Imunitný blot v diagnóze HIV. Imunitný blot mechanizmus imunitného blot Praktické použitie

Imunoblotting -(Z angličtiny "." Blot "je škvrna) - spôsob identifikácie antigénov (alebo protilátok) so známymi sérami (alebo antigénmi). Je to kombinácia gélovej elektroforézy z ELISA. Spočiatku, bakteriálne bunky alebo virióny sú zničené ultrazvukom a potom metódou elektroforézy oddeľuje všetky antigény vírusov alebo bakteriálnych buniek a prijíma komerčné činidlo na špeciálnom nitrocelulózovom filme. Pri vykonávaní imunoblotovania na filme so známymi antigénmi sa aplikuje študované sérum pacienta. Po inkubácii a praní neopozrených protilátok sa pustí do ELISA - Antisérum sa aplikuje na imunoglobulínu osoby, ktorá je označená enzýmom a chromogénnym substrátom, mení maľbu pri interakcii s enzýmom. V prítomnosti komplexov antigén-protilátka-anti-Svetes na imunoglobulín-enzým na nosiči, objavujú sa maľované škvrny. Metóda imunoblotovania vám umožňuje oddelene detegovať protilátky proti rôznym antigénom patogénov (napríklad s infekciou HIV, imunoblotovanie odhaľuje protilátky na GP120, GP24 a iných vírusových antigénoch).

Rádioimunitná analýza (RIA)

Spôsob je založený na reakcii protilátky antigénu s použitím označenia antigénu alebo rádionuklidu protilátky. Ako označenie používa 125I, 14C, 3H, 51CR a iné rádionuklidy. Výsledné imunitné komplexy sa izolujú zo systému a určujú ich rádioaktivitu na počítadlách (β-žiarenie). Intenzita žiarenia je priamo úmerná počtu pripojených antigén a protilátkových molekúl.

Verzia pevnej fázy RIA s použitím značených protilátok alebo antigénov, sorbovaných v otvoroch polystyrénových panelov, je rozšírená.

RIA sa používa na identifikáciu mikróbov, vírusov, rôznych hormónov, enzýmov, liečivých látok, imunoglobulínov, ako aj iných látok obsiahnutých v materiáli podľa štúdie v menších koncentráciách 10-12-10-15 g / l.

Kontrolné otázky

Reakcia imunitnej bakteriolizácie: Aká je táto reakcia; Čo je to antigén, ktoré - protilátky, reakčný mechanizmus, spôsoby prípravku, praktické použitie. Reakcia imunitnej hemolýzy: potrebné zložky, spôsoby prípravy; Ovládanie, Praktická aplikácia. Reakcia lokálnej hemolýzy v géli (reakcia YERNE): Princíp reakcie, spôsoby prípravy, praktické použitie. Väzbová reakcia komplementu: Princíp reakcie; ktorý je vytvorený v interakcii imunitného séra so špecifickým antigénom; Čo sa stane s doplnkom, ak je súčasne prítomný? Aký je osud doplnku v prípade, že medzi antigénom a protilátkami neexistujú žiadnu špecifickú afinitu? S pomocou ktorej možno určiť reakciu, čo sa stalo s doplnkom; Prečo sa táto reakcia používa; Aký je viditeľný pozitívny výsledok RSK? Prečo? Čo je vlastnosť doplnku v prvej fáze RSK? V druhej fáze? Ak je konečný RSK hemolýzou, čo to znamená - pozitívny alebo negatívny výsledok? Vysvetlite výsledky: RSK + + + +, RSK + + +, RSK + +, RSK +. Pomenujte zložky prvého systému RSK a zložiek druhého systému RSK. Prečo by mal byť testovacie sérum inaktivované? Ako titrujte komplement? Hemolytické sérum: Čo obsahuje, ako sa dostanú, čo je titer a ako to určiť? Aké zvieratá sa používajú na získanie zložiek RSK? Metodika RSK v zime. Pri stanovovaní z toho z uvedených reakcií je potrebné na účasť komplementu: zrážky, flokulácia, aglutinácia, detekcia neúplných protilátok, imunitnej bakteriolizácie, imunitnej hemolýzy, YERNE, RSK? Imunofluorescenčná reakcia (útes) - Špecifikujte sekvenciu udalostí s priamou reakciou kunov; Požadované zložky. Čo je to antigén, ktoré - protilátky, ako označené protilátky, pretože výsledok reakcie sa berie do úvahy, čo vyzerá pozitívny výsledok? Praktická aplikácia - Čo môže byť určená touto reakciou? Nepriama imunofluorescenčná reakcia - špecifikujte sekvenciu udalostí s touto reakciou, nevyhnutnými zložkami, čo je antigén, ktoré sa aplikujú imunitné série; Praktické použitie; Výhodou nepriameho útesu v porovnaní s priamou reakciou. IMUNOENIMEN ANALÝZA (IFA) - zásada reakcie; potrebné zložky; Uveďte postupnosť udalostí, keď je formulácia reakcie, aby sa detegoval antigén v štúdii materiálu; potrebné zložky; Čo sa stane s pozitívnym výsledkom, čo vyzerá? Uveďte postupnosť účinku pri vykonávaní ELISA, aby ste detegovali protilátky v testovacom sére; potrebné zložky; Čo sa stane s pozitívnym výsledkom? Immunobloting je princíp reakcie; Hlavné kroky; potrebné zložky; Výsledok sa zohľadňuje; Výhody reakcie. Rádioimunitná analýza (RIA) - Z ktorého základných etáp reakcia je reakcia; Čo je označené protilátkami alebo antigénmi, ako výsledok zohľadňuje? Immunoelektronická mikroskopia - princíp metódy; Hlavné kroky; potrebné zložky; ako označené protilátky; Výsledok reakcie sa berie do úvahy. Imobilizačné reakcie - princíp metódy, technikových produkcií, komponentov, účtovných výsledkov.

Úlohy na vykonávanie v procese vlastného prípravy.

Vyplňte tabuľku "imunitne reakcia" s ohľadom na reakcie demontované v rámci tejto témy.

Reakcie imunity

Študentská práca v praktickej lekcii

Práca začína okamžite z Nastavenia 1 fázy RSK, ale nahrávanie notebooku neskôr (pozri nižšie).

1. Reakcia imunitnej hemolýzy. Zobraziť demonštračnú reakciu imunitnej hemolýzy, náčrty vo forme schémy, vysvetliť výsledok v skúsených a v kontrolných trubkách.

2. Doplnková záväzná reakcia

a) Demontujte RSK na stole;

b) Nakreslite v notebooku, ktorý nastaví RSK vo forme tabuľky;

c) položte druhú fázu RSK (prvá fáza je umiestnená na začiatku triedy);

d) demontovať diagnostické prípravky potrebné pre RSK;

e) Zohľadniť výsledok. Vypravte záver o prítomnosti špecifických protilátok v testovacom sére.

3. Imunofluorescenčná reakcia. Preskúmajte tabuľku, vytvorte graf reakcie formulácie v notebooku; Pozrite sa na diagnostické sérum; Určite - ktorý obsahuje sérum, ako je varené, pre ktoré sa aplikuje reakcia (priamy alebo nepriamy útes). Pozrite si demonštračný výsledok útesu v luminiscenčnom mikroskope.

4. Immuno enzýmová analýza (ELISA). V notebooku, diagram prípravku reakcie v dvoch verziách: na detekciu antigénu v stave pod štúdiom a na detekciu sérových protilátok. Pozrite sa na súbor zložiek na diagnostiku HIV infekcie a hepatitídy V. Určite, že obsahuje každú zložku a pre ktorú sa aplikuje.

5. Immunobloting. Vykonať reakčnú schému v notebooku; Pozrite sa na demonštráciu - výsledok reakcie.

6. Rádioimunitná analýza (RIA). Vykonať reakčnú schému v notebooku.

7. Mikroskopia imunitnej elektróny (IEM). Pozrite sa na demonštráciu - výsledok reakcie, vykonať reakčnú schému v notebooku, uveďte ramená antigén (vírus) a označené protilátky.

