของผลการตรวจภูมิคุ้มกันบกพร่องของเอชไอวี

การวินิจฉัยเบื้องต้นเกี่ยวข้องกับการศึกษาโปรตีน p25, gp110/120 และ gp160 โดยระบุ ระยะเริ่มต้นการพัฒนาของโรค หากอิมมูโนแอสเสย์ของเอนไซม์ทางเซรุ่มวิทยาตัวที่สองให้ผลลัพธ์ที่เป็นบวก จะทำอิมมูโนลอต หากอย่างหลังให้ผลบวก การวินิจฉัยโรคเอชไอวีจะได้รับการยืนยัน

ความน่าจะเป็นของผลบวกขึ้นอยู่กับระยะเวลาที่ผ่านไปจากช่วงเวลาที่ติดเชื้อจนถึงการวินิจฉัย:

• หลังจาก 28 วัน – 60-65%;
• หลังจาก 42 วัน – 80%;
• หลังจาก 56 วัน – 90%;
• หลังจาก 84 วัน – 95%

ผลบวกลวงอาจเกิดขึ้นได้หากดำเนินการรวบรวมวัสดุทางชีวภาพเพื่อการวินิจฉัยต่อไปในระหว่างตั้งครรภ์หาก ระดับฮอร์โมนการปราบปรามการทำงานของระบบภูมิคุ้มกันในระยะยาวด้วยยาบางชนิดที่บุคคลรับประทาน

เกณฑ์การประเมินการวิเคราะห์

ผลลัพธ์ของ ELISA และการวิเคราะห์อิมมูโนลอตต์ต้องเป็นไปตามเกณฑ์ต่อไปนี้:

• รอยเปื้อนของวัสดุชีวภาพภายใต้การศึกษาเกิดขึ้นพร้อมกันกับรอยเปื้อนของตัวอย่างอ้างอิง
• น้ำหนักโมเลกุลของส่วนประกอบหลักที่ระบุนั้นตรงตามข้อกำหนดข้อกำหนด

ผลลัพธ์ที่ได้ในห้องปฏิบัติการเฉพาะทางจะแม่นยำที่สุด

สิ่งเจือปนที่ตรวจพบและเนื้อหาต้องเป็นไปตามข้อกำหนดของใบรับรองสำหรับวัสดุอ้างอิง

ผลลัพธ์ที่ไม่สามารถตีความได้

ในบางกรณี immunoblotting สำหรับ HIV และ AIDS ไม่สอดคล้องกับผลลัพธ์เชิงลบและบวกและแพทย์ไม่สามารถระบุได้ เหตุผลที่แท้จริงข้อมูลที่น่าสงสัย สาเหตุของการตีความที่ผิดมักเกิดจากการติดเชื้อที่เกิดจากซีโรไทป์อื่น

เพื่อขจัดข้อสงสัย PCR และ ELISA จะดำเนินการในลักษณะไดนามิก ในกรณีที่ไม่มีอาการของโรคเป็นเวลาหกเดือนและไม่มีปัจจัยเสี่ยงพวกเขาพูดถึงสุขภาพที่สมบูรณ์ ที่เวทีนี้ มาตรการวินิจฉัยกำลังสำเร็จการศึกษา

ผลลัพธ์ที่น่าสงสัยยังสามารถเกิดขึ้นได้หากมีโรคติดเชื้อ มะเร็ง หรืออาการแพ้อื่นเกิดขึ้นในร่างกาย

สำคัญ! หากผลลัพธ์ออกมาน่าสงสัย บุคคลนั้นไม่สามารถเป็นผู้บริจาคเลือดหรือวัสดุทางชีวภาพอื่นๆ ได้

ข้อผิดพลาดทั่วไปเมื่อวินิจฉัยการติดเชื้อเอชไอวี

การรวบรวมวัสดุชีวภาพ การส่งมอบ และการประมวลผลของวัสดุที่ใช้ในการวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการจะต้องเป็นไปตามกฎต่อไปนี้:

1. เอกสารประกอบที่จัดทำขึ้นระบุชื่อของระบบทดสอบ วันหมดอายุ และชุดข้อมูล
2. รายละเอียดหนังสือเดินทางของวัตถุ วันที่ และสถานที่รวบรวมวัสดุชีวภาพนั้นระบุไว้อย่างครบถ้วน
3. ซีรั่มไม่นานอีกต่อไป วันกำหนดส่งปริมาตรที่อนุญาตของวัสดุชิ้นเนื้อที่ได้รับอนุญาตสำหรับการศึกษา - อย่างน้อย 2-5 มล.
4. ตัวเลขบนขวดตรงกับตัวเลขที่ระบุในทิศทาง
5. การรวบรวมวัสดุชีวภาพเกิดขึ้นตามกฎที่กำหนดไว้คือจากหลอดเลือดดำท่อนใน เลือดที่จะทดสอบไม่ควรมีลิ่มเลือด

ใช้หลอดทดลองแบบแห้งเพื่อรวบรวมวัสดุ ทารกแรกเกิดมักถูกพาตัวไป เลือดจากสายสะดือแสดงให้เห็นข้อเท็จจริงดังกล่าวไปในทิศทางนั้น

ข้อผิดพลาดทั่วไปที่ทำโดยแพทย์คือเก็บวัสดุที่ได้ไว้นานกว่า 12 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องและนานกว่า 1 วันที่อุณหภูมิ 4-8 องศาเซลเซียส เนื่องจากเริ่มมีอาการของเม็ดเลือดแดงแตกผลของขั้นตอนการวินิจฉัยจึงบิดเบี้ยว

ดังนั้น ข้อผิดพลาดทั่วไปในการวินิจฉัยการติดเชื้อ HIV ได้แก่:

• การรวบรวมวัสดุชีวภาพที่ไม่เหมาะสม
• การจัดเก็บวัสดุชิ้นเนื้อที่ไม่เหมาะสม
• การขนส่งระบบวินิจฉัยที่ไม่เหมาะสม
• การจัดเก็บระบบทดสอบในระยะยาว

ผลลัพธ์ที่ได้ยังได้รับผลกระทบจากคุณภาพของน้ำที่ใช้ในการล้างภาชนะที่ใส่วัสดุชีวภาพไว้ด้วย

