การตรวจซีรั่มในเลือดด้วยวิธี IFA การวิเคราะห์ ELISA: มันคืออะไร? ทำไมมันถึงจำเป็น? ข้อดีและข้อเสียของวิธีการ เอลิซ่าคืออะไร

5.1 สาระสำคัญและการจำแนกประเภทของ ELISA

ELISA ปรากฏในช่วงกลางทศวรรษที่ 60 และได้รับการพัฒนาในขั้นต้นเพื่อใช้เป็นวิธีการในการระบุแอนติเจนในตัวอย่างเนื้อเยื่อวิทยา เช่นเดียวกับการแสดงภาพเส้นการตกตะกอนในการทดสอบอิมมูโนดิฟฟิวชันและอิมมูโนอิเล็กโตรโฟรีซิส จากนั้นจึงเริ่มใช้ในการตรวจวัดเชิงปริมาณของแอนติเจนและแอนติบอดีใน ของเหลวชีวภาพ E. Engvall และ R. Pählman มีส่วนร่วมในการพัฒนาวิธีการนี้ เช่นเดียวกับ W. Van Weeman และ R. Schurs อย่างอิสระ

ข้าว. 6 หลักการพื้นฐานของ ELISA:

เพื่อระบุแอนติเจน 2) เพื่อตรวจหาแอนติบอดี

วิธีการนี้ขึ้นอยู่กับการจับกันเฉพาะของแอนติบอดีกับแอนติเจน โดยมีส่วนประกอบหนึ่งที่เชื่อมต่อกับเอนไซม์ อันเป็นผลมาจากปฏิกิริยากับสารตั้งต้นของโครโมจีนิกที่สอดคล้องกัน จึงเกิดผลิตภัณฑ์ที่มีสีขึ้น ซึ่งสามารถกำหนดปริมาณได้ สเปกโตรโฟโตเมตริก (รูปที่ 6)

การค้นพบความเป็นไปได้ในการตรึงแอนติเจนและแอนติบอดีบนพาหะต่างๆ ในขณะที่ยังคงฤทธิ์จับของพวกมันไว้ ทำให้สามารถขยายการใช้ ELISA ในสาขาชีววิทยาและการแพทย์ต่างๆ ได้

การเกิดขึ้นของโมโนโคลนอลแอนติบอดีมีส่วนช่วยในการพัฒนา ELISA ต่อไป ซึ่งทำให้สามารถเพิ่มความไว ความจำเพาะ และความสามารถในการทำซ้ำของผลลัพธ์ได้

ตามทฤษฎีแล้ว ELISA ขึ้นอยู่กับข้อมูลจากอิมมูโนเคมีและเอนไซม์เคมีสมัยใหม่ ความรู้เกี่ยวกับกฎเคมีกายภาพของปฏิกิริยาแอนติเจน-แอนติบอดี ตลอดจนหลักการสำคัญของเคมีวิเคราะห์ ความไวของ ELISA และเวลาที่ใช้ถูกกำหนดโดยปัจจัยหลักหลายประการ: ลักษณะทางจลนศาสตร์และอุณหพลศาสตร์ของปฏิกิริยาแอนติเจน-แอนติบอดี อัตราส่วนของรีเอเจนต์ กิจกรรมของเอนไซม์ และความละเอียดของวิธีการตรวจจับ ใน มุมมองทั่วไปปฏิกิริยาแอนติเจน-แอนติบอดีสามารถอธิบายได้ด้วยวิธีง่ายๆ:

+[เอจี]↔[เอแท็ก]

วัตถุวิจัยที่หลากหลายตั้งแต่สารประกอบโมเลกุลต่ำไปจนถึงไวรัสและแบคทีเรียตลอดจนสิ่งพิเศษ วงกลมกว้างปัญหาที่เกี่ยวข้องกับเงื่อนไขต่างๆ ในการใช้ ELISA นำไปสู่การพัฒนาตัวแปรต่างๆ ของวิธีนี้เป็นจำนวนมาก

ELISA เวอร์ชันใดก็ตามมี 3 ขั้นตอนบังคับ:

1. ขั้นตอนการรับรู้สารประกอบทดสอบโดยแอนติบอดีจำเพาะซึ่งนำไปสู่การก่อตัวของระบบภูมิคุ้มกันที่ซับซ้อน

2. ขั้นตอนของการสร้างการเชื่อมต่อของคอนจูเกตกับภูมิคุ้มกันที่ซับซ้อนหรือกับบริเวณที่มีผลผูกพันอิสระ

3.ขั้นตอนการแปลงฉลากเอนไซม์ให้เป็นสัญญาณที่บันทึกไว้ การจำแนกประเภทของวิธี ELISA ขึ้นอยู่กับหลายวิธี:

1. ขึ้นอยู่กับประเภทของรีเอเจนต์ที่มีอยู่ในขั้นตอนแรกของ ELISA วิธีการแข่งขันและวิธีไม่แข่งขันจะแตกต่างกัน

A) ใน ELISA แบบแข่งขัน ในขั้นตอนแรก ระบบประกอบด้วยทั้งสารประกอบที่วิเคราะห์และอะนาล็อกของมัน ซึ่งมีป้ายกำกับด้วยเอนไซม์และแข่งขันกันเพื่อหาตำแหน่งการจับเฉพาะกับมัน

B) วิธีการที่ไม่แข่งขันนั้นมีลักษณะเฉพาะคือการมีอยู่ในระบบในขั้นตอนแรกของเฉพาะสารประกอบที่วิเคราะห์และศูนย์รวมที่จำเพาะต่อมันเท่านั้น

2. วิธี ELISA ทั้งหมดแบ่งออกเป็นแบบเนื้อเดียวกันและแบบต่างกัน

หาก ELISA ทั้งสามขั้นตอนเกิดขึ้นในสารละลาย และระหว่างขั้นตอนหลักไม่มีขั้นตอนเพิ่มเติมสำหรับการแยกคอมเพล็กซ์ภูมิคุ้มกันที่เกิดขึ้นจากส่วนประกอบที่ไม่ทำปฏิกิริยา วิธีการนั้นจะอยู่ในกลุ่มขององค์ประกอบที่เป็นเนื้อเดียวกัน

พื้นฐานของ ELISA ที่เป็นเนื้อเดียวกันซึ่งใช้ในการตรวจวัดสารโมเลกุลต่ำตามกฎคือการยับยั้งการทำงานของเอนไซม์เมื่อรวมกับแอนติเจนหรือแอนติบอดี กิจกรรมของเอนไซม์ได้รับการฟื้นฟูอันเป็นผลมาจากปฏิกิริยาแอนติเจนและแอนติบอดี

เมื่อแอนติบอดีจับกับแอนติเจนที่มีแท็กเอนไซม์ กิจกรรมของเอนไซม์จะถูกยับยั้ง 95% เมื่อเทียบกับซับสเตรตที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูง ซึ่งเกิดจากการแยกสเตรตของซับสเตรตออกจากศูนย์กลางที่ทำงานอยู่ของเอนไซม์ เมื่อความเข้มข้นของแอนติเจนเพิ่มขึ้น แอนติบอดีจะจับกันมากขึ้นและคอนจูเกตของแอนติเจน-เอนไซม์อิสระมากขึ้นยังคงอยู่ ซึ่งสามารถไฮโดรไลซ์ซับสเตรตที่มีน้ำหนักโมเลกุลสูงได้ การวิเคราะห์ดำเนินการรวดเร็วมาก การตัดสินใจหนึ่งครั้งต้องใช้เวลา 1 นาที ความไวของวิธีนี้ค่อนข้างสูง สามารถใช้ตรวจวัดสารในระดับพิโคโมลได้

วิธีการที่แตกต่างนั้นมีลักษณะโดยการวิเคราะห์ในระบบสองเฟสโดยมีส่วนร่วมของเฟสพาหะที่เป็นของแข็งและขั้นตอนบังคับของการแยกคอมเพล็กซ์ภูมิคุ้มกันออกจากส่วนประกอบที่ไม่ทำปฏิกิริยา (การล้าง) ซึ่งอยู่ในระยะที่แตกต่างกัน (คอมเพล็กซ์ภูมิคุ้มกันที่เกิดขึ้นนั้นอยู่บน เฟสของแข็งและสารเชิงซ้อนที่ไม่ทำปฏิกิริยาอยู่ในสารละลาย) วิธีการที่แตกต่างกันซึ่งการก่อตัวของภูมิคุ้มกันเชิงซ้อนในระยะแรกเกิดขึ้นบนเฟสของแข็งเรียกว่าวิธีการโซลิดเฟส