Immunobloting je vysoko citlivý spôsob detekcie proteínov na základe kombinácie elektroforézy a ELISA alebo RIA. Imunoblotovanie sa používa ako diagnostická metóda pre infekciu HIV atď.

Vo všeobecnom zmysle imunobloting chápe analýzu zmesi proteínov prenesených do pevnej substrátovej membrány, s ktorou sú spojené s kovalentnými väzbami, po ktorom nasleduje imunózna.

Môžete analyzovať zmes proteínov priamo aplikovaných na substrát - bod-bod-blot analýza - alebo po jej predbežnej frakcionácii spôsobmi elektrickým, disk-elektroforéza alebo dvojrozmerná elektroforéza - Western blot analýza (Western blotting).

Antigény patogénu sú oddelené elektroforézou v polyakrylamidovom géli, potom ich prenášajú z gélu do aktivovaného papiera alebo nitrocelulózovej membrány a prejavujú sa pomocou ELISA.

Firmy produkujú takéto prúžky s "blotmi" antigénov. Na tieto pásy sa aplikuje choré sérum. . Potom, po inkubácii, sú prane z nereaktívnych protilátok pacienta a séra proti ľudským imunoglobulínom, označeným enzýmom . Komplex (antigén + protilátka + protilátka + protilátka antigén + antigén + protilátka) sa deteguje pridaním chromogénneho substrátu mení farbu pod pôsobením enzýmu.

Takáto metodika sa tiež používa na výber baktérií, fágov alebo vírusov exprimujúcich cieľové klonované génové produkty.

Prenos proteínov na membránu sa vykonáva buď pasívne alebo používanie zariadenia na elektrinu. Účinnosť prevodu proteínu na membránu je ovplyvnená mnohými faktormi, ako je molekulová hmotnosť proteínov, gélová pórovitosť, čas prenosu a zloženie použitého pufra použitého (Trans Buffer).

V závislosti od úloh a podmienok experimentu sa zvolení podmienky prenosu poskytujú najlepšie výsledky. Nitrocelulózové, polyvinylizididyluorid (PVDF) alebo pozitívne nabité nylonové membrány sa zvyčajne používajú ako substráty. Nitrocelulóza sa môže viazať na 80 - 100 ug proteínu na 1 cm2.

Proteíny s nízkou molekulovou hmotnosťou (s molekulovou hmotnosťou menšou ako 20 kDa) sa môžu stratiť v dôsledku umývania schopnosti predbežne preskúmať polymorfizmus určitých genetických lokusov na dĺžkach zodpovedajúcich reštrikčných fragmentov DNA.

Okrem toho, s použitím hybridizácie podľa SAREW, je ľahké zistiť, či cieľový gén má časť hydrolýzy určitého obmedzenia vo svojej vnútornej časti, ktorá vám umožní vybrať si optimálnu stratégiu pre klonovanie študovanej oblasti genómu.

Podobnou schémou agarózového gélu na nitrocelulózovom filtri sa môžu preniesť molekuly RNA. Táto metóda bola pomenovaná severným blotom (severným blotom) na rozdiel od južného blotovacieho blotovania, pretože južné južné jazykové priezvisko znamená "juh".

Prenos do filtrov z proteínového gélu bol nazývaný Western blotting (Western blotting). Veľké proteíny (viac ako 100 kDa), denaturované v roztoku dodecylsulfátu sodného (SDS), môžu byť slabo prenesené do membrány, ak je v Transferom prítomný etanol. Alkohol významne zlepšuje prenos proteínov s SDS polyakrylamidovým gélom, ale zužuje póry v géli, čo vedie k oneskoreniu veľkých proteínov.

Membrána PVDF je optimalizovaná pre imunóniu a je schopná zadržať špecificky spojené proteíny až do 160 ug / cm2 na veľmi nízkej úrovni nešpecifickej väzby.

Imunoblotovanie

Dôležitou vlastnosťou tejto membrány je možnosť jeho opakovaného použitia. Zeta-sonda nylonové membrány účinne viažu SDS proteíny v neprítomnosti alkoholu a táto väzba je odolná voči následným liečbe. Proteíny s nízkou molekulovou hmotnosťou sa tiež detegujú účinne. Kvôli vysokej väzbovej kapacite - približne 480 ug proteínu o 1 cm2 - zeta-sond membrány umožňujú detekciu stopových množstiev proteínu v analyzovaných zmesiach.

Potom, čo sa antigén ukáže, že je imobilizovaný na membráne, zostávajúce väzbové centrá blokujú želatínové roztoky alebo bovinné sérové \u200b\u200balbumín, alebo odstredené mlieko.

Membrána sa potom inkubuje v roztoku polyklonálnych alebo monoklonálnych protilátok proti štúdiu anti-génu. Po premývaní neviazaných protilátok sa membrána inkubuje v roztoku sekundárnych protilátok, ktoré sú konjugát enzýmom alkalických fosfatázy (alkalická fosfatáza, Ar) alebo chren peroxidáza (Horseradish peroxidáza, HRP) s protilátkami proti lásky (kozie protilátky proti imunoglobulínu Králik, myš alebo ľudia) alebo proteíny (stafylococcus aureus proteín) alebo g (proteín streptococcus sp.), ktorý má vysokú afinitu k Fc oblasti imunoglobulínov.

Detekcia vzdelaných imunitných komplexov sa vykonáva s chemickým alebo chemiluminiscenčným spôsobom. Substráty pre chemickú reakciu s použitím konjugátov s alkalickou fosfatázou sú 5-bróm-4-chlór-3-indolylfosfát (BCIP) alebo tetrazolium modrá (NBT) a pri použití konjugátov Krena peroxidázy - 4-chlór-1-nafthol a peroxid vodíka.

V dôsledku enzymatických reakcií na membráne je na lokalizačnej lokalizačnej lokalizácii komplexu antigénovej protilátky vytvorená maľovaný pás alebo bod.

Citlivosťou tejto metódy je 100 ghg proteínu pri použití konjugátov Ar a 100-500 GH pri použití konjugátov HRP. Chemiluminiscenčná detekcia imunitných komplexov vám umožňuje určiť menej ako 5 pg antigénu. Princíp tejto metódy spočíva v tom, že s HRP reakciou s peroxidom vodíka a cyklickým diacelhydrazinyluhnúzlom, dochádza k emisii svetla vlnovej dĺžky 428 nm, ktoré môžu byť upevnené na fotosenzitívnom filme.

Imunoblotovacia reakcia (Ri) je vyvinutá na základe ELISA. Je to najdôležitejšia a citlivá metóda imunochemickej analýzy. Imunoblotovanie (z anglického bloty - žiara, škvrna) kombinuje IFA s elektroforézou. Používa sa na identifikáciu nekomplexných protilátok proti HIV a protilátkam na jeho oddelené štruktúrne proteíny (proteíny-P24, glykoproteín-GR120, GR 41 atď.). Odkazujú na expertné (podporné) reakcie diagnózy infekcie HIV.

Reakcia sa uskutočňuje v niekoľkých stupňoch:

Vírus je zničený komponentmi - antigény (P24, GR120, GR 41, atď.), Ktoré sú podrobené elektroforéze v polyakrylamidovom géli, to znamená separáciu antigénov na frakciách molekulovej hmotnosti.

2. Gél je pokrytý nitrocelulózou membránou a frakcie antigénov sa na neho prenášajú pomocou elektroforézy. Nitrocelulóza sa správa ako zavlažovací papier. Membrána je narezaná na prúžky (prúžky). Firmy produkujú takéto prúžky s "blotmi" antigénov.

Immunobloting - Ďalšia nepriama metóda

Streams s HIV antigénami nasadenými na ňom sú ponorené do séru vyšetreného a potom odmývajú od nestranného materiálu.