หลังจากได้รับผลการตรวจแล้วเจ้าหน้าที่ห้องปฏิบัติการจะต้องสรุปผลให้แพทย์ทราบ หากทำการวินิจฉัยในช่วง "ช่วงกรอบเวลา" เขาจะสั่งให้ทำการวินิจฉัยซ้ำหลังจากช่วงระยะเวลาหนึ่ง ไม่ว่าในกรณีใด การวินิจฉัยการติดเชื้อเอชไอวี อิมมูโนล็อตหนึ่งอันไม่เพียงพอ จำเป็นต้องมีการวินิจฉัยที่ครอบคลุม

ในการปฏิบัติงานของการวินิจฉัยทางห้องปฏิบัติการของโรคติดเชื้อบางครั้งมีความจำเป็นต้องตรวจสอบแอนติบอดีที่ไม่ใช่เชื้อโรคโดยทั่วไป แต่สำหรับโปรตีนบางชนิด (แอนติเจน) นั่นคือสเปกตรัมของแอนติบอดีจำเพาะ หากใช้วิธีการทดสอบอิมมูโนซอร์เบนท์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์เพื่อจุดประสงค์นี้ ในกรณีนี้จำเป็นต้องแยกและทำให้แอนติเจนที่จำเป็นบริสุทธิ์จากการเพาะเลี้ยงเชื้อโรคก่อน โปรตีนที่ได้จะถูกนำไปใช้แยกกันกับเฟสของแข็ง ในกรณีที่ใช้เพลต 96 หลุม แต่ละหลุมจะมีแอนติเจน 1 ชนิด จากนั้นแอนติบอดีจำเพาะจะถูกกำหนดโดยวิธีทางอ้อม

เมื่อมีปฏิกิริยาเชิงบวกในบ่อกับแอนติเจนเฉพาะ เราสามารถตัดสินการมีอยู่ของแอนติบอดีจำเพาะที่สอดคล้องกันได้ บริษัทผู้ผลิตนำเสนอระบบการทดสอบอิมมูโนเอ็นไซม์ประเภทนี้ แต่วิธีอิมมูโนบล็อกติง (Western blot) เริ่มแพร่หลายเนื่องจากมีข้อมูลมากกว่าและดำเนินการทดสอบได้ง่าย

การซับภูมิคุ้มกันช่วยให้คุณตรวจแอนติบอดีในซีรั่มในเลือดพร้อมกันและในเวลาเดียวกันก็แยกความแตกต่างจากการวินิจฉัยทั้งหมด โปรตีนที่สำคัญเชื้อโรค การแปลจากภาษาอังกฤษ Western blot หมายถึงการถ่ายโอนแบบตะวันตก (ตัวอักษร - blotting) ประวัติความเป็นมาของคำที่ไม่ธรรมดานี้มีดังนี้

ในปี 1975 นักวิทยาศาสตร์ชื่อ E. Southern ได้เสนอวิธีการถ่ายโอนชิ้นส่วน DNA ที่แยกด้วยไฟฟ้าจากเจลไปยังเมมเบรนเป็นครั้งแรก ตามที่ผู้เขียนระบุ วิธีการนี้เรียกว่า Southern blot ซึ่งแปลว่า "การโอนเงินทางใต้" ในทางกลับกันวิธีการถ่ายโอนโมเลกุล RNA ได้รับฉายาโดยผู้เชี่ยวชาญ Northern blot - "การถ่ายโอนทางเหนือ" ตอนแรกเป็นเรื่องตลกแล้วชื่อนี้ก็ได้รับการยอมรับในวรรณกรรมทางวิทยาศาสตร์อย่างเป็นทางการ

ในปี 1979 G. Towbin ตีพิมพ์ผลการทดลองครั้งแรกเกี่ยวกับการซับโปรตีน เพื่อความต่อเนื่องของประเพณีของชื่อ "ทางภูมิศาสตร์" สำหรับวิธีการถ่ายโอนโมเลกุลทางชีววิทยาวิธีนี้เริ่มถูกเรียกว่าการถ่ายโอนแบบ "ตะวันตก" - Western blot

ขั้นตอนแรกของวิธีนี้เกี่ยวข้องกับการแยกอิเล็กโตรโฟเรติกของส่วนผสมของโปรตีนของเชื้อโรคในเจลโพลีอะคริลาไมด์โดยมีโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต (SDS) อยู่ด้วย DSN เป็นเพียงผิวเผิน สารออกฤทธิ์ห่อหุ้มโมเลกุลโปรตีนเท่าๆ กัน และให้ประจุลบทั้งหมดที่มีขนาดเท่ากันโดยประมาณ ดังนั้นโมเลกุลจึงเคลื่อนที่ในสนามไฟฟ้าในทิศทางเดียว และความเร็วของการเคลื่อนที่ขึ้นอยู่กับขนาดของโมเลกุล (น้ำหนักโมเลกุล) ของโปรตีนเท่านั้น

อันเป็นผลมาจากขั้นตอนอิเล็กโตรโฟเรติกจะได้แผ่นเจลซึ่งมีความหนาซึ่งโปรตีนอยู่ในรูปแบบของโซนเชิงเส้นบาง ๆ ที่แยกจากกัน ตามทิศทางของการเคลื่อนไหวพวกมันจะถูกแบ่งตามลำดับต่อไปนี้: โปรตีนที่มีน้ำหนักโมเลกุลขนาดใหญ่ประมาณ 120-150 kDa ตั้งอยู่ใกล้กับจุดเริ่มต้นมากขึ้น และโปรตีนที่มีมวล 5-10 kDa ได้เคลื่อนตัวไปไกลที่สุดไปยัง เส้นชัย. ในขั้นตอนที่สอง แผ่นเจลจะถูกวางบนแผ่นไนโตรเซลลูโลส และวางโครงสร้างนี้ไว้ระหว่างอิเล็กโทรดของแหล่งกำเนิดไฟฟ้ากระแสตรง ภายใต้อิทธิพลของสนามไฟฟ้า โปรตีนจะไหลจากเจลที่มีรูพรุนไปยังเมมเบรนที่มีความหนาแน่นมากขึ้น ซึ่งพวกมันจะถูกยึดไว้อย่างแน่นหนา