วิธีการจัดเป็นเนื้อเดียวกัน - ต่างกันหากขั้นตอนที่ 1 - การก่อตัวของสารเชิงซ้อนเฉพาะเกิดขึ้นในสารละลายจากนั้นจะใช้เฟสของแข็งที่มีรีเอเจนต์ที่ตรึงไว้เพื่อแยกส่วนประกอบ

3. ตามหลักการพิจารณาสารทดสอบ:

A) การกำหนดความเข้มข้นของสารโดยตรง (แอนติเจนหรือแอนติบอดี) ด้วยจำนวนตำแหน่งการจับที่ทำปฏิกิริยากับสารนั้น ในกรณีนี้ ฉลากเอนไซม์จะอยู่ในสารเชิงซ้อน AG-AT เฉพาะที่เกิดขึ้น ความเข้มข้นของสารวิเคราะห์จะเป็นสัดส่วนโดยตรงกับสัญญาณที่บันทึกไว้

B) การหาความเข้มข้นของสารด้วยความแตกต่าง จำนวนทั้งหมดไซต์ที่มีผลผูกพันและไซต์ที่มีผลผูกพันฟรีที่เหลืออยู่ ในกรณีนี้ ความเข้มข้นของสารวิเคราะห์จะเพิ่มขึ้น และสัญญาณที่บันทึกไว้จะลดลง ดังนั้น ในกรณีนี้ จึงมีการพึ่งพาขนาดของสัญญาณที่บันทึกไว้แบบผกผัน

5.2 ลักษณะของส่วนประกอบที่ใช้ใน ELISA

เอนไซม์

แท็กของเอนไซม์มีผลในการเร่งปฏิกิริยาที่ทรงพลังอย่างยิ่ง โดยโมเลกุลของเอนไซม์หนึ่งโมเลกุลสามารถทำปฏิกิริยากับโมเลกุลของสารตั้งต้นจำนวนมากได้ ดังนั้น เอนไซม์ที่มีอยู่ในปริมาณเพียงเล็กน้อยจึงสามารถระบุและวัดปริมาณได้โดยการก่อตัวของผลิตภัณฑ์และปฏิกิริยาที่เอนไซม์กระตุ้น ข้อดีอีกประการของการใช้เอนไซม์เป็นฉลากคือการมีอยู่ในโมเลกุลของหมู่ฟังก์ชันจำนวนมาก (ซัลไฮดริล, คาร์บอกซิล, ไทราซีนเรซิดิว ฯลฯ ) ซึ่งสามารถยึดโมเลกุลลิแกนด์โควาเลนต์ได้

เครื่องหมายเอนไซม์ที่ใช้ใน ELISA ต้องมีคุณสมบัติดังต่อไปนี้:

– กิจกรรมสูงและความเสถียรของเอนไซม์ภายใต้สภาวะการวิเคราะห์ เมื่อดัดแปลงและคอนจูเกตกับแอนติบอดีหรือโปรตีนอื่น ๆ

– การมีอยู่ของซับสเตรตที่ละเอียดอ่อนและความเรียบง่ายของวิธีการกำหนดผลิตภัณฑ์หรือซับสเตรตของปฏิกิริยาของเอนไซม์

– ความสามารถในการปรับระบบซับสเตรตเพื่อเพิ่มความแข็งแกร่ง

– ไม่มีเอนไซม์และสารยับยั้งในการศึกษา ของเหลวชีวภาพ.

สามารถใช้เอนไซม์ที่แตกต่างกันอย่างน้อย 15 ชนิดใน ELISA ตามข้อกำหนดข้างต้นที่ใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุดคือมะรุมเปอร์ออกซิเดส (HRP), อัลคาไลน์ฟอสฟาเตส (ALP) และβ-D-galactosidase ทั้งสามมีความเสถียรและกระตุ้นปฏิกิริยาที่มีความไวสูง นอกจากนี้ ผลิตภัณฑ์ที่เกิดจากปฏิกิริยาที่เร่งปฏิกิริยาโดยเอนไซม์เหล่านี้ (ขึ้นอยู่กับสารตั้งต้นที่ใช้) สามารถตรวจพบได้ไม่เพียงแต่ด้วยวิธีการวัดสีเท่านั้น แต่ยังตรวจจับโดยวิธีฟลูออเรสเซนต์ด้วย เอนไซม์ชนิดอื่นมีการใช้บ่อยน้อยกว่ามาก สิ่งนี้อธิบายได้จากกิจกรรมเฉพาะที่ต่ำกว่าเมื่อเทียบกับพีซีและ AP

วัสดุพิมพ์

การเลือกซับสเตรตถูกกำหนดโดยเอนไซม์ที่ใช้เป็นแท็กเป็นหลัก เนื่องจากปฏิกิริยาของเอนไซม์-ซับสเตรตมีความเฉพาะเจาะจงสูง

ข้อกำหนดพื้นฐานสำหรับวัสดุพิมพ์:

– ทำให้มั่นใจถึงความไวสูงของวิธีการในการตรวจหาเอนไซม์ในคอนจูเกต

– การก่อตัวของผลิตภัณฑ์ปฏิกิริยาของเอนไซม์และสารตั้งต้นที่เป็นที่รู้จัก (เช่น สี)

– วัสดุพิมพ์ต้องปลอดภัย ราคาถูก เข้าถึงได้ และสะดวกต่อการใช้งาน

บ่อยครั้งที่มีการใช้สารตั้งต้น chromogenic ซึ่งเมื่อถูกทำลายจะก่อให้เกิดสารสี การใช้สารตั้งต้นพลังงานสูง เช่น ฟลูออเรสเซนต์ หรือเคมีเรืองแสง มีแนวโน้มที่ดี การใช้วัสดุพิมพ์ดังกล่าวทำให้สามารถเพิ่มความไวของ ELISA ได้ตามทฤษฎีเป็นสองเท่า

การก่อตัวของคอนจูเกต

คอนจูเกตคือแอนติเจนหรือแอนติบอดีที่มีป้ายกำกับเอนไซม์ การก่อตัวของคอนจูเกตเป็นหนึ่งใน ขั้นตอนสำคัญดำเนินการ ELISA

เมื่อสร้างคอนจูเกต วิธีการที่เหมาะสมที่สุดในการติดฉลากเอนไซม์จะถูกเลือกเพื่อให้ส่วนประกอบทั้งสองของคอนจูเกตคงไว้ซึ่งกิจกรรมทางชีวภาพ: เอนไซม์ - ความสามารถในการโต้ตอบกับสารตั้งต้น และแอนติเจนหรือแอนติบอดี - แอนติเจนและกิจกรรมการจับกับแอนติเจน ตามลำดับ การมีอยู่ของแอนติเจนที่มีความบริสุทธิ์สูงซึ่งมีป้ายกำกับช่วยให้สามารถใช้วิธีการแข่งขันได้ ในกรณีนี้ ในขั้นตอนสุดท้าย คุณสามารถวัดกิจกรรมของคอนจูเกตที่ไม่เกี่ยวข้องกับแอนติบอดีที่ถูกตรึงได้ ซึ่งจะหลีกเลี่ยงขั้นตอนการล้างและทำให้การวิเคราะห์สะดวกยิ่งขึ้น อย่างไรก็ตาม แอนติเจนมีคุณสมบัติและโครงสร้างทางเคมีกายภาพที่หลากหลาย ซึ่งหมายความว่าเป็นไปไม่ได้ที่จะพัฒนาวิธีการสากลในการรับคอนจูเกตกับแอนติเจน ในกรณีนี้ การได้รับคอนจูเกตแอนติเจนและเอนไซม์เป็นงานที่ซับซ้อนแยกต่างหาก การเตรียมแอนติบอดีที่มีฉลากสำหรับ ELISA สามารถเข้าถึงได้อย่างมีระบบมากขึ้น

การผันของเอนไซม์กับโปรตีนที่ออกฤทธิ์ทางอิมมูโนเคมีนั้นทำได้หลายวิธี: การเชื่อมโยงข้ามทางเคมี, การจับโควาเลนต์ของโมเลกุลของเอนไซม์กับ Ag หรือ AT และการก่อตัวของสารประกอบผ่านพันธะที่ไม่ใช่โควาเลนต์เช่นเมื่อเชื่อมต่อระหว่างเอนไซม์ และ Ag หรือ AT ดำเนินการทางภูมิคุ้มกันผ่านปฏิกิริยาระหว่างแอนติเจนและแอนติบอดี

วิธีที่ใช้กันอย่างแพร่หลายที่สุดคือวิธีโควาเลนต์ในการเตรียมคอนจูเกต ทางเลือกของปฏิกิริยาการจับถูกกำหนดโดยประเภทของหมู่ฟังก์ชันที่มีอยู่ในโมเลกุลโปรตีนที่กำหนดให้ กลูตาราลดีไฮด์ โซเดียมเพอริเดต ฯลฯ ถูกใช้เป็นรีเอเจนต์ที่ใช้ในการแนะนำเอนไซม์เข้าไปในโมเลกุลของแอนติเจนและแอนติบอดี