4. Street sa inkubujú s antihylobulínovým sérom, označeným peroxidázou, premyté.

Pridá sa substrát a je zaznamenaný počet lakovaných frakcií (spotov), \u200b\u200bktoré zodpovedajú lokalizačnej zóne ag-at komplexu.

Prítomnosť pásov v určitých častiach pásu potvrdzuje prítomnosť protilátok v študovanom sére na striktne definované HIV antigény. Výsledok imunoblotovania sa považuje za pozitívny, ak membrána znázorňuje pásy zodpovedajúce dvom troch z troch HIV antigénov - P24, GP41 a GP 120 (obr. 37).

Obraz

Zoznam použitá literatúra

Hlavná literatúra

Lekárska mikrobiológia, virológia a imunológia: učebnica pre študentov medu. Univerzity 2. ed., Univerzita. a pridať. - 702 p. Ed. A.A. Sparrow. M.: MIA, 2012.

2. Mikrobiológia, Virológia a imunológia: Manuál pre laboratórne triedy: štúdie. Obete / (V.B.Subacov atď.); Ed. VB SUBACHAKOVA, M.M. KARAPATSA. - M.: GoOTar Media, 2014.- 320С.: IL.

3. Lekárska mikrobiológia, imunológia a virológia [Elektronický zdroj]: Návod na med.

univerzity - 760 p. - Prístupový režim: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Kijiyev A.I., Babichev S.A. Petrohrad: speclit, 2010.

4. Zdravotná mikrobiológia, Virológia a imunológia [Elektronický zdroj]: Návod: v 2 t. / T. 1. - 448 p. - Prístupový režim: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.

M.: GoOTar Media, 2010.

5. Zdravotná mikrobiológia, Virológia a imunológia [Elektronický zdroj]: Návod: 2 tony. T. 2. - 480 p. Prístupový režim: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. M.: GoOTar Media, 2010.

Dodatočná literatúra

1. Imunodiagnostické reakcie: Tutoriál / Cena: G. K. DAVENTSHINA, Z.G. GAGABIDLIN, A.A. AAHTARIEVA, M.M.TUIGUNOV, A.K. BULGAKOV, T.A. SAVCHENKO, R.F.

Husnarizanova, Yu.Z. Gabidullin, M.M. Elsynbaev - UFA: Vydavateľstvo GBOU VPO BGMU Ministerstva zdravotníctva Ruska, 2016. - 86c.

2. Vlastnosti niektorých vlastností, ktoré určujú patogénny potenciál Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E. coli, Proteus, Serratia, E. coli, Proteus: Vedecké vydanie / YU. Z. Gabidullin, RS SUFIYAROV, II DOLGUSHIN - UFA, 2015. - 250 s.

Domov »Immunoblot - Čo je to? Immunoblot v diagnostike infekčných chorôb

Immunoblot - Čo je to? Immunoblot v diagnostike infekčných chorôb

Čo je imunoblot? Ide o spoločný spôsob laboratórnej diagnostiky ľudských vírusových infekcií. Je to jeden z najpresnejších a spoľahlivých spôsobov, ako zistiť HIV.

Pre spoľahlivosť je ešte viac ako enzým pripojený test imunoosorbent (ELISA). Imunoblotové výsledky sa považujú za nevyvrátiteľné a konečné.

Immunoblot - Čo je to? Aby ste rozpoznali osobu HIV, musíte prejsť laboratórnou skúšobnou metódou krvného séra pre protilátky.

Rezy Western Blot sú tiež nazývané Western blot (Western Blot). Používa sa na detekciu ľudských vírusových infekcií ako dodatočnú odbornú metódu. To je potrebné potvrdiť ELISA - laboratórnu štúdiu, ktorá umožňuje stanoviť prítomnosť protilátok proti HIV v krvi. Imunoblot sa vzťahujú pozitívne ELISA.

Je to považované za najcitlivejšie, zložité a drahé.

účel

Čo je imunoblot? Tento spôsob laboratórnych testov sérových testov na prítomnosť protilátok k vírusu.

V priebehu špeciálneho výskumu, celkové vírusové proteíny v gélových a nitrocelulózových membránach.

Immunoblotovanie (detekcia protilátok u pacientov s v sére na určité antigény patogénov)

Navrhnutý postup pre západné škvrny na určenie infekcie HIV v rôznych stupňoch. V prvej fáze sa purifikovaný vírus z súčastí zložiek podrobí elektroforéze a antigénom, ktoré sú zahrnuté v nej rozdelené do molekulovej hmotnosti.

Plemená vírusov ľudskej imunodeficiencie v živých bunkách implementovali vo svojich genetických informáciách. V tomto štádiu sa osoba stáva nositeľom vírusu HIV, ak ste boli infikovaní.

Špecifiká tejto choroby spočívajú v tom, že sa už dlho prejavuje. Vírus ničí lymfocyty, teda človek znižuje imunitu a telo sa nedá vysporiadať s infekciami.

Ak je HIV správny a včasný, pacient bude žiť hlboko starobe. Nedostatočná liečba nevyhnutne vedie k smrti. Od infekcie, ale bez liečby, maximálne obdobie najviac desať rokov.

Vlastnosti

Analýza imunoblot je spoľahlivá metóda, ktorá vám umožní určiť prítomnosť protilátok proti antigénom HIV prvého a druhého typu.

Ak je osoba infikovaná, po dvoch týždňoch protilátok, ktoré možno výrazne objaviť. Funkcia HIV je, že množstvo protilátok sa rýchlo zvyšuje a zostáva v krvi pacienta. Aj keď sú prítomné, choroba sa nemusí prejaviť dvakrát alebo viac rokov. Metóda ELISA nie vždy presne indikuje ochorenie, ktoré vyžaduje potvrdenie výsledkov z častí PCR a Western blot, ak imunozmieznotvorná analýza vykazovala pozitívny výsledok.

Indikácie K.

Aký druh "imunoblot" už zistil, ale ktoré sú zavedené do štúdie?

Dôvodom inšpekcie imunoblózu ľudskej imunodeficiencie (HIV) sa stane pozitívnym výsledkom ELISA. U pacientov, ktorí musia mať operáciu, je potrebné ísť cez analýzu imunotestov s pevnou fázou. Okrem toho musíte urobiť analýzu tehotenstva žien, ako aj tých, ktorí zvyšujú chaotický život. Rezy Western Blot sú predpísané pacientom s infekciou HIV, ak sú výsledky ELISA pochybné.

Nasledujúce rušivé príznaky môžu byť dôvodom na prístup k lekárovi: rýchla strata hmotnosti; slabosť, strata funkcií; črevných porúch (hnačka), ktorá trvá tri týždne; dehydratácia; horúčka; zvýšenie lymfatických uzlín v tele; rozvoj kandidózy , tuberkulóza, pneumónia, toxoplazmóza, exacerbácia herpes.

Pacient nemusí byť pripravený pred odovzdaním venóznej krvi.

8-10 hodín pred testom nejedzte. Neodporúča sa deň pred krvou nápojov alkoholu a kávy, ťažkými cvičeniami, vzhľadom na vzrušenie.

Kde analýzu?

Kde môžem prejsť testovaním HIV?

ELISA, Immunoblotová analýza vykonaná v mestských súkromných klinikách, výsledky sa poskytujú počas dňa. Možná je urgentná diagnostika. Vo verejných inštitúciách, ELISA Lekárske testy a sekcie Western Blot zdarma v súlade s právnymi predpismi Ruskej federácie.

Povinná kontrola infekčných chorôb tehotných žien a pacientov, ktorí potrebujú hospitalizáciu alebo operáciu. Ako sa táto štúdia uskutočňuje?

Ako držať ELISA? Imunoblot pozitívny / negatívny potvrdzuje alebo vyvráti výsledky ELISA. Postup je pomerne jednoduchý. Špecialista berie plot venóznej krvi, trvá menej ako päť minút.