ผลลัพธ์ที่ได้จะได้รับการบำบัดด้วยสารละลายปิดกั้นซึ่งประกอบด้วยโปรตีนที่ไม่แยแสต่อแอนติเจนและ/หรือผงซักฟอกที่ไม่มีประจุ (Tween 20) ซึ่งจะปิดกั้นตำแหน่งที่ปราศจากแอนติเจนบนเมมเบรน จากนั้นแผ่นเมมเบรนจะถูกตัดเป็นแถบแคบๆ เพื่อให้แต่ละแถบมีเศษส่วนของแอนติเจนทั้งหมด ขั้นตอนที่อธิบายไว้ดำเนินการโดยผู้ผลิต

ระบบทดสอบเชิงพาณิชย์สำหรับการตรวจหาแอนติบอดีโดยใช้อิมมูโนลอตติ้งมีแถบ (แถบหรือแถบ) ที่พร้อมสำหรับการทดสอบ ผู้ใช้กำหนดสเปกตรัมทั้งหมดของแอนติบอดีจำเพาะต่อโปรตีนของเชื้อโรคโดยใช้วิธีทางอ้อม สารไม่มีสีที่ละลายน้ำได้นั้นถูกใช้เป็นโครโมเจนในการทำปฏิกิริยาสี (เอนไซม์) ซึ่งผลิตภัณฑ์ที่ได้สีนั้นจะไม่ละลายน้ำและตกตะกอน (ตกตะกอน) บนไนโตรเซลลูโลส

อันเป็นผลมาจากปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันและเอนไซม์ตามลำดับเมื่อมีแอนติบอดีต่อโปรตีนของเชื้อโรคในตัวอย่างทดสอบแถบขวางสีเข้มจะปรากฏบน blot ซึ่งตำแหน่งซึ่งอยู่ในโซนของโปรตีนของเชื้อโรคบางชนิด แต่ละแถบดังกล่าวบ่งชี้ถึงการมีอยู่ของแอนติบอดีจำเพาะต่อแอนติเจนที่สอดคล้องกัน ผลการศึกษาที่ดำเนินการโดย immunoblotting จะได้รับในรูปแบบของรายการแอนติบอดีต่อโปรตีนจำเพาะของเชื้อโรค ตัวอย่างเช่น: “ตรวจพบแอนติบอดีต่อโปรตีน p17 และ p24”

ไนโตรเซลลูโลสบล็อตสามารถเก็บไว้ให้แห้งได้เป็นเวลานานหลังการพัฒนา อย่างไรก็ตาม ความเข้มของสีจะลดลงอย่างมาก สามารถถ่ายภาพรอยเปื้อนเปียกหรือภาพกราฟิกสามารถป้อนลงในหน่วยความจำของคอมพิวเตอร์ส่วนบุคคลโดยใช้สแกนเนอร์ โปรแกรมคอมพิวเตอร์พิเศษช่วยให้คุณสามารถประมวลผลผลลัพธ์และตรวจสอบการเปลี่ยนแปลงของสเปกตรัมแอนติบอดีได้อย่างรวดเร็วในระหว่างการสังเกตแบบไดนามิก

Immunoblotting (อิมมูโนล็อตติ้ง) เป็นวิธีอ้างอิงที่เฉพาะเจาะจงและมีความไวสูงที่ยืนยันการวินิจฉัยสำหรับผู้ป่วยที่มีผลการทดสอบเป็นบวกหรือไม่แน่นอน รวมถึง ใช้ RPGA หรือ ELISA .

วิธีการตรวจหาแอนติบอดีต่อแอนติเจนแต่ละตัวของเชื้อโรคนี้ขึ้นอยู่กับการดำเนินการ ELISA บนเยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลส ซึ่งใช้โปรตีนจำเพาะในรูปแบบของแถบแยกกัน โดยแยกจากกันด้วยเจลอิเล็กโตรโฟรีซิส หากมีแอนติบอดีต่อแอนติเจนบางชนิด เส้นสีเข้มจะปรากฏขึ้นในบริเวณที่สอดคล้องกันของแถบ ความเป็นเอกลักษณ์ของอิมมูโนลอตอยู่ที่เนื้อหาข้อมูลที่สูงและความน่าเชื่อถือของผลลัพธ์ที่ได้รับ

วัสดุสำหรับการวิจัยคือซีรัมหรือพลาสมาของมนุษย์ สำหรับการวิจัยในหนึ่งแถบ ต้องใช้เลือด 1.5-2 มล. หรือซีรั่ม 15-25 ไมโครลิตร

ตามคำแนะนำของ WHO มีการใช้ immunoblotting (Western blot) ในการวินิจฉัยการติดเชื้อ HIV เป็นวิธีการของผู้เชี่ยวชาญเพิ่มเติมซึ่งควรยืนยันผลลัพธ์ของ ELISA โดยทั่วไปแล้ว วิธีการนี้จะตรวจสอบผลลัพธ์ ELISA ที่เป็นบวกอีกครั้ง เนื่องจากถือว่ามีความละเอียดอ่อนและเฉพาะเจาะจงมากกว่า แม้ว่าจะซับซ้อนและมีราคาแพงกว่าก็ตาม

อิมมูโนล็อตติ้งเป็นการผสมผสานการตรวจวิเคราะห์อิมมูโนซอร์เบนท์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ (ELISA) เข้ากับการแยกโปรตีนไวรัสด้วยไฟฟ้าเบื้องต้นในเจล และถ่ายโอนไปยังเยื่อหุ้มไนโตรเซลลูโลส ขั้นตอนอิมมูโนลอตประกอบด้วยหลายขั้นตอน ประการแรก เอชไอวีซึ่งก่อนหน้านี้ทำให้บริสุทธิ์และถูกทำลายไปเป็นส่วนประกอบต่างๆ จะถูกอิเล็กโตรโฟเรซิส และแอนติเจนทั้งหมดที่รวมอยู่ในไวรัสจะถูกแยกออกจากกันด้วยน้ำหนักโมเลกุล จากนั้นโดยใช้วิธีการซับ แอนติเจนจะถูกถ่ายโอนจากเจลไปยังแถบไนโตรเซลลูโลสหรือตัวกรองไนลอน ซึ่งขณะนี้มีสเปกตรัมของโปรตีนที่มีลักษณะเฉพาะของ HIV ซึ่งมองไม่เห็นด้วยตา ถัดไป วัสดุทดสอบ (ซีรั่ม พลาสมาในเลือดของผู้ป่วย ฯลฯ) จะถูกนำไปใช้กับแถบ และหากมีแอนติบอดีจำเพาะในตัวอย่าง พวกมันจะจับกับแถบโปรตีนแอนติเจนที่สอดคล้องกับพวกมันอย่างเคร่งครัด อันเป็นผลมาจากการปรับเปลี่ยนในภายหลัง (คล้ายกับ ELISA) ผลลัพธ์ของการโต้ตอบนี้จะถูกมองเห็น - ทำให้มองเห็นได้ การมีอยู่ของแถบในบางพื้นที่ของแถบเป็นการยืนยันการมีอยู่ของซีรั่มของแอนติบอดีที่ทดสอบแล้วเพื่อกำหนดแอนติเจนของเอชไอวีอย่างเคร่งครัด