มีวิธีการหนึ่งขั้นตอนและสองขั้นตอนในการรับคอนจูเกตโดยใช้กลูตาราลดีไฮด์ คอนจูเกตขนาดต่างๆ ที่มีฤทธิ์ของเอนไซม์ลดลง (15 - 60% ของเอนไซม์อิสระ) สามารถเกิดขึ้นได้ คอนจูเกตที่เกิดขึ้น ขนาดใหญ่อาจขัดขวางการกำหนดสารทดสอบอย่างรุนแรง คอนจูเกตที่มีน้ำหนักโมเลกุลค่อนข้างต่ำประกอบด้วยชิ้นส่วน Fab และโมเลกุลของเอนไซม์หนึ่งโมเลกุล

อันเป็นผลมาจากการสังเคราะห์สองขั้นตอนซึ่งประกอบด้วยการผลิตเอนไซม์ทีละขั้นตอนซึ่งดัดแปลงครั้งแรกด้วยสารเชื่อมโยงข้าม การแยกตัวของมัน จากนั้นปฏิกิริยาโต้ตอบกับแอนติเจน (แอนติบอดี) ในเวลาต่อมา โมเลกุลของ มีการสร้างองค์ประกอบที่เป็นเนื้อเดียวกันซึ่งประกอบด้วยโมเลกุลของเอนไซม์ 1-2 ตัวต่อโมเลกุลของอิมมูโนโกลบูลินและรักษากิจกรรมของเอนไซม์และภูมิคุ้มกันที่สูง อย่างไรก็ตามจำนวนของคอนจูเกตที่เกิดขึ้นนั้นมีน้อย (สำหรับมะรุมเปอร์ออกซิเดสคือ 5–10%)

การประยุกต์ใช้ในทางปฏิบัติที่ยิ่งใหญ่ที่สุดนั้นพบได้ในวิธีการรับคอนจูเกตอิมมูโนเพอรอกซิเดสโดยอาศัยการออกซิเดชันของส่วนประกอบคาร์โบไฮเดรตของเอนไซม์ด้วยโซเดียมเพอริเดต (การจับของเปอร์ออกซิเดสในคอนจูเกตจะสูงถึง 70-90% ของปริมาณเอนไซม์เริ่มต้น)

คอนจูเกตที่เชื่อถือได้ต้องมีคุณสมบัติดังต่อไปนี้:

ความแข็งแรงของแอนติบอดีสูงและความสัมพันธ์สูงสำหรับแอนติเจน เพื่อให้สามารถนำไปใช้ในการเจือจางสูง และลดการจับที่ไม่เฉพาะเจาะจง

มีความจำเพาะเพียงพอในการเจือจางการทำงาน

ความเด่นของรูปแบบโมโนเมอร์เหนือโพลีเมอร์เพราะว่า รูปแบบโพลีเมอร์มีแนวโน้มที่จะเกาะติดกับพลาสติกโดยไม่จำเพาะเจาะจง ส่งผลให้เกิดปฏิกิริยาในระดับพื้นหลังสูง

อัตราส่วนโมลที่เหมาะสมที่สุดระหว่างเอนไซม์และแอนติบอดี (อัตราส่วนที่เหมาะสมคือประมาณ 1:1)

กิจกรรมของเอนไซม์ที่เพียงพอของคอนจูเกต คุณสมบัตินี้ถูกกำหนดโดยเงื่อนไขการผันคำกริยาและอัตราส่วนของโมเลกุลของเอนไซม์และแอนติบอดีในคอนจูเกตเป็นหลัก

5.3 วิธี ELISA แบบต่างกัน

ELISA ที่ต่างกัน (หรือ ELISA เฟสโซลิด) รวมถึงวิธีการที่สารวิเคราะห์ปรากฏเป็นสองเฟส ในการแยกส่วนประกอบของปฏิกิริยาอิมมูโนเคมี จะใช้เฟสของแข็ง (ตัวพาที่ไม่ละลายน้ำ ซึ่งมักจะเป็นพลาสติก) โดยมีแอนติบอดีหรือแอนติเจนที่ตรึงไว้อยู่ ซึ่งจะถูกล้างในแต่ละขั้นตอนเพื่อกำจัดส่วนประกอบระดับกลางและที่ไม่ทำปฏิกิริยา

การตรึงสามารถกระทำได้โดยการจับโควาเลนต์ของแอนติบอดี (แอนติเจน) กับตัวพาที่ถูกกระตุ้นโดยใช้แนวทางทางเคมี รวมทั้งโดยการดูดซับทางกายภาพของแอนติบอดี (แอนติเจน) บนพื้นผิวของโพลีเมอร์ที่เป็นของแข็ง (ตัวอย่างเช่น แผ่นโพลีสไตรีน) ในวรรณคดีต่างประเทศ ทิศทางนี้เรียกว่าการทดสอบ ELISA หรือการทดสอบอิมมูโนซอร์เบนท์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์

ELISA แบบไม่แข่งขันสำหรับการกำหนดแอนติเจนโดยใช้ตัวอย่างของการใช้แอนติบอดีจำเพาะที่มีฉลากเอนไซม์และแอนติบอดีที่ถูกตรึง

สารละลายที่มีแอนติเจนที่กำลังวิเคราะห์จะถูกเติมลงในพาหะที่มีแอนติบอดีที่ตรึงไว้ ในระหว่างขั้นตอนการฟักตัว จะเกิดคอมเพล็กซ์แอนติเจนและแอนติบอดีจำเพาะขึ้น จากนั้นตัวพาจะถูกล้างออกจากแอนติเจนที่ไม่ถูกผูกไว้และเติมแอนติบอดีที่มีป้ายกำกับ - คอนจูเกต ในกรณีนี้ ปริมาณของคอนจูเกตที่ถูกผูกไว้จะเป็นสัดส่วนโดยตรงกับปริมาณแอนติเจนในตัวอย่างทดสอบ หลังจากการฟักตัวครั้งที่สองและการกำจัดคอนจูเกตส่วนเกิน จะมีการเพิ่มสารตั้งต้น chromogenic สำหรับเอนไซม์ที่ใช้ ซึ่งจะเปลี่ยนสีภายใต้การกระทำของเอนไซม์ กล่าวคือ ปฏิกิริยาของเอนไซม์เกิดขึ้นพร้อมกับสีของสารละลายในหลุม ระดับของสีจะเป็นสัดส่วนโดยตรงกับปริมาณของแอนติบอดีจำเพาะที่มีฉลากเอนไซม์ เอนไซม์ และแอนติเจนที่กำลังศึกษาอยู่ การวัดความหนาแน่นของแสง

สารละลายในหลุมที่ความยาวคลื่นหนึ่ง (ขึ้นอยู่กับสารตั้งต้นที่ใช้) จะดำเนินการโดยใช้เครื่องสเปกโตรโฟโตมิเตอร์พิเศษที่ปรับให้เหมาะกับเครื่องอ่านไมโครเพลท การประเมินเชิงปริมาณของความเข้มข้นของแอนติเจนในตัวอย่างถูกกำหนดโดยการเปรียบเทียบผลลัพธ์กับกราฟการสอบเทียบของการขึ้นต่อกันของความหนาแน่นเชิงแสงของสารละลายกับความเข้มข้นของสารละลายแอนติเจนมาตรฐาน

เนื่องจากในขั้นตอนของการระบุอิมมูโนคอมเพล็กซ์จำเพาะ แอนติเจนจึงมีความเกี่ยวข้องกับโมเลกุลของแอนติบอดีที่ถูกตรึงและมีป้ายกำกับ ในวรรณคดีวิธีนี้มักเรียกว่าวิธี "แซนวิช" (จากแซนด์วิชภาษาอังกฤษ) หรือวิธี ELISA แบบสองไซต์ (จาก การทดสอบสองไซต์ภาษาอังกฤษ)

วิธีนี้สามารถใช้ในการวิเคราะห์เฉพาะแอนติเจนที่มีปัจจัยกำหนดแอนติเจนอย่างน้อยสองตัวบนพื้นผิว การวิเคราะห์แอนติเจนโมโนวาเลนต์จำนวนมาก (สารประกอบยา ยาฆ่าแมลง ฯลฯ) เป็นที่ยอมรับไม่ได้

ข้อได้เปรียบหลัก วิธีนี้– ความไวสูง ขีดจำกัดการตรวจจับของสารประกอบด้วยวิธีนี้ในปัจจุบันถึงค่าลำดับ 10-21 โมล ซึ่งสอดคล้องกับการตรวจจับเพียง 600 โมเลกุลของสารวิเคราะห์ในตัวอย่าง ความไวสูงสุดจะเกิดขึ้นได้เมื่อแต่ละปฏิกิริยาทางภูมิคุ้มกันดำเนินการในโหมดสมดุล ซึ่งส่งผลต่อระยะเวลาของการวิเคราะห์ ซึ่งเฉลี่ยอยู่ที่ 4 – 6 ชั่วโมง