Po odbere vzoriek by mal byť miesto injekcie dezinfikovať a uviaznuť s omietkou. Plot je vykonávaný na prázdnom žalúdku, takže po zákroku nebude poškodený jesť horkú čokoládovú dlaždice alebo sladký teplý nápoj.

Ak chcete získať odporúčanie pre bezplatnú analýzu v štátnej lekárskej inštitúcii, musíte navštíviť terapeut.

Všeobecne platí, že imunoblot sa nelíši od iných krvných štúdií plotom. Metodika štúdie je jednoduchá. Ak je vírus prítomný v krvi osoby, telo na jeho zničenie začína produkovať protilátky. Pre každý vírus existuje mnoho proteínových antigénov. Detekcia týchto protilátok je základom sekcií sekcie Western Blot. Náklad

Koľko analýzy? Imunoblot HIV sa vzťahuje na lacný výskum.

V priemere je skríningové metódy imunotesy od 500 do 900 rubľov. Západné bloty sekcií je študovať inšpekciu, na ktoré sa pohybuje od troch do piatich tisíc rubľov. Komplexnejšie metódy sú oveľa drahšie. Napríklad na analýzu polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), bude potrebné zaplatiť asi 12 000 rubľov.

Interpretácia výsledkov

Najbežnejšie metódy diagnostikovania HIV infekcie je imunozmenikovou analýzou a imunoblotom.

Na stanovenie protilátok proti vírusu ľudskej imunodeficiencie. Infekcia sa typicky potvrdzuje dvoma testmi: skríning a potvrdenie. Výklad výsledkov by mal vykonať lekár, diagnostiky a predpisuje liečbu. Ak je imunoblot pozitívny, to znamená, že v ľudskom tele vírus.

Pozitívny výsledok by nemal byť dôvodom na samoobsluhu, pretože každý pacient môže mať svoje vlastné ochorenia ochorenia.

Kvalitatívna analýza zahŕňa skríning a certifikáciu. Ak pacient nerozpozná vírus, výsledok sa zobrazí "negatívne". Keď bol tento certifikát zistený, premietanie sa vykonáva ďalší výskum. Imunoblotová analýza, ktorá potvrdzuje alebo vyvracia skríning. Ak sa testovacie prúžky objavujú v stmavnutí niektorých oblastí (lokalizácia proteínov), diagnostika HIV je diagnostikovaná.

Ak sú výsledky pochybné, testy sa vykonávajú do troch mesiacov.

Aby sa zabránilo infekcii vírusu ľudskej imunodeficiencie, je možné dodržiavať určité pravidlá: Vyhnite sa náhodným sexuálnym kontaktom, pri kontakte používajte kondómy, nepoužívajte drogy.

Ak je choroba zistená v tehotnej žene, je dôležité dodržiavať odporúčania ošetrujúceho lekára, nezabudnite na testy na prítomnosť vírusu.

Čo je Western blotting?

Identifikácia proteínu srdcových zmesí alebo extraktov rôznych tkanív je jednou z najbežnejších úloh. Použitie takéhoto nástroja ako špecifické protilátky môžete definovať študovaný proteín s minimálnym dočasným a finančným nákladom.

V metóde Western Blotting (Western Blotting) v prvej fáze sa zmes proteínov oddelí elektroforézou v prítomnosti dodecylsulfátu sodného (DSN), potom sa prenesie do nitrocelulózovej membrány spôsobom elektrobility.

Podstatou tejto metódy je, že gél po elektroforéze je umiestnený na nitrocelulózovej membráne medzi vrstvami filtračného papiera. "Sendvič" zmontovaný týmto spôsobom je umiestnený v elektrickom poli, takže komplexy proteín-DSN sa pohybujú cez doskovú dosku a sú imobilizované (v dôsledku nešpecifickej sorpcie) na povrchu nitrocelulózovej membrány.

Väzbu komplexu proteín-DSN s nitrocelulózou membrány sa zúčastňujú na hlavnej silu elektrickej prírody a táto interakcia je multipoint a vedie k "tvarovaniu" proteínov na povrchu membrány. Po elektrickom sudoch sa teda dostaneme gélovú repliku na nitrocelulózu s proteínmi, ktoré sa nachádza rovnakým spôsobom ako v polyakrylamidovom géli.

Po vedení DSN - elektroforéza, elektrickej stopy a sorpcie proteínov z gélu na nitrocelulózovej membráne sa silne zmení terciárna konformácia proteínu, ak všeobecne správne rozpráva o existencii terciárnej štruktúry pre proteín po takom tuhé spracovanie. Preto sa pre imunochemickú detekciu proteínu podľa štúdie, zvyčajne používajú iba mono- alebo polyklonálne protilátky, špecifickosť proteínovej molekuly.

51. Immunologická analýza, imunoblotovanie. Kožušiny, komponenty, použitie.

Protilátky špecifické pre konformačné epitopy (alebo oblasti vrátane interrujúcich kontaktov) zvyčajne nie sú vhodné na použitie v metóde Western Blot.

Po prenesení proteínov sa membrána inkubuje postupne s protilátkami špecifickými pre štúdie proteínu a potom so sekundárnymi protilátkami, špecifické pre Fc fragmenty primárnych protilátok konjugovaných s enzýmom (alebo iným) štítkom (obr.

1 a). V prípade, keď je štítok konjugovaný priamo primárnym, špecifickým protilátkovým antigénom, sekundárne protilátky nie sú potrebné (obr. 1 b). Imunitné komplexy "sa prejavujú" vytvorené v lokalizácii študovaného proteínu s použitím chromogénneho substrátu (v závislosti od typu tagu).

Citlivosť a špecificita metódy je výrazne závislá, na ktorej sa protilátky používajú počas výskumu.

Použité protilátky by mali byť špecifické pre jedinečnú, charakteristiku študovaného proteínu aminokyselinovej sekvencie. V opačnom prípade je možné interakciu (najmä v prípade hrubých proteínových extraktov) protilátok s niekoľkými molekulami proteínu, čo zase povedie k vzniku niekoľkých farebných pásov na membráne.

Identifikácia štúdie proteínu v tomto prípade je často ťažké alebo nemožné.

Druhý dôležitý faktor, ktorý by mal byť pripomenutý pri výbere protilátok je afinita. Čím vyššia je afinita použitých protilátok, jasnejšie a jasnejšie sú proteínové pásy skórované, tým vyššia je citlivosť metódy. Pri použití ťažkostných protilátok je možné dosiahnuť citlivosť 1 ng a dokonca vyššia.

Na vizualizáciu výsledku interakcie membrány antigénu a protilátok sa používajú sekundárne protilátky konjugované s činidlami schopnými poskytnúť určitý signál za určitých podmienok.

Zvyčajne sa enzým (peroxidáza alebo fosfatáza) používa ako taký činidlo, produkt reakcie sa natretý a padá na membránu ako nerozpustnú zrazeninu.

Aj v tejto metóde je možné použiť fluorescenčné značky.

Obr. 1. Schéma imunochemického farbenia podľa štúdie proteínu: A - s použitím sekundárnych protilátok konjugovaných s enzýmovým štítkom; B - Primárna protilátka priamo konjugovaná s enzýmovým štítkom.

Protokol:

I. Príprava gélu a membrány a proteínového elektrického

Polyakrylamidový gél po elektroforéze sa umiestni do blotovacieho pufrového kúpeľa (25 mM Tris, pH 8,3, 192 mM glycín, 10% etanol).

Dva listy filtračného papiera, narezané na tvare kazety na blotovanie a navlhčenú s hrotom pre blot, sú umiestnené na tej časti kazety, ktorá bude adresovaná na anódu. Potom sa nitrocelulózová membrána umiestni na filtračný papier, ktorý nasleduje na vzduchové bubliny medzi membránou a papierom.