Immunoblotting มักใช้เพื่อยืนยันการวินิจฉัยการติดเชื้อเอชไอวี WHO พิจารณาซีรั่มเชิงบวกที่ตรวจพบแอนติบอดีต่อโปรตีนซอง HIV สองชนิดใดๆ ก็ตามโดยวิธีอิมมูโนบลูตต์ ตามคำแนะนำเหล่านี้ หากมีปฏิกิริยากับโปรตีนซองจดหมายเพียงตัวเดียว (gp160, gp120, gp41) ร่วมกันหรือไม่มีปฏิกิริยากับโปรตีนอื่น ๆ ถือว่าผลลัพธ์เป็นที่น่าสงสัยและแนะนำให้ทำการทดสอบซ้ำโดยใช้ชุดอุปกรณ์จาก ซีรีส์อื่นหรือจากบริษัทอื่น หากแม้หลังจากนี้ผลลัพธ์ยังคงเป็นที่น่าสงสัย การศึกษาจะดำเนินต่อไปทุกๆ 3 เดือน

ลักษณะเฉพาะ

การวิเคราะห์ Immunoblot เป็นวิธีที่เชื่อถือได้ซึ่งช่วยให้คุณตรวจสอบการมีอยู่ของแอนติบอดีต่อแอนติเจนของ HIV ในประเภทที่หนึ่งและสอง หากบุคคลติดเชื้อ แอนติบอดีจะปรากฏขึ้นภายในสองสัปดาห์ ซึ่งสามารถตรวจพบได้ในภายหลัง ลักษณะเฉพาะของเอชไอวีคือปริมาณแอนติบอดีเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วและยังคงอยู่ในเลือดของผู้ป่วย แม้ว่าจะมีอยู่ แต่โรคนี้อาจไม่ปรากฏให้เห็นเป็นเวลาสองปีหรือมากกว่านั้น วิธี ELISA ไม่สามารถระบุการมีอยู่ของโรคได้อย่างแม่นยำเสมอไป ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีการยืนยันผลลัพธ์โดยใช้อิมมูโนล็อตติงและ PCR หากเอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์แสดงผลลัพธ์ที่เป็นบวก

บ่งชี้ในการใช้งาน

มีการค้นพบ “อิมมูโนล็อต” แล้วคืออะไร แต่การศึกษานี้กำหนดไว้เพื่อใคร? เหตุผลในการเข้ารับการตรวจไวรัสเอชไอวี (HIV) โดยใช้วิธีอิมมูโนลอตต์นั้นเป็นผลบวกของ ELISA จำเป็นต้องเข้ารับการตรวจเอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์สำหรับผู้ป่วยที่จะเข้ารับการผ่าตัด นอกจากนี้ ผู้หญิงที่วางแผนจะตั้งครรภ์และใครก็ตามที่สำส่อนควรได้รับการทดสอบด้วย Immunoblotting ถูกกำหนดให้กับผู้ป่วยที่ติดเชื้อ HIV หากผล ELISA มีข้อสงสัย

อาการที่น่าตกใจต่อไปนี้อาจเป็นเหตุผลที่ควรปรึกษาแพทย์:

• การลดน้ำหนักอย่างกะทันหัน
• ความอ่อนแอ, การสูญเสียประสิทธิภาพ;
• อารมณ์เสียในลำไส้ (ท้องร่วง) ที่กินเวลาสามสัปดาห์;
• การคายน้ำของร่างกาย
• ไข้;
• ต่อมน้ำเหลืองโตในร่างกาย
• การพัฒนาของเชื้อรา, วัณโรค, โรคปอดบวม, ท็อกโซพลาสโมซิส, การกำเริบของโรคเริม

คนไข้ไม่จำเป็นต้องเตรียมตัวก่อนบริจาคเลือดดำ คุณไม่ควรกินอาหาร 8-10 ชั่วโมงก่อนการทดสอบ ไม่แนะนำให้ดื่มเครื่องดื่มแอลกอฮอล์หรือกาแฟหรือทำกิจกรรมหนักๆ ในวันก่อนบริจาคโลหิต การออกกำลังกายรู้สึกตื่นเต้น

การวิจัยดำเนินการอย่างไร?

จากมุมมองของผู้ป่วย immunoblot ก็ไม่แตกต่างจากการวิเคราะห์อื่น ๆ : ต้องใช้เวลา เลือดที่ไม่มีออกซิเจนถูกสอบสวนและได้ผลลัพธ์ แต่ถ้าเราลงรายละเอียดเกี่ยวกับวิธีการนี้ให้มากขึ้นอีกหน่อย มันไม่ง่ายเลย แต่มาลองคิดดูกัน

ขั้นแรก ที่โรงงานผลิตรีเอเจนต์ จะมีการตรวจหาไวรัสภูมิคุ้มกันบกพร่องในมนุษย์ "อ้างอิง" จากนั้น ไวรัสจะถูกทำลายจนเหลือส่วนประกอบที่เล็กที่สุด ซึ่งก็คือโปรตีน (แอนติเจนของไวรัส) โดยใช้ขั้นตอนพิเศษ (อิเล็กโตรโฟเรซิส) ในตัวกลางเจล จากนั้นใช้การซับตัวเอง (จากการซับภาษาอังกฤษ) อนุภาคจะถูกวางบนวัสดุพิเศษ - ไนโตรเซลลูโลสหรือตัวกรองไนลอนเพื่อให้ได้ตัวบ่งชี้ที่พร้อมใช้งานซึ่งเรียกว่าแถบ แถบคือแถบที่มีการกระจายแอนติเจนขึ้นอยู่กับน้ำหนักโมเลกุลในลำดับที่ชัดเจน นั่นคือกระดาษแต่ละมิลลิเมตรสอดคล้องกับโปรตีนจำเพาะ