ELISA แบบไม่แข่งขันสำหรับการตรวจวัดแอนติบอดีโดยใช้ตัวอย่างการใช้แอนติบอดีทุติยภูมิที่มีฉลากเอนไซม์และแอนติเจนที่ตรึงไว้

ซีรั่มทดสอบจะถูกเติมลงในแอนติเจนที่ตรึงไว้ หลังจากการฟักตัวและการล้างแอนติบอดีที่ไม่ถูกผูกมัด แอนติบอดีทุติยภูมิที่มีป้ายกำกับซึ่งจำเพาะต่อแอนติบอดีที่กำลังวิเคราะห์จะถูกเพิ่มเข้าไป หลังจากการฟักตัวทุติยภูมิและการกำจัดแอนติบอดีทุติยภูมิที่มีฉลากมากเกินไป ปริมาณของฉลากเอนไซม์บนพาหะจะเป็นสัดส่วนกับความเข้มข้นของแอนติบอดีจำเพาะในซีรั่ม

โครงการนี้เป็นหนึ่งในวิธี ELISA ที่ใช้กันทั่วไปในการตรวจหาแอนติบอดี เนื่องจากช่วยให้สามารถตรวจหาแอนติบอดีต่อแอนติเจนต่างๆ ได้

ELISA ที่มีการแข่งขันต่างกันสำหรับการกำหนดหาแอนติเจนโดยใช้ตัวอย่างของการใช้แอนติเจนที่มีป้ายกำกับและแอนติบอดีที่ถูกตรึง



สารละลายที่มีแอนติเจนที่กำลังวิเคราะห์และคอนจูเกตแอนติเจน-เอนไซม์ที่มีความเข้มข้นคงที่จะถูกเติมลงในแอนติบอดีที่ถูกตรึงบนตัวพา หลังจากการฟักตัว ตัวพาจะถูกล้างออกจากแอนติเจนอิสระและติดฉลากที่ไม่ถูกผูกไว้ และการทำงานของเอนไซม์บนตัวพาจะถูกบันทึก ซึ่งเป็นสัดส่วนผกผันกับความเข้มข้นของแอนติเจนที่ถูกกำหนด

5.4 วิธี ELISA ที่เป็นเนื้อเดียวกัน

การละเมิดกิจกรรมของเอนไซม์อาจเกิดขึ้นได้เนื่องจากการแยกเชิงพื้นที่ของเอนไซม์และสารตั้งต้นหรือเนื่องจากการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างในโมเลกุลของเอนไซม์ที่มาพร้อมกับการก่อตัวของภูมิคุ้มกันที่ซับซ้อน HIFA มีข้อได้เปรียบเหนือวิธีอิมมูโนเคมีอื่นๆ หลายประการ ประการแรก การแสดงออกที่สูง (การวิเคราะห์ทั้งหมดโดยใช้ HIFA ใช้เวลาไม่กี่นาทีและแม้แต่เศษส่วนของนาที)

ข้าว.8 ตัวเลือกอิมมูโนแอสเสย์ของเอนไซม์ที่เป็นเนื้อเดียวกัน(A - ผลของการแยกเอนไซม์ (F) และสารตั้งต้น (C) เนื่องจากการขัดขวางแบบ steric ระหว่างการทำงานร่วมกันของแอนติเจน (Ag) และแอนติบอดี (Ab) B - ผลของการเปลี่ยนแปลงโครงสร้างของ เอนไซม์ในระหว่างการก่อตัวของแอนติเจนและแอนติบอดีคอมเพล็กซ์)

ประการที่สอง วิธีการนี้เป็นขั้นตอนเดียวและไม่ต้องใช้ขั้นตอนการซักที่ต้องใช้แรงงานมากและใช้เวลานาน และสุดท้าย ประการที่สาม วิธีการนี้ต้องใช้ปริมาตรขั้นต่ำ (8-50 ไมโครลิตร) และปริมาณของตัวอย่างทางชีววิทยาหรือทางคลินิก อย่างไรก็ตาม วิธี HIFA มีข้อเสียเปรียบที่สำคัญอย่างหนึ่ง - โดยพื้นฐานแล้ว คุณสามารถสร้างระบบทดสอบวินิจฉัยสำหรับแอนติเจนที่มีน้ำหนักโมเลกุลต่ำเท่านั้น เฉพาะในกรณีนี้ แอนติบอดีที่ทำปฏิกิริยากับแอนติเจนสามารถป้องกันหรือดัดแปลงโมเลกุลของเอนไซม์ที่เกี่ยวข้องกับแอนติเจนนี้ได้อย่างมีประสิทธิภาพ ในเรื่องนี้ (แม้จะดูเรียบง่ายและมีข้อได้เปรียบเหนือวิธีการอื่นๆ อย่างเห็นได้ชัด แต่เครื่องมือวินิจฉัยก็ถูกสร้างขึ้นโดยใช้ HIFA เพื่อระบุเฉพาะฮอร์โมน เปปไทด์ ยา และ สารเสพติดและโปรตีนน้ำหนักโมเลกุลต่ำบางชนิด

5.5 “แซนวิช” - ตัวแปร ELISA สำหรับการตรวจหาแอนติเจน

แอนติเจนที่ตรวจพบโดยใช้แวเรียนต์ ELISA นี้ต้องมีอีพิโทปหลายตัวที่สามารถจับแอนติบอดีหรือมีอีพิโทปที่แยกกันเชิงพื้นที่ซ้ำกันที่มีความจำเพาะที่เหมือนกัน

เมื่อดำเนินการ ELISA เวอร์ชันนี้ โพลี-หรือโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่มีความจำเพาะสูงซึ่งดูดซับในเฟสของแข็งจะถูกบ่มด้วยตัวอย่างทดสอบ หลังจากขั้นตอนการล้าง แอนติบอดีที่มีฉลากเอนไซม์ (คอนจูเกต) ให้กับแอนติเจนเดียวกันจะถูกเติมลงในหลุม จากนั้นจึงทำปฏิกิริยาขั้นตอนอื่นทั้งหมด ประสิทธิภาพของการก่อตัวของสารเชิงซ้อนจำเพาะในแต่ละขั้นตอนของการวิเคราะห์ขึ้นอยู่กับค่าคงที่การจับของปฏิกิริยาแอนติเจน-แอนติบอดี

เลื่อน เทคนิคที่มีอยู่การวินิจฉัยมีการขยายตัวอย่างรวดเร็วในช่วงไม่กี่ทศวรรษที่ผ่านมา นักวินิจฉัยพยายามที่จะรวมข้อดีของการวิเคราะห์ก่อนหน้านี้ทั้งหมดเข้ากับวิธีการใหม่ เพื่อขจัดข้อเสียที่มีอยู่เดิมทั้งหมด

เมื่อเร็ว ๆ นี้ในรายการมีบ่อยขึ้นเรื่อย ๆ ขั้นตอนการวินิจฉัยรวมถึงเอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์ - การทดสอบที่ทันสมัยและค่อนข้างใหม่ซึ่งไม่ค่อยมีใครรู้จัก ถึงคนธรรมดาคนหนึ่ง,ไม่เกี่ยวข้องกับการแพทย์. อย่างไรก็ตามเทคนิคนี้กำลังได้รับความนิยมในหมู่บุคลากรทางการแพทย์ที่มีคุณสมบัติเหมาะสมอย่างรวดเร็ว คุณสามารถลองคิดดูว่ามันคืออะไรและควรใช้ในกรณีใดโดยทำความคุ้นเคยกับคุณสมบัติและลักษณะสำคัญของมัน

เอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์เป็นเทคนิคในห้องปฏิบัติการโดยใช้ปฏิกิริยาโมเลกุล "แอนติเจน-แอนติบอดี" ซึ่งช่วยให้สามารถตรวจจับโปรตีนจำเพาะในวัสดุชีวภาพได้ (ตัวอย่างเพื่อการวิจัย) โปรตีนดังกล่าวอาจเป็นเอนไซม์ จุลินทรีย์ต่างๆ (ไวรัส แบคทีเรีย เชื้อรา) โปรโตซัว เป็นต้น

หลังจากค้นพบวิธีการดังกล่าวแล้วจึงได้รับชื่อการทดสอบ ELISA ซึ่งไม่เกี่ยวข้องกับชื่อผู้ค้นพบ แต่เป็นคำย่อ ชื่อเต็มวี ฉบับภาษาอังกฤษ- การทดสอบอิมมูโนซอร์เบนท์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์ แพทย์ทั่วโลกใช้ชื่อนี้ แพทย์บางคนในประเทศที่พูดภาษารัสเซียก็เรียกการวิจัยประเภทนี้เช่นกัน