Potom by sa mal gél starostlivo umiestniť na membránu, obráťte sa osobitnú pozornosť na absenciu vzduchových bublín medzi gélom a membránou. Tvorba sendviča je dokončená dve vrstvy zvlhčeného filtračného papiera, ktoré sú umiestnené na povrchu gélu (obr. 2). Výsledný sendvič je upnutý do kazety a je umiestnený medzi elektródami tak, aby membrána smerovala k anóde.

Obr. 2. Schéma elektrických proteínov na membráne.

II. Elektrina

Elektrické proteíny na nitrocelulózovej membráne sa uskutočňujú v pufri obsahujúcom 25 mM tris, pH 8,3, 192 mM glycínu, 10% etanolu počas 30-50 minút pri konštantnom napätí 100 V.

Doba elektrického hrdla závisí od veľkosti prenosných proteínov, tým viac bielkovín, čím dlhšie sa vykonáva elektrický sud. Odhaduje sa kvalita elektrickej energie a umiestnenie proteínových pásov, zafarbia nitrocelulózovú membránu s 0,3% roztokom Ponceau S v 1% kyseline octovej. Pred vedením imunochemického farbenia by mala byť membrána prepláchnutá niekoľkokrát slabo alkalickým vodným roztokom Tris, aby sa odstránila farbivo s proteínmi.

III. Imunocemické farbenie proteínov imobilizovaných na nitrocelulózovej membráne

Ak chcete zablokovať nešpecifické viazacie miesta protilátok, sa membrána inkubuje s konštantným miešaním pri teplote miestnosti počas 30 minút na PBST (pre lepší zámok, môže sa použiť PBST roztok obsahujúci 10% suchého odstredeného mlieka).

Po blokovaní sa membrána inkubuje hodinu pri teplote miestnosti a konštantný v miešaní v PBST obsahujúcom 1-10 ug / ml špecifických protilátok.

Optimálna koncentrácia protilátok je vybraná empiricky a závisí od afinity interakcie protilátok s antigénom.

Na konci inkubácie sa membrána premyla 5-krát PBST a prenesením na roztok sekundárnych protilátok konjugovaných s chrenovou peroxidázou. Chov konjugátu zvyčajne označuje výrobca na obale, alebo je vybraný výskumníkom empiricky. V roztoku sekundárnych protilátok sa membrána inkubuje 1 hodinu s konštantným miešaním.

Po dôkladnom premytí (minimálne 5 - 6-krát sa PBST membrána prenesie do roztoku chromogénneho substrátu, obsahujúceho 3 mg diaminobenzidínu (DB) a 10 ul 30% peroxidu vodíka v 10 ml 0,1 M Tris-HCl , pH 7,6.

Inkubácia sa uskutočňuje za miešania 5 - 10 minút. Membrána po skončení inkubácie so substrátom by sa mala opláchnuť PBST, suché, žiariace s filtračným papierom a okamžite vykonať elektronickú kópiu, skenovanie farieb. Ak je membrána úplne vysušená, poškriabané proteínové prúžky sú bledé a obraz je menej svetlý a kontrast.

Poznámka: DUB je toxická látka a potenciálny karcinogén. Práca len v gumových rukavíc!

Immunobloting - diagnostická udalosť vykonaná v laboratórnych podmienkach, čo vedie k protilátkam na patogény rôznych ochorení. Jedným z nich je vírus ľudskej imunodeficiencie. Ihneď stojí za zmienku, že takáto štúdia ako HIV imunobloting je ďalšou udalosťou, ktorá je predpísaná na potvrdenie pozitívnych výsledkov ELISA.

Vírus ľudskej imunodeficiencie - Pomaly progresívna infekcia. S časom preniknutia do tela patogénov a pred prejavom prvých príznakov často prechádza dostatočne dlhú dobu, čo môže dosiahnuť niekoľko rokov.

V počiatočnom štádiu vývoja môžu byť klinické prejavy neprítomné. Zvýšiť celkovú teplotu, malátnosť, bolesť v hrdle, charakteristické symptómy infekcií HIV, človek zamieňa banálne zima a infekcia pokračuje v pokroku. Preto sa odporúčajú odborníci na HIV centrá, aby sa podrobili komplexnej diagnóze v takýchto prípadoch:

• ak sa stal nechránený sexuálny styk s novým partnerom;
• ak bola opätovne použitá jednorazová lekárska striekačka alebo ihla;
• ak bolo nedávno aplikované tetovanie alebo sa vykoná piercing;
• ak sa zistilo ďalšia infekcia, ktorej prenosová dráha je sexuálna (napríklad syfilis, bakteriálna vaginóza, kvapalina);
• ak sa vyskytol kontakt s infikovanou osobou.

HIV Immunoblot sa vykonáva s použitím krvného séra alebo plazmy. Štúdia na jednom prúžku vyžaduje 1,5-2 ml krvi alebo 15-25 μl séra.

Diagnostická udalosť vám umožňuje identifikovať protilátky nielen na vírus ľudskej imunodeficiencie, ale aj na iné patogény. Štúdia používa špeciálne súbory charakteristické pre rôzne ochorenia, napríklad:

• WSG1 a WSG2 IgM / IgG (na detekciu herpesvírusovej infekcie);
• Profil IgM (na detekciu toxoplazmózy, rubeole, cytomegalovírusovej infekcie, WSV 1 a WSV 2);
• VEB IGMTIGG (na identifikáciu vírusovej infekcie Epstein-Barr);
• HCV IgG (na identifikáciu vírusovej hepatitídy typu C).

Výsledok imunoblotovania môže byť pozitívny (keď protilátky) a negatívne (ak nie sú žiadne protilátky v biologickom materiáli), ako aj neisté, falošne pozitívne a falošne negatívne.

Kde môžete skontrolovať vírusovú infekciu a čo robiť ďalej

Každé polylinické, súkromné \u200b\u200blaboratórium, nemocnice, klinika sa špecializuje na podobnú diagnostickú udalosť. Skúšku môžete prejsť na testovacom centre HIV. Niektoré súkromné \u200b\u200bkliniky ponúkajú poradenské a testovacie služby pre vírus AIDS a HIV doma.

DÔLEŽITÉ! Po obdržaní výsledkov štúdie musíte kontaktovať lekára, aby ste priradili vhodnú liečbu.

Pozitívne testy

Ak sú výsledky imunoblot pozitívne, to neznamená, že infekcia HIV sa vyvíja v tele. Ak chcete potvrdiť diagnózu, sú predpísané aj iné štúdie, napríklad nepriame imunoflorcescencia.

Hoci metóda imunoblot je vysoko citlivá, v dôsledku definície imunoglobulínov triedy g, je v prvých 3 týždňoch po infekcii možný falošný pozitívny výsledok. V tomto prípade sa po určitom čase vykoná test.

Všetky dôvody na získanie falošne pozitívneho výsledku nie sú známe. Najčastejšie zdroje sú obdobie tehotenstva a nedávne zavedenie očkovacej látky imunopreparácie. Ak po určitom čase po vystavení takýmto imunoblovým faktorom na HIV je stále pozitívne, znamená to, že osoba je infikovaná.

Negatívny výsledok

Immunoblot môže poskytnúť negatívny výsledok, ktorý signalizuje absenciu protilátok v tele infekcie HIV v tele a v dôsledku úplného zdravia.

Negatívny imunoblot je často pozorovaný v "okennom období" (v prvých 3 mesiacoch medzi infekciou a vzhľadom protilátok v krvi). Počas tejto doby test nedeje zodpovedajúce protilátky, ale v inej tekutine (spermie, vaginálne oddelené) môže byť ukázané, že je vyrobený vo veľkých objemoch.

Ako sa vykoná analýza

Immunoblot vám umožňuje identifikovať protilátky štúdiom krvi a aplikovaním gélovej elektroforézy.

Po prvé, zničenie bakteriálnych buniek alebo ultrazvukových viriónov sa uskutočňuje, po ktorom elektroforézou - separácia všetkých vírusových antigénov alebo bakteriálnych buniek. Výsledkom je, že komerčné činidlo je umiestnené na špeciálnom nitrocelulózovom filme.