ดังที่คุณอาจทราบแล้วว่า หากมีไวรัสอยู่ในเลือดของบุคคล ร่างกายจะเริ่มผลิตแอนติบอดีต่อเปลือกของไวรัส (โปรตีนบางชนิด) และไวรัสแต่ละตัวจะมีโปรตีนแอนติเจนเป็นของตัวเอง การตรวจหาแอนติบอดีต่อโปรตีนแอนติเจนในเลือดเป็นพื้นฐานของวิธีอิมมูโนลอต ท้ายที่สุดหากแอนติบอดีพบกับแอนติเจน พวกมันก็จะโต้ตอบกันอย่างแน่นอน - "แท่ง"

ดังนั้นแอนติเจนจึงอยู่บนแถบแถบและหากมีแอนติเจนที่เหมาะสมในเลือดของผู้ที่ถูกทดสอบ พวกมันจะมีปฏิกิริยาต่อกันอย่างแน่นอนและในสถานที่นี้ บนแถบแถบ ตัวบ่งชี้จะปรากฏขึ้น - จอแบนจะ ปรากฏขึ้น (เหมือนที่ทดสอบการตั้งครรภ์) ยิ่งไปกว่านั้น ในตำแหน่งเฉพาะบนแถบ ด้วยวิธีนี้ แพทย์จะเข้าใจว่ามีโปรตีนกลุ่มหนึ่งในเลือดที่เป็นลักษณะของไวรัสชนิดใดชนิดหนึ่งหรือไม่

ตัวอย่างเช่นหากมีแถบสีเข้มขึ้นในบริเวณที่มีการแปลโปรตีน gp160, gp120, gp41ได้รับการวินิจฉัยว่าติดเชื้อ HIV ส่วนไวรัสชนิดอื่นจะเป็นชุดโปรตีนที่แตกต่างไปจากเดิมอย่างสิ้นเชิง

ควรสังเกตว่าอิมมูโนลอตช่วยให้สามารถระบุการมีอยู่ของไวรัสได้อย่างแม่นยำเฉพาะในกรณีที่ชุดแอนติบอดีในเลือดเสร็จสมบูรณ์นั่นคือถ้ามีโปรตีน gp160, gp120, gp41 ในเวลาเดียวกันนี่ก็เป็น 100 % การติดเชื้อเอชไอวี แต่หากขาดหายไปอย่างน้อยหนึ่งรายการ เช่น gp41 หายไป แต่มีเพียง gp160, gp120 เท่านั้น การทดสอบดังกล่าวจะถือว่าน่าสงสัยและจำเป็นต้องทำซ้ำ

คำถามที่พบบ่อย

Immunoblotting มีขั้นตอนอะไรบ้าง?

1. การเตรียมแถบไวรัสภูมิคุ้มกันบกพร่อง (HIV) ซึ่งก่อนหน้านี้ทำให้บริสุทธิ์และถูกทำลายเป็นส่วนประกอบต่างๆ จะถูกอิเล็กโตรโฟรีซิส และแอนติเจนที่ประกอบเป็น HIV จะถูกแยกออกจากกันด้วยน้ำหนักโมเลกุล จากนั้น ใช้วิธีการซับ (คล้ายกับการบีบหมึกส่วนเกินลงบนแผ่นซับ) แอนติเจนจะถูกถ่ายโอนไปยังแถบไนโตรเซลลูโลส ซึ่งขณะนี้มีสเปกตรัมของแถบแอนติเจนที่มีลักษณะเฉพาะของเอชไอวี ซึ่งยังคงมองไม่เห็นด้วยตา
2. การตรวจตัวอย่างวัสดุทดสอบ (ซีรั่ม พลาสมาในเลือดของผู้ป่วย ฯลฯ) ถูกนำไปใช้กับแถบไนโตรเซลลูโลส และหากมีแอนติบอดีจำเพาะในตัวอย่าง สารเหล่านี้จะจับกับแถบแอนติเจนที่เกี่ยวข้อง (เสริม) ที่เกี่ยวข้องอย่างเคร่งครัด อันเป็นผลมาจากการยักย้ายที่ตามมาผลลัพธ์ของการโต้ตอบนี้จะถูกมองเห็น - ทำให้มองเห็นได้
3. การตีความผลลัพธ์การมีอยู่ของแถบในบางพื้นที่ของแผ่นไนโตรเซลลูโลสเป็นการยืนยันการมีอยู่ของแอนติบอดีต่อซีรัมที่ทดสอบแล้วเพื่อกำหนดแอนติเจนของเอชไอวีอย่างเคร่งครัด

• เลน A – การควบคุมเชิงบวก
• เลน B – การควบคุมเชิงบวกที่อ่อนแอ
• เลน C - การควบคุมเชิงลบ
• ช่อง D – ตัวอย่างที่เป็นบวก (ตรวจพบแอนติบอดีต่อ HIV-1)

จะถอดรหัสการวิเคราะห์ได้อย่างไร?

หาก ELISA แสดงให้เห็นว่ามีแอนติบอดีต่อแอนติเจนทั้งหมดหรือเกือบทั้งหมดตามระบบการทดสอบนี้หมายความว่า การทดสอบเชิงบวกสำหรับเอชไอวี หากคำตอบหลังจากการตรวจอิมมูโนแอสเสย์ของเอนไซม์ทางเซรุ่มวิทยาตัวที่สองเป็นบวก จะต้องดำเนินการอิมมูโนลอตต์ การถอดรหัสผลลัพธ์จะแม่นยำยิ่งขึ้น หากเอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์ให้ผลลัพธ์ที่เป็นบวก การวิเคราะห์อิมมูโนลอตครั้งต่อไปก็แสดงให้เห็นว่ามีเชื้อเอชไอวี จากนั้นจึงให้ผลลัพธ์สุดท้าย

เมื่อถอดรหัสการวิเคราะห์แล้ว คุณจำเป็นต้องรู้สิ่งนั้น การทดสอบเชิงบวกเอชไอวีถูกกำหนดโดย:

• 60% ถึง 65% 28 วันหลังการติดเชื้อ
• ใน 80% – หลังจาก 42 วัน;
• ใน 90% – หลังจาก 56 วัน;
• ใน 95% - หลังจาก 84 วัน

หากการตอบสนองต่อเอชไอวีเป็นบวก แสดงว่าตรวจพบแอนติบอดีต่อไวรัสแล้ว เพื่อหลีกเลี่ยงคำตอบที่เป็นเท็จ คุณต้องทำการทดสอบอีกครั้ง โดยควรทำสองครั้ง หากตรวจพบแอนติบอดีต่อภูมิคุ้มกันบกพร่องเมื่อผ่านการทดสอบสองครั้งจากสองครั้งหรือเมื่อผ่านการทดสอบ 3 ครั้งใน 2 ครั้งผลลัพธ์จะถือว่าเป็นบวก

สามารถตรวจพบแอนติเจน p 24 ในเลือดได้ภายใน 14 วันนับจากวันที่ติดเชื้อ เมื่อใช้วิธีเอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์จะตรวจพบแอนติเจนนี้ตั้งแต่ 14 ถึง 56 วัน หลังจากผ่านไป 60 วัน มันจะไม่อยู่ในเลือดอีกต่อไป เฉพาะเมื่อโรคเอดส์ก่อตัวในร่างกายเท่านั้นที่โปรตีน p24 นี้จะเติบโตอีกครั้งในเลือด ดังนั้นจึงใช้ระบบทดสอบเอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์เพื่อตรวจหาเชื้อเอชไอวีในวันแรกของการติดเชื้อ หรือเพื่อพิจารณาว่าโรคดำเนินไปอย่างไรและติดตามกระบวนการรักษา ความไวในการวิเคราะห์สูงของเอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์จะตรวจจับแอนติเจน p24 ในวัสดุทางชีวภาพสำหรับ HIV ของชนิดย่อยที่หนึ่งที่ความเข้มข้น 5 ถึง 10 pkg/ml สำหรับ HIV ของชนิดย่อยที่สองตั้งแต่ 0.5 ng/ml หรือน้อยกว่า

ภายใต้ น่าสงสัยผลลัพธ์ของการทดสอบอิมมูโนซอร์เบนท์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์บ่งบอกว่ามีข้อผิดพลาดอยู่ที่ไหนสักแห่งในการวินิจฉัย ตามกฎแล้ว มีบางสิ่งปะปนกันโดยเจ้าหน้าที่ทางการแพทย์ หรือบุคคลนั้นมีอาการของการติดเชื้อ แต่ผลลัพธ์เป็นลบ ซึ่งทำให้เกิดความสงสัย และบุคคลนั้นจะถูกส่งไปทดสอบซ้ำ

ภายใต้ ผลบวกลวงผลลัพธ์ หมายถึง ผลลัพธ์เมื่อทำการตรวจเลือดภายใต้เงื่อนไขของผู้ป่วยดังต่อไปนี้:

• การตั้งครรภ์;
• หากบุคคลมีความไม่สมดุลของฮอร์โมน
• ด้วยการกดภูมิคุ้มกันเป็นเวลานาน

จะถอดรหัสการวิเคราะห์ในกรณีนี้ได้อย่างไร? ให้ผลลัพธ์บวกลวงหากตรวจพบโปรตีนอย่างน้อยหนึ่งชนิด เนื่องจากความจริงที่ว่าแอนติเจน p24 ขึ้นอยู่กับความแปรผันของแต่ละบุคคลมาก เมื่อใช้วิธีนี้ในช่วงแรกของการติดเชื้อ จะสามารถตรวจพบผู้ป่วยได้ตั้งแต่ 20% ถึง 30%

ผลการตรวจเป็นบวกน่าเชื่อถือแค่ไหน?

บางครั้ง ELISA ก็มี ผลลัพธ์บวกลวง(ประมาณ 1% ของกรณี) สาเหตุของผลลัพธ์นี้อาจเกิดจากการตั้งครรภ์ การติดเชื้อไวรัสต่างๆ หรืออุบัติเหตุธรรมดา หลังจากได้รับผลบวกแล้วจำเป็นต้องมีการทดสอบที่แม่นยำยิ่งขึ้น - อิมมูโนลอตตามผลการวินิจฉัย ผลบวกของอิมมูโนล็อตหลังจากนั้น เอลิซาเชิงบวกเชื่อถือได้ 99.9% - นี่คือความแม่นยำสูงสุดสำหรับการทดสอบทางการแพทย์ หากอิมมูโนลอตเป็นลบ หมายความว่าการทดสอบครั้งแรกมีผลบวกลวง และในความเป็นจริงบุคคลนั้นไม่มีเชื้อ HIV

ผลลัพธ์ที่ไม่แน่นอน (สงสัย) คืออะไร?

หาก ELISA เป็นบวกหรือเป็นลบ อิมมูโนลอตอาจเป็นค่าบวก ลบ หรือไม่แน่นอน ผลอิมมูโนลอตไม่แน่นอน เช่น การปรากฏตัวของโปรตีนอย่างน้อยหนึ่งตัวต่อไวรัสในอิมมูโนลอตสามารถสังเกตได้หากการติดเชื้อเกิดขึ้นเมื่อเร็ว ๆ นี้และยังมีแอนติบอดีต่อเอชไอวีในเลือดน้อย ในกรณีนี้อิมมูโนลอตจะกลายเป็นบวกหลังจากผ่านไประยะหนึ่ง นอกจากนี้ผลลัพธ์ที่ไม่แน่นอนอาจปรากฏขึ้นในกรณีที่ไม่มีการติดเชื้อ HIV ด้วยโรคตับอักเสบบางส่วน โรคเรื้อรังลักษณะการเผาผลาญหรือในระหว่างตั้งครรภ์ ในกรณีนี้อิมมูโนลอตจะกลายเป็นลบหรือพบสาเหตุของผลลัพธ์ที่ไม่แน่นอน

การวิเคราะห์มีค่าใช้จ่ายเท่าไร?