หลักการพื้นฐานของวิธีนี้คือปฏิกิริยาโมเลกุล "แอนติเจน-แอนติบอดี"

แอนติเจนคือโมเลกุลแปลกปลอมใดๆ ที่เข้าไปภายใน ร่างกายมนุษย์เป็นส่วนหนึ่งของจุลินทรีย์ที่ทำให้เกิดโรค แอนติเจนมักเป็นโมเลกุลโปรตีน นอกจากจุลินทรีย์แล้ว “คนแปลกหน้า” ดังกล่าวอาจเป็นเซลล์เม็ดเลือดแปลกปลอมที่ไม่ตรงกับกลุ่มหรือปัจจัย Rh

เพื่อตอบสนองต่อการเข้าสู่ร่างกายของแอนติเจนจะมีการเปิดตัวปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันซึ่งมีจุดมุ่งหมายเพื่อป้องกันโมเลกุลแปลกปลอม สิ่งนี้เกิดขึ้นเนื่องจากการสังเคราะห์สารพิเศษของระบบภูมิคุ้มกัน - แอนติบอดี (อิมมูโนโกลบูลิน) แอนติบอดีแต่ละตัวเหมาะสำหรับแอนติเจนที่เฉพาะเจาะจงเท่านั้น และต่อต้าน "คนแปลกหน้า" ที่ทำให้เกิดโรคโดยจับเข้ากับแอนติเจนนั้นให้เป็นสารเชิงซ้อนเดียว เป็นกระบวนการจับกันที่เรียกว่าปฏิกิริยา "แอนติเจน-แอนติบอดี"

ประเภทของแอนติบอดี

แอนติบอดีทั้งหมด (อิมมูโนโกลบูลิน) แบ่งออกเป็น 5 ประเภท ขึ้นอยู่กับระยะของการตอบสนองทางภูมิคุ้มกันที่ปรากฏ:

สำหรับการวินิจฉัย ELISA ระดับที่สำคัญที่สุดคือ IgG อิมมูโนโกลบูลิน, IgM และ IgA คุณสามารถดูได้ว่าบุคคลนั้นเคยเป็นโรคนี้มาก่อนหรือติดเชื้อเมื่อเร็วๆ นี้ ไม่ว่าเขาจะพัฒนาภูมิคุ้มกันแล้วหรือร่างกายของเขาไม่สามารถป้องกันตนเองจากพยาธิสภาพได้หรือไม่

ข้อดีและข้อเสียของเอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์

ในขณะนี้ ELISA เป็นหนึ่งในวิธีการที่แม่นยำและละเอียดอ่อนที่สุด ได้รับการรับรองโดยผู้เชี่ยวชาญใน พื้นที่ที่แตกต่างกันยาและยังคงขยายขอบเขตการใช้งานต่อไป

ข้อดีของวิธีการ

• ข้อมูลที่ได้รับมีความแม่นยำสูง
• ความไว (ช่วยให้คุณตรวจจับสารที่ต้องการได้แม้ว่าจะมีเชื้อโรคอยู่ในตัวอย่างเพียงเล็กน้อยก็ตาม)
• ความเป็นไปได้ของการวินิจฉัยในช่วงวันแรกของการเจ็บป่วยหรือในระยะฟักตัว
• ความเร็วในการรับข้อมูลเมื่อเปรียบเทียบกับวิธีอื่นที่มีความแม่นยำใกล้เคียงกัน
• กระบวนการอัตโนมัติระดับสูงและการมีส่วนร่วมของมนุษย์น้อยที่สุด ซึ่งช่วยลดข้อผิดพลาดของนักแสดง
• การได้รับข้อมูลเกี่ยวกับขั้นตอนของกระบวนการทางพยาธิวิทยาและประสิทธิผลของการรักษาที่เลือก
• ไม่เจ็บปวดและรุกรานน้อยที่สุดเมื่อรวบรวมวัสดุ

ข้อเสียของวิธีการ

• ในกรณีส่วนใหญ่ จะช่วยให้คุณสามารถระบุการตอบสนองของร่างกายต่อสารก่อโรค ไม่ใช่ตัวเชื้อโรคเอง
• ก่อนการทดสอบ จะต้องทราบโรคที่ต้องสงสัยอย่างแน่ชัด เนื่องจากการทดสอบมีความเฉพาะเจาะจงสูง
• ความเป็นไปได้ที่จะอ่านค่าผิดพลาดที่เกิดจากปัญหาทางเทคนิค การรับประทานยา หรือการมีอยู่ของหลายรายการพร้อมกัน โรคเรื้อรังหรือการละเมิด กระบวนการเผาผลาญในร่างกายของผู้ป่วย
• การตีความผลลัพธ์ควรทำโดยผู้เชี่ยวชาญที่มีคุณสมบัติสูงเท่านั้น เนื่องจากในการตีความข้อมูลที่ได้รับจำเป็นต้องมีความรู้ การฝึกอบรมพิเศษและความรู้ทางการแพทย์มากมายเฉพาะด้าน
• ELISA เป็นการทดสอบที่ค่อนข้างหายาก ดังนั้นจึงไม่ได้ดำเนินการในห้องปฏิบัติการวินิจฉัยทุกแห่ง
• วิธีการนี้มีราคาค่อนข้างแพง เนื่องจากนอกเหนือจากรีเอเจนต์แล้ว ห้องปฏิบัติการจะต้องมีอุปกรณ์ราคาแพงจำนวนมากและตัวอย่างแอนติเจนที่ผลิตในสถาบันพิเศษ

เอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์ใช้ในกรณีใดบ้าง?

รายการข้อบ่งชี้ทั้งหมดสำหรับเอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์นั้นกว้างมากซึ่งรวมถึงยาเกือบทุกสาขา

ส่วนใหญ่แล้ว ELISA ใช้เพื่อวัตถุประสงค์ดังต่อไปนี้:

• บัตรประจำตัว โรคติดเชื้อ;
• การวินิจฉัยโรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์
• คำนิยาม สถานะภูมิคุ้มกันหรือโรคแพ้ภูมิตัวเองบางชนิด
• การระบุเครื่องหมายของเนื้องอก
• ความมุ่งมั่นของฮอร์โมน

กรณีติดเชื้อและ โรคไวรัสเทคนิคนี้ช่วยให้เราสามารถระบุโรคต่อไปนี้ได้:

นอกจากนี้ ELISA ยังช่วยให้คุณระบุสถานะของภาวะกล้ามเนื้อหัวใจตายได้อย่างรวดเร็วและมีประสิทธิภาพ ประเมินศักยภาพในการสืบพันธุ์ของร่างกาย ระบุโรคภูมิแพ้ แหล่งที่มา ฯลฯ

ใช้เทคนิคเอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์ในการทำ การทดลองทางคลินิกในระหว่างการพัฒนาสิ่งใหม่ ยาและในการประเมินผลกระทบต่อร่างกายมนุษย์

ประเภทของตัวอย่างและวิธีการคัดเลือกเพื่อการวิจัย

เนื้อหาที่มีการศึกษามากที่สุดสำหรับ เอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์เลือดที่ใช้จะถูกนำมาจากหลอดเลือดดำท่อนในของผู้ป่วย การเก็บตัวอย่างจะดำเนินการในขณะท้องว่าง โดยส่วนใหญ่ในตอนเช้า หลังจากการสุ่มตัวอย่าง เซลล์ที่เกิดขึ้นซึ่งขัดขวางการวิจัยจะถูกแยกและกำจัดออกจากเลือด เหลือเพียงซีรั่มเท่านั้น

เมื่อวินิจฉัย การติดเชื้อทางเดินปัสสาวะบ่อยครั้งที่วัสดุมีรอยเปื้อนจากเนื้อเยื่อเมือกของอวัยวะสืบพันธุ์ เมือกจากท่อปัสสาวะหรือปากมดลูก ตัวอย่างจากทวารหนัก รอยถลอกจากการกัดเซาะหรือแผลในบริเวณขาหนีบและจากส่วนอื่น ๆ ของร่างกาย สามารถใช้ Swabs ได้จาก ช่องปากรวมทั้งจากช่องจมูกด้วย

บางครั้งการใช้เอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์ในสูติศาสตร์และ การปฏิบัติทางนรีเวชในระหว่างตั้งครรภ์เพื่อตรวจสอบสถานะของน้ำคร่ำ ในกรณีนี้โมเดลจะกลายเป็น น้ำคร่ำ- เพื่อจุดประสงค์นี้พวกเขาไม่ได้ถูกเลือก จำนวนมากการให้น้ำโดยใช้เข็มยาวเจาะถุงน้ำคร่ำ กิจวัตรทั้งหมดดำเนินการด้วยเครื่องมือที่ปลอดเชื้อเพื่อลดความเสี่ยงที่อาจเกิดขึ้น