Počas prípravku imunoblotovania na materiáli so známym antigénom sa aplikuje testovacieho séra. Po inkubácii a praní neopozrených protilátok sa inkubovalo, imunimenálna analýza začína, aplikujú sa na sérum imunoglobulínov, ktoré sú označené enzýmom a chromogénnym substrátom, meniacou sa farbou pri kontakte s enzýmom.

Ak sú protilátky, miesta sú vytvorené na nosiči.

Pre imunoblotovanie pre HIV sa použije krv

Lineárna metóda

Lineárne škvrny pre HIV je nepriama imunologická štúdia, ktorá sa získa kvalitatívnym indikátorom Autoatantora IgG.

V priebehu imunologického výskumu využíva vírusovú látku formátu HIV alebo antigénov. V laboratórnych podmienkach kombinujú proteíny HIV a individuálnych protilátok, ktoré boli získané zo séra. Ďalej sa inkubácia uskutočňuje pridaním značených protilátok a ľudského imunoglobulínu.

Diagnóza HIV u novorodencov

V tele dieťaťa do 9 mesiacov, narodených z infikovanej ženy, existujú protilátky na HIV matku, ktorá sa stáva dôvodom na získanie falošne pozitívneho výsledku ELISA. Z tohto dôvodu sa uprednostňuje virologické testy - kvantitatívnu analýzu RNA a DNA PCR. Metóda kultúry diagnózy infekcie je citlivejšia.

DÔLEŽITÉ! Indikácie diagnostických opatrení na identifikáciu infekcie HIV u novorodencov sú: Narodenie infikovanej ženy, získanie pochybného výsledku predtým uskutočniteľnej analýzy.

Výskum počas tehotenstva

Vzhľadom k tomu, HIV infekcia, vyvíjanie tehotnej ženy, môže prejsť budúce dieťa, vyžaduje včasnú diagnózu pre vírus imunodeficiencie.

Po prvé, analýza imunotesy sa vykonáva ako skríning. Diagnostická udalosť pomáha detegovať protilátku proti infekcii v krvnom sére. Napriek presným výsledkom analýzy počas tehotenstva sa vyžaduje opätovný výskum.

Rôzne ELISA je imunitný blot, ktorý sa často používa počas tehotenstva. Podľa výsledkov diagnózy môžu byť protilátky odhaliť určité antigény, ktoré sú distribuované cez molekulovú hmotnosť elektroforézou.

Ako získať test

Imunitné blotovanie HIV vyžaduje špeciálne školenie, ako aj iné spôsoby diagnostiky ochorenia. Ak máte nejaké štúdium a získajte výsledky určitých indikátorov počas dňa (napríklad odpoveď na alergén), potom je potrebné darovať krv pre imunologickú analýzu len ráno.

Výsledky dekódovania

Dešifrovať Výsledky imunoblot vykonáva laboratórny pracovník. Ak sme zistili 2 z 3 proteínov HIV-1 alebo HIV-2, znamená to prítomnosť vhodnej infekcie v tele. Štúdia sa vykonáva na potvrdenie pozitívnej analýzy imunotestov. Preto sa reakcia kontroluje na takéto proteíny ako GP120 / 160, GP41 v kombinácii s P24. Ten je súčasťou troch génov AIDS - GAG POL a ENV.

Schematické zobrazenie imunoblotovacích výsledkov pre HIV

Primárna diagnóza zahŕňa štúdiu P25 proteínov, GP110 / 120 a GP160, čo naznačuje skorý štádium vývoja ochorenia. S pozitívnym výsledkom, ktorý poskytol druhý sérologický enzým imunotest, vykonáva sa imunoblot. Ak posledný pozitívny výsledok, je potvrdená diagnóza HIV.

Pravdepodobnosť pozitívneho výsledku závisí od obdobia, ktoré odovzdané od okamihu infekcie pred diagnózou:

• o 28 dní neskôr - 60-65%;
• o 42 dní neskôr - 80%;
• o 56 dní neskôr - 90%;
• o 84 dní neskôr - 95%.

Falošný pozitívny výsledok je možný, ak sa plot biologického materiálu pre ďalšiu diagnostiku uskutočnil počas tehotenstva, s porušením hormonálneho pozadia, dlhodobý potlačenie imunitnej funkcie s určitými prípravkami, ktoré osoba berie.

Kritériá hodnotenia analýzy

Výsledky analýzy ELISA a imunoblotovania musia spĺňať tieto kritériá: \\ t

• blot študovaného biologického materiálu sa zhoduje s vzorkou porovnávania blotov;
• molekulová hmotnosť hlavnej zistenej zložky spĺňa požiadavky špecifikácie.

Výsledky získané v špecializovanom laboratóriu budú najpresnejšie

Detekovateľná dodržiavanie a jeho obsah musia spĺňať požiadavky štandardného vzorového osvedčenia.

Nepretržité výsledky

V niektorých prípadoch imunoblotovanie pre HIV a AIDS nezodpovedá negatívnemu a pozitívnemu výsledku, lekár nemôže určiť skutočnú príčinu pochybných informácií. Často príčina nesprávnej interpretácie pôsobí infekciou spôsobeným iným sérotypom.

Na odstránenie pochybností, PCR a IFA sa konajú v dynamike. Pri absencii charakteristickej choroby symptómov pol roka a rizikových faktorov hovoria o plnom zdraví. V tomto štádiu sú diagnostické opatrenia pod napätím.

Drhujúci výsledok môže byť tiež získaný vo vývoji iného infekčného ochorenia, rakovinového neoplazmu, alergickej reakcie.

DÔLEŽITÉ! S pochybným výsledkom nemôže byť osoba darcom krvi a iný biologický materiál.

Typické chyby v diagnóze HIV infekcie

Plot biologického materiálu, dodania a dizajnu materiálov používaných pri vykonávaní laboratórnej diagnostiky musí spĺňať tieto pravidlá: \\ t

1. Sprievodná dokumentácia sa vydáva s názvom testovacieho systému, jeho skladovateľnosti a sérií.
2. Údaje o preskúmaných cestovných pasoch sú plne uvedené Passport podrobnosti o preskúmanom dátume, Miesto príjmu biologického materiálu.
3. Sérum je uložené nie dlhšie ako zavedené obdobie, prípustný objem BIOPTATTT je považovaný na štúdium - nie menej ako 2-5 ml.
4. Číslo na fľaši zodpovedá zadanému číslu v smere.
5. Plot biologického materiálu sa vyskytuje podľa zavedených pravidiel, a to z lakťa žily. V zložení krvného testu by nemali byť žiadne zrazeniny.

Pre plot materiálu sa použije suchá trubica. Novorodenci často prijímajú šnúrkovú krv, čo znamená, že takýto fakt v smere.

Typická chyba lekárov - skladovanie výsledného materiálu dlhšie ako 12 hodín pri teplote miestnosti a dlhšia ako 1 deň pri teplote 4-8 stupňov nad Celzia. Vzhľadom na nadchádzajúcu hemolýzu sú skreslené výsledky diagnostickej udalosti.

Takže na typické chyby počas diagnózy HIV infekcie zahŕňajú:

• nesprávny plot biologického materiálu;
• nesprávne skladovanie biopsie
• nesprávna preprava diagnostických systémov;
• dlhý testovací systém.

Dokonca aj kvalita vody použitá na umývanie kontajnerov je ovplyvnená výsledkom, ktorý je umiestnený v biologickom materiáli.

Po obdržaní výsledkov štúdie by mal laboratórny pracovník vydať záver pre lekára. Ak sa diagnóza vykonala v "okennom období", po určitom čase predpíše diagnózu. V každom prípade, aby sa diagnóza HIV infekcie nestačí jeden imunoblot. Potrebná je komplexná diagnóza.