Immunoblot สำหรับ HIV ไม่ใช่การทดสอบราคาถูก โดยเฉลี่ยแล้วการตรวจคัดกรอง วิธีเอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์ราคาตั้งแต่ 500 ถึง 900 รูเบิล Immunoblotting เป็นการศึกษาเพื่อการตรวจสอบซึ่งมีราคาตั้งแต่สามถึงห้าพันรูเบิล วิธีการที่ซับซ้อนกว่านั้นมีราคาแพงกว่ามาก ตัวอย่างเช่นสำหรับการวิเคราะห์ปฏิกิริยาลูกโซ่โพลีเมอเรส (PCR) คุณจะต้องจ่ายประมาณ 12,000 รูเบิล

จะทำการวิเคราะห์ที่ไหน?

ฉันจะไปตรวจหาเชื้อ HIV ได้ที่ไหน? การศึกษา ELISA และอิมมูโนลอตดำเนินการในคลินิกเอกชนในเมือง โดยจะทราบผลภายใน 24 ชั่วโมง การวินิจฉัยอย่างเร่งด่วนก็เป็นไปได้เช่นกัน ในรัฐบาล สถาบันการแพทย์การทดสอบ ELISA และอิมมูโนลอตต์ดำเนินการโดยไม่เสียค่าใช้จ่ายตามกฎหมายของสหพันธรัฐรัสเซีย สตรีมีครรภ์ รวมถึงผู้ป่วยที่เข้ารับการรักษาในโรงพยาบาลหรือการผ่าตัด จะต้องได้รับการทดสอบโรคติดเชื้อ

ELISA เฟสโซลิด - ตัวแปรทดสอบเมื่อส่วนประกอบหนึ่งของปฏิกิริยาภูมิคุ้มกัน (แอนติเจนหรือแอนติบอดี) ถูกดูดซับบนตัวพาที่เป็นของแข็ง เช่น ในหลุมของแผ่นโพลีสไตรีน ส่วนประกอบต่างๆ ถูกตรวจพบโดยการเพิ่มแอนติบอดีหรือแอนติเจนที่มีป้ายกำกับ หากผลลัพธ์เป็นบวก สีของโครโมเจนจะเปลี่ยนไป แต่ละครั้งหลังจากเพิ่มส่วนประกอบอื่น รีเอเจนต์ที่ไม่ถูกผูกมัดจะถูกกำจัดออกจากบ่อโดยการล้าง

เมื่อพิจารณาหาแอนติบอดี (รูปซ้าย) ซีรั่มในเลือดของผู้ป่วย ซีรั่มแอนติโกลบูลินที่มีฉลากเอนไซม์ และสารตั้งต้น/โครโมเจนสำหรับเอนไซม์จะถูกเติมตามลำดับลงในหลุมของแผ่นที่มีแอนติเจนที่ถูกดูดซับ

ครั้งที่สอง เมื่อพิจารณาแอนติเจน (รูปขวา) แอนติเจนจะถูกเพิ่มเข้าไปในหลุมด้วยแอนติบอดีที่ถูกดูดซับ (ตัวอย่างเช่น ซีรั่มในเลือดที่มีแอนติเจนที่ต้องการ) ซีรั่มวินิจฉัยและแอนติบอดีทุติยภูมิ (กับซีรั่มวินิจฉัย) ที่มีป้ายกำกับด้วยเอนไซม์ จะถูกเติม จากนั้นจึงเติมซับสเตรต/โครโมเจนสำหรับเอนไซม์

การแข่งขัน ELISA เพื่อระบุแอนติเจน: แอนติเจนเป้าหมายและแอนติเจนที่ติดฉลากเอนไซม์จะแข่งขันกันเพื่อจับกับแอนติบอดีในซีรั่มภูมิคุ้มกันในปริมาณที่จำกัด

การทดสอบอีกอย่างหนึ่งคือ ELISA แบบแข่งขันสำหรับการตรวจหาแอนติบอดี: แอนติบอดีที่ต้องการและแอนติบอดีที่ติดฉลากเอนไซม์จะแข่งขันกันเพื่อหาแอนติเจนที่ถูกดูดซับบนเฟสของแข็ง

ภูมิคุ้มกันบกพร่อง- วิธีการตรวจจับโปรตีนที่มีความไวสูง โดยอาศัยการผสมผสานระหว่างอิเล็กโตรโฟรีซิสและ ELISA หรือ RIA Immunoblotting ใช้เป็นวิธีการวินิจฉัยการติดเชื้อ HIV เป็นต้น

แอนติเจนของเชื้อโรคจะถูกแยกออกโดยใช้โพลีอะคริลาไมด์เจลอิเล็กโตรโฟรีซิส จากนั้นจึงย้ายจากเจลไปยังกระดาษกัมมันต์หรือเมมเบรนไนโตรเซลลูโลส และพัฒนาโดยใช้ ELISA บริษัทต่างๆ ผลิตแถบดังกล่าวโดยมี "รอยเปื้อน" ของแอนติเจน ซีรั่มของผู้ป่วยถูกนำไปใช้กับแถบเหล่านี้ . จากนั้น หลังจากการฟักตัว ผู้ป่วยจะถูกล้างออกจากแอนติบอดีที่ไม่ได้จับตัวกัน และนำซีรั่มไปใช้กับอิมมูโนโกลบูลินของมนุษย์ที่มีฉลากด้วยเอนไซม์ . สารเชิงซ้อนที่เกิดขึ้นบนแถบ [แอนติเจน + แอนติบอดีของผู้ป่วย + แอนติบอดีต่อ Ig ของมนุษย์] ถูกตรวจพบโดยการเพิ่มสารตั้งต้น chromogenic ที่เปลี่ยนสีภายใต้การกระทำของเอนไซม์

52. อินเทอร์เฟรอนธรรมชาติ วิธีการเตรียมและการใช้

อินเตอร์เฟอรอนหมายถึงโปรตีนป้องกันที่สำคัญของระบบภูมิคุ้มกัน ค้นพบระหว่างการศึกษาการแทรกแซงของไวรัส เช่น ปรากฏการณ์ที่สัตว์หรือเซลล์เพาะเลี้ยงที่ติดเชื้อไวรัสตัวหนึ่งไม่ไวต่อการติดเชื้อไวรัสอีกตัวหนึ่ง ปรากฎว่าการรบกวนนั้นเกิดจากโปรตีนที่เกิดขึ้นซึ่งมีคุณสมบัติต้านไวรัส โปรตีนนี้เรียกว่าอินเตอร์เฟอรอน