บ่อยครั้งที่วัสดุกลายเป็นกระดูกสันหลังหรือ ของเหลวเซรุ่ม- สิ่งนี้เกิดขึ้นเมื่อ ยาชาเฉพาะที่ซึ่งบริหารโดยการฉีด

ผู้เชี่ยวชาญที่ส่งเข้ารับการศึกษาควรชี้แจงว่าวัสดุประเภทใดที่จำเป็นสำหรับการตรวจวิเคราะห์ภูมิคุ้มกันของเอนไซม์ บ่อยครั้งจะมีการเก็บตัวอย่างหลายประเภทหรือจากสถานที่ต่างกันในคราวเดียว แพทย์ที่ส่งผู้ส่งต่อการตรวจประเภทนี้ควรแจ้งให้ผู้ป่วยทราบถึงการเตรียมการบริจาควัสดุชีวภาพด้วย

การเตรียมเอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์

เพื่อเพิ่มความแม่นยำของข้อมูลที่ได้รับหลังการตรวจเอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์ การเตรียมการเลือกวัสดุควรเป็นดังนี้:

• 10 วันก่อนการศึกษา ไม่รวมยาปฏิชีวนะ ยาต้านไวรัสและยาต้านเชื้อรา
• จำเป็นต้องยกเว้นเครื่องดื่มแอลกอฮอล์การสูบบุหรี่และเสพสารเสพติดในหนึ่งวัน
• ในช่วงเวลาเดียวกันมีความจำเป็นต้องหลีกเลี่ยงการออกแรงมากเกินไป
• เตือนผู้ป่วยเกี่ยวกับยาทั้งหมดที่ผู้ป่วยรับประทาน
• แจ้งแพทย์ของคุณหากคุณกำลังตั้งครรภ์หรือสงสัยว่าคุณกำลังตั้งครรภ์

จะเป็นการดีที่สุดหากรวบรวมวัสดุทดสอบในตอนเช้าขณะท้องว่าง

หากการวินิจฉัยมีจุดมุ่งหมายเพื่อกำหนดภาวะ ระดับฮอร์โมนดังนั้นสิ่งสำคัญคือต้องมั่นใจ รัฐสงบวันก่อนและหลีกเลี่ยงความตึงเครียดทางประสาท สำหรับผู้หญิงการบริจาคเลือดเพื่อฮอร์โมนจะกำหนดตามช่วงเวลาอย่างชัดเจน รอบเดือนซึ่งแพทย์จะหารือในเวลานัดหมาย

ก่อนสุ่มตัวอย่าง 2-3 วัน คุณต้องแยกอาหารทอดและอาหารที่มีไขมันออกจากเมนู และก่อนที่จะตรวจหาโรคตับอักเสบ ห้ามรับประทานผลไม้รสเปรี้ยวหรือผักและผลไม้สีส้มหรือสีเหลืองอื่น ๆ

การตีความผลลัพธ์ของเอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์

ผลการศึกษาเชิงคุณภาพมักจะระบุด้วยเครื่องหมาย "+" (ตรวจพบ) หรือ "-" (ไม่พบ)

จากการมีอยู่หรือไม่มีอิมมูโนโกลบูลินบางกลุ่มสามารถสรุปได้ดังต่อไปนี้:

• JgM (-), JgG (-), JgA (-) - ไม่มีภูมิคุ้มกันต่อโรคอย่างสมบูรณ์ (ร่างกายไม่เคยพบแอนติเจนประเภทนี้มาก่อน);
• JgM (-), JgG (+), JgA (-) - มีการชนกันครั้งก่อนกับแอนติเจนหรือวัคซีนนี้
• JgM (+), JgG (-/+), JgA (-/+) - กระบวนการทางพยาธิวิทยาเฉียบพลัน (น่าจะเป็นหลัก);
• JgM (-), JgG (+/-), JgA (+/-) - กระบวนการเรื้อรัง
• JgM (+), JgG (+), JgA (+) - การกำเริบของโรค;
• JgM (-) - ระยะของการฟื้นตัว

ค่าเชิงปริมาณมีภาระข้อมูลจำนวนมาก แต่มีเพียงแพทย์ที่เข้ารับการรักษาเท่านั้นที่สามารถตีความได้โดยอิงตามข้อบ่งชี้ก่อนหน้า อายุของผู้ป่วย และบรรทัดฐานของโรคเฉพาะแต่ละโรค ด้วยเหตุนี้คุณจึงไม่สามารถประเมินผลลัพธ์ด้วยตนเองได้

คุณต้องรอผลนานแค่ไหน?

เทคนิคนี้มีหลายรูปแบบ ขึ้นอยู่กับระยะเวลาในการรับข้อมูลในมือ ระยะเวลาเฉลี่ยการวินิจฉัยของ ELISA ใช้เวลา 4-6 ชั่วโมง ซึ่งช่วยให้คุณสามารถให้ผลลัพธ์ได้ในวันถัดไป

วิธีที่ยาวที่สุดใช้เวลาถึง 10 วัน เช่น กรณีติดเชื้อ HIV

กรณีมีความจำเป็นเร่งด่วนสามารถใช้วิธีเร่งด่วนได้ โดยจะได้รับคำตอบภายใน 1-2 ชั่วโมง

ฉันจะรับการทดสอบ ELISA ได้ที่ไหน

เนื่องจากอุปกรณ์สำหรับการวินิจฉัยประเภทนี้มีราคาค่อนข้างแพง ห้องปฏิบัติการบางแห่งจึงไม่สามารถซื้อได้ นอกจากนี้ การทดสอบที่มีแอนติเจนจำเพาะมีอายุการเก็บรักษาที่จำกัด (ปกติประมาณ 1 ปี) ดังนั้นจึงจำเป็นต้องได้รับการปรับปรุงอย่างต่อเนื่อง

ด้วยเหตุผลเหล่านี้รัฐบาล สถาบันการแพทย์ห้องปฏิบัติการของ ELISA อาจไม่พร้อมให้บริการเสมอไป ส่วนใหญ่มักจำเป็นต้องติดต่อศูนย์การแพทย์หรือศูนย์วินิจฉัยขนาดใหญ่เอกชนขนาดใหญ่

ในการทำการทดสอบ ELISA ห้องปฏิบัติการจะต้องมีใบอนุญาตพิเศษ และพนักงานและผู้ช่วยห้องปฏิบัติการจะต้องได้รับการฝึกอบรมพิเศษ

มักจะเฉพาะเจาะจงที่สุด ศูนย์วินิจฉัยหรือห้องปฏิบัติการแนะนำโดยแพทย์ส่งผู้ป่วยไปตรวจ

ต้นทุนของเอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์

ราคาสำหรับการศึกษาครั้งนี้ขึ้นอยู่กับภูมิภาคของประเทศและระดับของคลินิกที่ให้บริการ ในมอสโกราคาขั้นต่ำในการพิจารณาแอนติเจนหนึ่งตัวเริ่มต้นที่ 700 รูเบิล หากจำเป็นต้องระบุอิมมูโนโกลบูลินหลายตัวในคราวเดียว ราคาจะถูกบวกเพิ่ม

ในกรณีที่มีการวิเคราะห์อย่างเร่งด่วน ค่าใช้จ่ายจะเพิ่มขึ้น 150-200 รูเบิล สำหรับแอนติเจนแต่ละตัว

แม้จะมีค่าใช้จ่ายค่อนข้างสูง แต่เอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์ทำให้การตรวจผู้ป่วยเป็นไปอย่างให้ข้อมูลและรวดเร็วที่สุดเท่าที่จะเป็นไปได้ ซึ่งจะช่วยลดเวลาก่อนที่จะเริ่มการรักษาและช่วยให้สภาพของบุคคลคงที่เร็วขึ้น

วิดีโอนี้นำเสนอภาพยนตร์เรื่อง “พื้นฐานของเอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์”

การศึกษาของ ELISA ดำเนินการอย่างไร?