V praxi laboratórnej diagnostiky infekčných ochorení nie je niekedy potrebné stanoviť protilátky vôbec na patogén, a na určité proteíny (antigény), to znamená spektrum špecifických protilátok. Ak na tento účel použije spôsob použitia analýzy imunotestov s pevnou fázou, potom v tomto prípade je potrebné zvýrazniť a čistiť potrebné antigény z kultúry patogénu. Výsledné proteíny sa aplikujú samostatne do pevnej fázy. V prípade použitia 96-lo-nočnej tablety - v každej jamke v jednom type antigénu. Potom sú špecifické protilátky určené nepriamejou metódou.

Podľa prítomnosti pozitívnej reakcie v studni s jedným alebo iným antigénom, môže posúdiť prítomnosť vhodných špecifických protilátok. Tento druh immunoopimen testovacích systémov ponúkajú výrobcovia, ale rozšírené, vďaka väčšej informative a jednoduchosti realizácie samotného výskumu, dostali metódu imunitného blika (Western blot).

Imunitné blotovanie vám umožňuje stanoviť protilátku v krvnom sére súčasne a zároveň diferencovaný pre všetky diagnosticky významné patogénové proteíny. Preklad z anglického Western blot znamená prevod západok (doslova). Príbeh tohto nezvyčajného obdobia je nasledovný.

Škevač južného názvu SAUSER (E. Southern) v roku 1975 sa prvýkrát navrhol spôsob prenosu elektroforetrov oddelených fragmentov DNA z gélu na membráne. Podľa autora, metóda a bol menovaný južný blot, čo znamená "South Transfer". Spôsob prenosu molekúl RNA zase bol špecialistami Nový severný blot - "Severný transfer". Najprv, v vtip, a potom tento názov bol stanovený v oficiálnej vedeckej literatúre.

G. Toyubin v roku 1979 publikoval výsledky prvých experimentov na bielkovinovom blob. V pokračovaní tradícií "geografických" položiek spôsobov prenosu biologických makromolekúl sa táto metóda nazývala "západná" transfer -western blot.

V prvej fáze tejto metódy sa elektroforetická separácia zmesi patogénových proteínov v polyakrylamidovom géli v prítomnosti dodecylsulfátu sodného uskutočňuje v prítomnosti dodecylsulfátu sodného (DSN). DSN, ktorá je povrchná látka, rovnomerne obklopuje molekuly proteínu a dáva mu záporný náboj približne rovnakými všetkými z nich. Preto sa molekuly pohybujú v elektrickom poli v jednom smere a rýchlosť propagácie závisí len od veľkosti molekuly (molekulová hmotnosť) proteínu.

V dôsledku elektroforetického postupu sa získa gélovú dosku, v hrúbke, z ktorých sú proteíny umiestnené vo forme samostatných tenkých líniových zón. V smere pohybu sú rozdelené do nasledujúceho poradia: Väčšia z veľkej molekulovej hmotnosti je bližšie k štartu, asi 120-150 kDa a povrch všetkých proteínov s hmotnosťou 5-10 kDa Advanced. V druhej fáze sa gélová doska aplikuje na nitrocelulózový list a zabráni tomuto konštrukcii medzi elektródami zdroja DC. Pod pôsobením elektrického poľa sa proteíny prúdia z porézneho gélu do hustlejšej membrány, kde sú pevne upevnené.

Výsledný blot sa spracuje blokovacím roztokom obsahujúcim ľahostajné proteínové a / alebo neiónové detergenty (Twin 20), ktoré sú blokované na membráne bez miesta antigénu. Potom sa membránový list narezaný na úzke prúžky tak, aby každý pás obsahoval všetky antigénne frakcie. Štáty opísané výrobca vykonáva.

V komerčných testovacích systémoch, na stanovenie protilátok podľa metódy imunitného blotovania, je už pripravená na štúdium blotov (pruhy alebo prúžky). Používateľ určuje celé spektrum špecifických protilátok proti proteínom patogénov podľa nepriamej metódy. Ako chromogen sa ako chromogen použije rozpustná bezfarebná látka, podľa ktorého získava maľovanie, sa stane nerozpustným a usadí sa (zrazení) na nitrocelulóze.

V dôsledku postupnej implementácie imunitnej a enzymatickej reakcie, v prítomnosti protilátok v študovanej vzorke, tmavé priečne pásy sa objavujú na bloti, ktorých umiestnenie sa nachádza v zóne určitých patogénových proteínov. Každý taký pás označuje prítomnosť špecifických protilátok proti príslušnému antigénu. Výsledok štúdie uskutočnenej metódou imunitného bloty sa vydáva vo forme prenosu protilátok na špecifické patogénové proteíny. Napríklad: "Protilátky proti proteínom P17 a P24 sú odhalené."

Nitrocelulózové bloty po prejave sa môžu uchovávať dlhé v sušenej forme. Avšak, intenzita farby v rovnakom čase je výrazne oslabená. Mokré bloty môžu byť fotografované alebo pomocou skenerov, aby zadali svoj grafický obraz do pamäte osobných počítačov. Špeciálne počítačové programy umožňujú spracovanie získaných výsledkov a rýchlo monitorovať reproduktorové spektrum protilátok počas dynamického pozorovania.

Immunobloting (imunoblot) je vysoko špecifická a vysoko citlivá referenčná metóda potvrdzujúca diagnózu pre pacientov s pozitívnymi alebo neistými výsledkami získaných analýz. Použitie RPGA alebo IFA .

Tento spôsob detekcie protilátok proti jednotlivým patogénovým antigénom je založený na formulácii ELISA na nitrocelulózových membránach, ktoré vo forme samostatných pásov sú náchylné na špecifické proteíny oddelené gélovou elektroforézou. Ak sú protilátky proti určitým antigénom, sa nachádza tmavá čiara v príslušnom strúse stristu. Jedinečnosť imunobltu spočíva v jeho vysokej informative a spoľahlivosti získaných výsledkov.

Materiál pre výskum Je sérum alebo krvná plazma. Na štúdium na rovnakom páse je potrebný 1,5-2 ml krvi alebo 15-25 ul séra.

Podľa odporúčania WHO, Immunobloting (Western Blot) sa používa v diagnóze HIV infekcie ako dodatočnú odbornú metódu, ktorá musí potvrdiť výsledky ELISA. Zvyčajne táto metóda obnoví pozitívny výsledok pre ELFA, pretože sa považuje za citlivejšie a špecifickejšie, hoci zložitejšie a drahé.

Imunitný blot kombinuje imuno-imunitú analýzu (ELISA) s predbežnou elektroforetickou separáciou vírusových proteínov v géli a ich prenos na nitrocelulózovú membránu. Postup imunoblot sa skladá z niekoľkých stupňov. Po prvé, vopred purifikované a zničené kompozitné zložky HIV sa podrobí elektroforéze, zatiaľ čo všetky antigény zahrnuté v víruse sú oddelené molekulovou hmotnosťou. Potom sa metóda blotovania antigénu prenesie z gélu do pásu nitrocelulózy alebo nylonového filtra, ktorý odteraz obsahuje neviditeľné spektrum proteínov charakteristických pre HIV. Ďalej je materiál (sérum, pacientka krvná plazma atď.) Aplikuje sa na pásik a ak existujú špecifické protilátky vo vzorke, sú spojené s prísne zodpovedajúcimi prúžkami proteínov-antigénov. V dôsledku následných manipulácií (podobne iFA) je výsledok tejto interakcie vizualizovaný - je to viditeľné. Prítomnosť pásov v určitých častiach pásu potvrdzuje prítomnosť protilátok v študovanom sére na striktne definované HIV antigény.

Imunitný blot je najčastejšie používaný na potvrdenie diagnózy HIV infekcie. Kto zvažuje pozitívne séra, v ktorých protilátky proti akémukoľvek dvom proteínom HIV shell sú detegované imunitným bliknutím. Podľa týchto odporúčaní, ak existuje reakcia s iba jedným z proteínov shell (GP160, GP120, GP41) v kombinácii alebo bez reakcie s inými proteínmi, výsledok sa považuje za pochybné a re-vyšetrenie sa odporúča pomocou množiny inej série alebo iná firma. Ak by to bol výsledok pochybný, výskum pokračuje každé 3 mesiace.