Interferon เป็นตระกูลโปรตีนไกลโคโปรตีนที่สังเคราะห์โดยเซลล์ของระบบภูมิคุ้มกันและ เนื้อเยื่อเกี่ยวพัน- ขึ้นอยู่กับว่าเซลล์ใดสังเคราะห์อินเตอร์เฟอรอน มีสามประเภท: α, β และ γ-อินเตอร์เฟรอน

อัลฟ่าอินเตอร์เฟอรอนผลิตโดยเม็ดเลือดขาวและเรียกว่าเม็ดเลือดขาว อินเตอร์เฟอรอนเบต้าเรียกว่าไฟโบรบลาสติกเพราะถูกสังเคราะห์โดยไฟโบรบลาสต์ - เซลล์เนื้อเยื่อเกี่ยวพันและ แกมมาอินเตอร์เฟอรอน- ภูมิคุ้มกันเนื่องจากผลิตโดย T-lymphocytes ที่ถูกกระตุ้น, มาโครฟาจ, เซลล์นักฆ่าตามธรรมชาติ เช่น เซลล์ภูมิคุ้มกัน

อินเตอร์เฟอรอนถูกสังเคราะห์ในร่างกายอย่างต่อเนื่อง และความเข้มข้นในเลือดจะคงอยู่ที่ประมาณ 2 IU/มล. (1 หน่วยสากล - IU - คือปริมาณของอินเตอร์เฟอรอนที่ป้องกันการเพาะเลี้ยงเซลล์จาก 1 CPD 50 ของไวรัส) การผลิตอินเตอร์เฟอรอนเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วระหว่างการติดเชื้อไวรัส เช่นเดียวกับเมื่อสัมผัสกับตัวเหนี่ยวนำอินเตอร์เฟอรอน เช่น RNA, DNA และโพลีเมอร์เชิงซ้อน ตัวเหนี่ยวนำอินเตอร์เฟอรอนดังกล่าวเรียกว่า อินเตอร์เฟอโรโนเจน

นอกจากฤทธิ์ต้านไวรัสแล้ว อินเตอร์เฟอรอนยังมีการป้องกันมะเร็งด้วย เนื่องจากจะชะลอการแพร่กระจาย (การสืบพันธุ์) ของเซลล์เนื้องอก เช่นเดียวกับการทำงานของระบบภูมิคุ้มกัน การกระตุ้นเซลล์ทำลายเซลล์ เซลล์นักฆ่าตามธรรมชาติ ควบคุมการสร้างแอนติบอดีโดยเซลล์ B กระตุ้นการแสดงออกของเซลล์หลัก ความซับซ้อนทางจุลพยาธิวิทยา

กลไกการออกฤทธิ์อินเตอร์เฟอรอนมีความซับซ้อน อินเตอร์เฟอรอนไม่ส่งผลกระทบโดยตรงต่อไวรัสนอกเซลล์ แต่จะจับกับตัวรับเซลล์พิเศษและส่งผลต่อกระบวนการสืบพันธุ์ของไวรัสภายในเซลล์ในขั้นตอนการสังเคราะห์โปรตีน

การใช้อินเตอร์เฟอรอน- การออกฤทธิ์ของอินเตอร์เฟอรอนจะมีประสิทธิภาพมากขึ้นเมื่อเริ่มสังเคราะห์หรือเข้าสู่ร่างกายจากภายนอกก่อนหน้านี้ ดังนั้นจึงใช้เพื่อวัตถุประสงค์ในการป้องกันโรคติดเชื้อไวรัสหลายชนิดเช่นไข้หวัดใหญ่เช่นกัน วัตถุประสงค์ในการรักษาสำหรับการติดเชื้อไวรัสเรื้อรัง เช่น โรคตับอักเสบ (บี, ซี, ดี), เริม, โรคปลอกประสาทเสื่อมแข็ง เป็นต้น อินเตอร์เฟอรอนให้ผลลัพธ์เชิงบวกในการรักษาเนื้องอกเนื้อร้ายและโรคที่เกี่ยวข้องกับภูมิคุ้มกันบกพร่อง

อินเตอร์เฟอรอนเป็นสายพันธุ์เฉพาะ เช่น อินเตอร์เฟอรอนของมนุษย์มีประสิทธิภาพน้อยกว่าในสัตว์และในทางกลับกัน อย่างไรก็ตามความจำเพาะของสายพันธุ์นี้มีความสัมพันธ์กัน

รับอินเตอร์เฟอรอน- ได้รับอินเตอร์เฟอรอนในสองวิธี: ก) โดยการติดเชื้อไวรัสที่ปลอดภัยในเม็ดเลือดขาวของมนุษย์หรือลิมโฟไซต์ของมนุษย์ซึ่งเป็นผลมาจากการที่เซลล์ที่ติดเชื้อสังเคราะห์อินเตอร์เฟอรอนซึ่งจะถูกแยกออกและสร้างการเตรียมอินเตอร์เฟอรอนจากมัน; b) ดัดแปลงพันธุกรรม - โดยการเจริญเติบโตของแบคทีเรียสายพันธุ์รีคอมบิแนนท์ที่สามารถผลิตอินเตอร์เฟอรอนภายใต้สภาวะการผลิต โดยทั่วไปแล้ว จะใช้สายพันธุ์รีคอมบิแนนต์ของซูโดโมแนสและเอสเชอริเคีย โคไลที่มียีนอินเตอร์เฟอรอนที่สร้างไว้ใน DNA ของพวกมัน อินเตอร์เฟอรอนที่ได้จากพันธุวิศวกรรมเรียกว่ารีคอมบิแนนท์ ในประเทศของเรา ได้รับอินเตอร์เฟอรอนชนิดรีคอมบิแนนท์ ชื่อเป็นทางการ"เรเฟรอน". การผลิตยานี้มีประสิทธิภาพและราคาถูกกว่ายาเม็ดโลหิตขาวหลายวิธี

อินเตอร์เฟอรอนชนิดรีคอมบิแนนท์พบว่ามีการใช้อย่างแพร่หลายในทางการแพทย์ในฐานะตัวแทนในการป้องกันและรักษาโรคสำหรับการติดเชื้อไวรัส เนื้องอก และภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่อง