กลไกการเกิดปฏิกิริยา

การทดสอบอิมมูโนซอร์เบนท์ที่เชื่อมโยงกับเอนไซม์นั้นขึ้นอยู่กับปฏิกิริยาภูมิคุ้มกันของแอนติเจนกับแอนติบอดี และการติดแท็กของเอนไซม์กับแอนติบอดีทำให้พิจารณาผลของปฏิกิริยาแอนติเจน-แอนติบอดีโดยการปรากฏตัวของกิจกรรมของเอนไซม์หรือโดย การเปลี่ยนแปลงในระดับของมัน ในรูปแบบที่เรียบง่าย กลไกการเกิดปฏิกิริยาสามารถแสดงได้ดังนี้:

	ปฏิกิริยาแรกเกิดขึ้นระหว่าง Ig (Ab) ที่ตรวจพบและแอนติเจนของเชื้อโรคบริสุทธิ์ (Ag) ซึ่งจับจ้องอยู่ที่พื้นผิวของบ่อของแท็บเล็ตภูมิคุ้มกัน
	เพื่อระบุคอมเพล็กซ์ภูมิคุ้มกันที่เกิดขึ้น ปฏิกิริยาทางภูมิคุ้มกันครั้งที่สองจะดำเนินการโดยที่ Ig เฉพาะที่ถูกผูกไว้ทำหน้าที่เป็นแอนติเจนและคอนจูเกตที่เป็นตัวแทนของ Ig (Ab) กับ Ig ของมนุษย์ที่เกี่ยวข้องซึ่งมีป้ายกำกับด้วยเอนไซม์ - เพอรอกซิเดส (K) จะถูกใช้เป็นแอนติบอดีต่อมัน
	จากนั้นปฏิกิริยาของเอนไซม์จะเกิดขึ้นโดยเร่งปฏิกิริยาโดยส่วนเอนไซม์ของโมเลกุลคอนจูเกต สารตั้งต้นสำหรับปฏิกิริยานี้คือสารไม่มีสี - โครโมเจนซึ่งในระหว่างปฏิกิริยาจะเกิดสารสี ความเข้มของสีในบ่อขึ้นอยู่กับปริมาณของอิมมูโนโกลบูลินที่มีอยู่ในตัวอย่าง

การคำนวณผลลัพธ์

ดำเนินการตรวจเอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์

สำหรับการวินิจฉัยโรค จะใช้แผ่นโพลีสไตรีน 96 หลุมบนผนังของเซลล์ซึ่งมีการดูดซับแอนติเจนไว้ล่วงหน้า ซีรั่มทดสอบจะถูกเพิ่มเข้าไปในเซลล์ของแท็บเล็ต ในกรณีนี้จะมีการแนบแอนติบอดีที่คล้ายคลึงกับแอนติเจนไว้ แอนติบอดีที่ไม่ได้แนบจะถูกกำจัดออกโดยการล้าง ถัดไป แอนติบอดีต่ออิมมูโนโกลบูลินของมนุษย์ (แอนติบอดี) ที่มีฉลากเอนไซม์จะถูกเพิ่มเข้าไปในเซลล์ หากมีแอนติบอดีที่ตรวจพบได้ในซีรัมทดสอบ ในขั้นตอนนี้ แอนติบอดีเหล่านี้จะทำหน้าที่เป็นแอนติเจนซึ่งแอนติบอดีที่มีป้ายกำกับจะทำปฏิกิริยา การเติมสารโครโมเจนิก (สีย้อม) หลังจากการล้างจะช่วยให้เราคำนึงถึงปฏิกิริยาของสีที่กำลังพัฒนาในเซลล์ ความเข้มของสีเป็นสัดส่วนกับปริมาณของเอนไซม์ ดังนั้นปริมาณของแอนติบอดี เมื่อตรวจวัดความหนาแน่นของแสง (OD) ของของเหลวในเซลล์และเปรียบเทียบกับตัวอย่างควบคุม ความเข้มข้นของแอนติบอดีจะถูกคำนวณเป็นหน่วย ของปริมาตร ที่ใช้บ่อยที่สุดคือการคำนวณผลลัพธ์เป็นหน่วยของความหนาแน่นของแสงโดยคำนึงถึงว่าแต่ละระบบการทดสอบมีตัวบ่งชี้ของตัวเองในการบันทึกผลลัพธ์และตัวบ่งชี้ภาวะปกติและพยาธิวิทยาที่ควรได้รับคำแนะนำเมื่อตีความ ผลลัพธ์.

ELISA สามารถตรวจพบการติดเชื้อใดบ้าง

โดยหลักแล้วในกามโรคสมัยใหม่จะใช้ในการวินิจฉัยโรคซิฟิลิส (ร่วมกับปฏิกิริยาอื่น ๆ ) การติดเชื้อเอชไอวี ไวรัสตับอักเสบ มีค่าจำกัดในการวินิจฉัยการติดเชื้อหนองในเทียม การติดเชื้อไซโตเมกาโลไวรัส และการติดเชื้อเฮอร์พีติกอื่น ๆ เพื่อตรวจหาแอนติบอดีในโรคติดเชื้อต่างๆ ระดับของฮอร์โมน autoantibodies และเครื่องหมายต่างๆ ของมะเร็ง

วิธีการตีความผลลัพธ์ของ ELISA

การศึกษาการมีอยู่และระดับแอนติบอดีของประเภทต่างๆ ในบางกรณี จะช่วยกำหนดระยะได้ กระบวนการติดเชื้อ

ระยะของโรค	ไอจีเอ็ม	ไอจีเอ	ไอจีจี
ระยะปฐมภูมิ (2 สัปดาห์หลังจากติดเชื้อ)
ระยะปฐมภูมิ (2.5 - 3 สัปดาห์นับจากการติดเชื้อ)
ระยะปฐมภูมิ (3-4 สัปดาห์นับจากการติดเชื้อ)
อาการกำเริบของระยะเรื้อรัง (2 สัปดาห์นับจากเริ่มมีอาการกำเริบ)
ระยะเรื้อรัง
อดีต (หายจากการติดเชื้อ)
การกู้คืน		titer ลดลง 2-4 เท่าหลังจากนั้น การรักษาที่ประสบความสำเร็จ	titer ลดลง 4-8 เท่า ใน 1-1.5 เดือนหลังการรักษาสำเร็จ
ผลลัพธ์เชิงลบ

น่าเสียดายที่ข้อได้เปรียบที่สำคัญของ ELISA เช่น ปริมาณแอนติบอดีไม่ได้มีความสำคัญมากนัก งานภาคปฏิบัติ- เช่น. ไม่อนุญาตให้วินิจฉัยได้อย่างแม่นยำและไม่ส่งผลต่อปริมาณและระยะเวลาในการใช้ยา

วิธี ELISA มีบทบาทอย่างไรในการวินิจฉัยโรคซิฟิลิส

วิธี ELISA ในการวินิจฉัยโรคซิฟิลิสถูกนำมาใช้ครั้งแรกในปี พ.ศ. 2518 ปัจจุบันมีการใช้กันอย่างแพร่หลายในการวินิจฉัยโรคซิฟิลิสทางเซรุ่มวิทยาในรัสเซียและใช้เป็นการทดสอบยืนยันโรคซิฟิลิส มักจะดำเนินการศึกษาเพื่อระบุสิ่งที่เรียกว่า แอนติบอดีทั้งหมดไปยังแอนติเจนของ Treponema pallidum (IgM และ IgG) แม้ว่าในบางกรณีก็เป็นไปได้ที่จะระบุเฉพาะแอนติบอดีคลาส M "ระยะต้น" เท่านั้น ELISA สำหรับซิฟิลิสจะเป็นบวกหลังจาก 3 สัปดาห์นับจากช่วงเวลาของการติดเชื้อและยังคงเป็นบวกเป็นเวลานาน เวลานานแม้หลังการรักษา (บางครั้งตลอดชีวิต) ดังนั้นจึงไม่ใช้ ELISA เป็นการทดสอบเพื่อยืนยันการหายขาดของซิฟิลิส ในกรณีส่วนใหญ่ จะมีการดำเนินการเฉพาะการพิจารณาเชิงคุณภาพของ ELISA เท่านั้น เช่น เฉพาะผลลัพธ์ที่เป็นบวกหรือลบเท่านั้น ถึงแม้ว่าการระบุเชิงปริมาณก็สามารถทำได้เช่นกัน

สำหรับการประเมินสภาวะของร่างกายอย่างครอบคลุม (โดยเฉพาะ ฟังก์ชั่นการป้องกัน) มีการกำหนดการทดสอบเอนไซม์ที่เชื่อมโยงกับอิมมูโนซอร์เบนท์ (ELISA) การตรวจเลือดด้วย ELISA ดำเนินการเพื่อวินิจฉัยการติดเชื้อ ภูมิต้านตนเอง โรคทางโลหิตวิทยา ปฐมภูมิ และ โรคภูมิคุ้มกันบกพร่องทุติยภูมิ- ในบทความนี้ เราเสนอให้พิจารณารายละเอียดเพิ่มเติมว่าการตรวจเลือด ELISA คืออะไร รวมถึงข้อบ่งชี้ในการดำเนินการอย่างไร

บ่งชี้ในการกำหนดการตรวจเลือดโดยใช้วิธี ELISA และหลักการดำเนินการ

ดังที่เราได้กล่าวไปแล้ว การตรวจเลือดโดยใช้วิธี ELISA เป็นการทดสอบในห้องปฏิบัติการโดยตรวจหาแอนติเจนหรือแอนติบอดีในตัวอย่างเลือด การวิเคราะห์นี้ใช้ในการตรวจจับระดับของฮอร์โมน คอมเพล็กซ์ภูมิคุ้มกัน และอิมมูโนโกลบูลิน มี การอ่านต่อไปนี้สำหรับการวิเคราะห์ ELISA:

• การวินิจฉัยโรคภูมิแพ้
• การวินิจฉัยโรคที่มีต้นกำเนิดจากไวรัส – ไวรัสเอพสเตน-บาร์, เริม, ไวรัสตับอักเสบ, ไซโตเมกาโลไวรัส
• การวินิจฉัยโรคติดต่อทางเพศสัมพันธ์ - มัยโคพลาสมา, ยูเรียพลาสมา, ซิฟิลิส, ไตรโคโมแนส, หนองในเทียม
• ความหมายของภาวะภูมิคุ้มกันบกพร่อง
• การวินิจฉัยโรคทางเนื้องอก
• การประเมินประสิทธิผลของการบำบัด
• การกำหนดระดับฮอร์โมน
• การตรวจอย่างละเอียดก่อนการผ่าตัด

หลักการทำงานของเอนไซม์อิมมูโนแอสเสย์นั้นขึ้นอยู่กับการตรวจเลือดเพื่อหาอิมมูโนโกลบูลิน (โปรตีนแอนติบอดีจำเพาะ) อิมมูโนโกลบูลินผลิตโดยระบบภูมิคุ้มกันเมื่อแอนติเจน (จุลินทรีย์จากภายนอก) เข้าสู่ร่างกายมนุษย์ โมเลกุลภูมิคุ้มกันเหล่านี้จับกับเชื้อโรคติดเชื้อต่างๆ และต่อต้านพวกมัน สำคัญ คุณสมบัติที่โดดเด่นอิมมูโนโกลบูลินนั้นมีความจำเพาะ เนื่องจากคุณลักษณะเหล่านี้ พวกมันจึงสามารถสร้างสารเชิงซ้อนแอนติเจน-แอนติบอดีได้โดยการจับกับแอนติเจนจำเพาะ เมื่อทำการตรวจเลือด ELISA ความซับซ้อนนี้จะถูกกำหนดทั้งในเชิงปริมาณและเชิงคุณภาพ

เพื่อดำเนินการ การศึกษาครั้งนี้มักใช้เลือดมนุษย์ อย่างไรก็ตาม คุณสามารถนำเนื้อหาดังกล่าวมาเป็นวัตถุดิบในการวิเคราะห์ได้ แก้วน้ำ, น้ำคร่ำ,น้ำไขสันหลัง. โดยปกติแล้วตัวอย่างเลือดจะถูกนำมาจากหลอดเลือดดำฝากครรภ์ของผู้ป่วย แนะนำให้บริจาคเลือดขณะท้องว่าง (ต้องผ่านเวลาอย่างน้อย 12 ชั่วโมง) นัดสุดท้ายอาหาร). หากผู้ป่วยใช้เวลา ยาคุณควรแจ้งให้แพทย์ทราบเนื่องจากบางส่วนอาจส่งผลต่อผลการทดสอบ ความน่าเชื่อถือของผลการทดสอบยังได้รับผลกระทบจากปริมาณยาและเครื่องดื่มแอลกอฮอล์อีกด้วย

การตีความการตรวจเลือดสำหรับ ELISA

แบบฟอร์มสำหรับการวิเคราะห์นี้มักจะระบุผลลัพธ์ที่เป็นลบ (-) หรือบวก (+) สำหรับการคำนวณอิมมูโนโกลบูลินแต่ละประเภท

เราเสนอให้พิจารณาการตีความการตีความที่เป็นไปได้ของการตรวจเลือด ELISA

• IgG, IgA จะไม่ถูกตรวจพบและ ผลลัพธ์ของไอจีเอ็มลบ – ฟื้นตัวอย่างสมบูรณ์
• ผลลัพธ์ของ IgM, IgA, IgG เป็นลบ – ไม่มีภูมิคุ้มกันต่อการติดเชื้อ
• ผลของ IgG, IgA เป็นบวกและลบ เช่นเดียวกับผลลัพธ์ของ IgM เป็นบวก - การปรากฏตัวของการติดเชื้อเฉียบพลัน
• เชิงบวก ผลลัพธ์ของไอจีจีและผลลบของ IgA และ IgM - ภูมิคุ้มกันหลังการฉีดวัคซีนหรือหลังการติดเชื้อ
• ผลลัพธ์เชิงบวกหรือเชิงลบของ IgG, IgA และผลลัพธ์เชิงลบของ IgM – การติดเชื้อเรื้อรัง
• ผลลัพธ์ของ IgG, IgM, IgA เป็นบวก - การกำเริบของพยาธิสภาพการติดเชื้อเรื้อรัง

ในการตรวจอิมมูโนแอสเสย์ของเอนไซม์ในเลือด นอกเหนือจากการระบุประเภทของแอนติบอดีแล้ว ตัวบ่งชี้เชิงปริมาณยังระบุอยู่ในบันทึกอีกด้วย อย่างไรก็ตาม มีเพียงแพทย์ที่เข้ารับการรักษาเท่านั้นที่ให้คำอธิบายอย่างละเอียดเกี่ยวกับเรื่องเหล่านี้

จุดแข็งและจุดอ่อนของการศึกษาครั้งนี้

• ต้นทุนค่อนข้างต่ำ
• ใช้งานง่าย
• ความเป็นไปได้ของการวินิจฉัยเปิดอยู่ ระยะเริ่มต้นสงสัยจะเป็นโรค
• ข้อมูลที่ได้รับมีความแม่นยำสูง
• ระยะเวลาอันสั้นในการได้รับผลการวิจัย
• ความสามารถในการติดตามการเปลี่ยนแปลงของการพัฒนากระบวนการติดเชื้อในร่างกาย
• การรวมกันในระดับสูงทำให้สามารถทำการสำรวจจำนวนมากได้
• ระบบอัตโนมัติของการวิจัยทุกขั้นตอน

ข้อเสียของการตรวจเลือดแบบ ELISA ก็คือสามารถทำได้ค่อนข้างมาก ในบางกรณีให้ผลบวกลวงหรือผลลบลวง นอกจากนี้ เมื่อทำการวิจัย นอกเหนือจากข้อผิดพลาดทางเทคนิคแล้วยังเป็นสาเหตุอีกด้วย ผลลัพธ์ที่ผิดพลาดผู้ป่วยอาจได้รับประโยชน์ ปัจจัยไขข้ออักเสบการปรากฏตัวของโรคเรื้อรัง (ซึ่งมีการผลิตแอนติบอดี) การรับประทานยาบางชนิด เวชภัณฑ์, ความผิดปกติของการเผาผลาญ

• โรคเยียร์ไดเอซิส
• โรคแอสคาเรียซิส
• โรคกระเพาะปัสสาวะอักเสบ
• โรคอะมีบา
• Trichinosis - การศึกษาดำเนินการมากกว่าหนึ่งครั้ง ระดับสูงสุดของแอนติบอดีถูกกำหนดที่ 4-12 สัปดาห์หลังการติดเชื้อ
• โรคแทเนีย
• Opisthorchiasis – ดำเนินการ การวินิจฉัยแยกโรคระหว่างเฉียบพลันและ รูปแบบเรื้อรังโรคต่างๆ
• ท็อกโซพลาสโมซิส
• Fascioliasis – ใน ระยะเฉียบพลันโรคจะถูกกำหนดโดยการมีแอนติบอดี้
• ลิชมาเนียที่ผิวหนังหรืออวัยวะภายใน

ดังนั้น เราสามารถสรุปได้ว่า: จำเป็นต้องมีการทดสอบ ELISA สำหรับปรสิตเพื่อระบุแอนติเจน (ของเสียจากปรสิตและการมีอยู่ของปรสิต) เช่นเดียวกับแอนติบอดี (อิมมูโนโกลบูลิน) ความเฉพาะเจาะจงของวิธีการวิจัยนี้ในการระบุปรสิตตามข้อมูลทางสถิติคือประมาณ 90% ด้วยการวิเคราะห์นี้ แพทย์จึงสามารถระบุชนิดของปรสิต จำนวนทั้งหมดได้อย่างแม่นยำ และยังติดตามการเปลี่ยนแปลงของการพัฒนาอีกด้วย กระบวนการทางพยาธิวิทยาเนื่องจากระดับแอนติบอดี