Vlastnosti

Imunoblotová analýza je spoľahlivá metóda, ktorá vám umožní určiť prítomnosť protilátok proti antigénom HIV prvého a druhého typu. Ak je osoba infikovaná, protilátky, ktoré môžu byť zistené a oveľa neskôr sa objavujú za dva týždne. Funkcia HIV je, že množstvo protilátok sa rýchlo zvyšuje a je zachovaná v krvi pacienta. Aj keď sú prítomné, choroba sa nemusí prejaviť do dvoch alebo viacerých rokov. Metóda ELISA nie je vždy presne stanovená prítomnosť ochorenia, preto potvrdenie výsledkov s použitím imunobloting a PCR, ak imunoassimenčná analýza vykazovala pozitívny výsledok.

Indikácia na vymenovanie

Čo je to "imunoblot" už zistené, ale kto predpíše túto štúdiu? Dôvodom prejsť testy pre vírus imunodeficiencie (HIV) metódou imunoblotovania sa stáva pozitívnym výsledkom ELISA. Je potrebné prejsť analýzou imunofementácie pacientom, ktorí budú prevádzkovaní. Okrem toho je potrebné urobiť analýzu žien plánovanie tehotenstva, ako aj pre každého, kto vedie chaotický sexuálny život. Immunoblotovanie pacientov s HIV, ak výsledky IFA spôsobujú pochybnosti.

Nasledujúce rušivé príznaky sa môžu stať dôvodom pre príťažlivosť pre lekára:

• ostré chudnutie;
• slabosť, strata výkonu;
• črevná porucha (hnačka), ktorá pokračuje tri týždne;
• dehydratácia tela;
• horúčka;
• zvýšenie lymfatických uzlín na tele;
• vývoj kandidózy, tuberkulózy, pneumónia, toxoplazmózy, exacerbácie herpes.

Pacient nemusí byť pripravený pred odovzdaním venóznej krvi. 8-10 hodín pred štúdiou sa nedá konzumovať. Neodporúča sa na jeden deň, kým sa krv podáva na použitie alkoholických a kávových nápojov, zapojte sa do ťažkého cvičenia, mávajúce vzrušenie.

Ako je štúdia?

Z hľadiska pacienta sa imunoblot nelíši od žiadnej inej analýzy: venózne krv sa odoberá, výsledok sa skúma a výsledok. Ale ak idete trochu viac podrobností, to nie je veľmi jednoduché, ale stále sa snaží prísť na to.

Spočiatku sa v prvom rade prijíma "referenčný" vírus ľudskej imunodeficiencie. Potom s pomocou špeciálneho postupu (elektroforéza) v gélovom prostredí je vírus zničený svojimi najmenšími zložkami: proteíny (vírusové antigény). Potom, s pomocou samotného blotovania (z angličtiny), sú častice umiestnené na špeciálnom materiáli - nitrocelulóza alebo nylonový filter, indikátor je pripravený na použitie, tzv. Pás je pásik, v ktorom antigény sú rozdelené v závislosti od ich molekulovej hmotnosti, v číre sekvencii, to znamená, že každý milimeter papier zodpovedá určitému proteínu.

Ako môžete vedieť, či existujú vírusy v krvi človeka, telo začne produkovať protilátky proti ich škrupinám (definované proteíny) protilátky a čo pre každý vírus má svoj vlastný individuálny antigénový proteínový proteín. Identifikácia protilátok proti antigénom proteíny v krvi je základom metódy imunoblot. Koniec koncov, ak protilátka čelí antigénu, určite navzájom komunikujú - "palica".

Takže antigény sú na páse pásu a v prípade prítomnosti v krvi podkladových vhodných antigénov, nevyhnutne vzájomne spolupracujú, a na tomto mieste, na páse pásu sa objaví indikátor - byt (ako tehotenský test). A na určitom mieste pásu, tak lekár pochopí, či existuje súbor proteínov charakteristických pre konkrétny vírus v krvi.

Tak napríklad, ak existuje stmavové centrum v mieste proteínov gP160, GP120, GP41hIV je diagnostikovaný, pre iné vírusy to bude úplne iná sada proteínov.

Treba poznamenať, že imunoblot vám umožňuje presne stanoviť prítomnosť vírusu len vtedy, ak je kompletná sada protilátok v krvi, to znamená, ak sú proteíny gp160, gp120, gp41 sú prítomné v rovnakom čase, potom je to 100 Infekcie HIV. Ale ak aspoň jeden nie je, napríklad: GP41 chýba a existuje len gp160, gp120, potom sa test považuje za pochybnú a vyžaduje opakovanie.

FAQ

Aké štádiá zahŕňajú imunoblot?

1. Príprava pásu.Predbežné purifikované a zničené kompozitné zložky, imunodeficiencie (HIV) sa podrobí elektroforéze, zatiaľ čo antigény zahrnuté v HIV sú oddelené molekulovou hmotnosťou. Potom blotovaním (analóg extrúzie na "mokré" nadbytočné atramentové) antigény sa prenášajú do nitrocelulózového pásu, ktorý odteraz obsahuje neviditeľný obraz antigénneho pásu spektra charakteristického pre HIV.
2. Štúdia vzorky.Skúšobný materiál (séra, krvná plazma pacienta, atď.) Sa aplikuje na nitrocelulózový pásik) a ak existujú špecifické protilátky vo vzorke, sú spojené s prísne zodpovedajúcimi (bezplatné) antigénne pruhy. V dôsledku následných manipulácií je výsledok tejto interakcie vizualizovaný - je to viditeľné.
3. Výklad výsledku.Prítomnosť pásov v určitých oblastiach nitrocelulózovej dosky potvrdzuje prítomnosť v študovanej sére protilátok na prísne definované HIV antigény.

• Strih A - Pozitívna kontrola
• Strih In - Slabo-lôžkové ovládanie
• Strip C - Negatívna kontrola
• Strip D je pozitívna vzorka (prítomnosť protilátok proti HIV-1 bola detegovaná)

Ako dešifrovať analýzu?

Ak IFA preukázala prítomnosť všetkých alebo takmer všetkých protilátok proti antigénom podľa tohto testovacieho systému, znamená to pozitívnu HIV analýzu. Ak je odpoveď po druhej sérologickej imunotestovej analýze pozitívna, potom sa musí vykonať imunoblot. Dekódovanie jej výsledkov bude správne. Ak enzýmová imunoassálna analýza poskytla pozitívny výsledok, nasledujúca analýza imunoblot tiež ukázala HIV, potom je konečný výsledok nastavený.

Keď sa analyzuje dešifrované, je potrebné vedieť, že pozitívny test HIV je určený:

• od 60% do 65% 28 dní po infekcii;
• v 80% - po 42 dňoch;
• 90% - po 56 dňoch;
• 95% - po 84 dňoch.

Ak je prijatá pozitívna reakcia HIV, znamená to, že protilátky proti vírusu sú odhalené. Aby ste sa vyhli falošne pozitívnej odozve, musíte prejsť znova analýzy, je to žiaduce dvakrát. Ak sa protilátky proti imunodeficiencii odhalia počas dodávky dvoch analýz z dvoch alebo s odovzdaním 3 testov v 2 z nich, sa usudzuje, že výsledok je pozitívny.

Antigén R22 môže byť zjavený v krvi po 14 dňoch od dátumu infekcie. Použitím spôsobu imunimálnej analýzy sa tento antigén deteguje od 14 do 56 dní. Po 60 dňoch už nie je v krvi. Iba keď je AIDS vytvorená v tele, rast tohto proteínu p24 v krvi sa opakuje. Skúšobné systémy analýzy imunoloky sa preto používajú na detekciu HIV v prvých dňoch infekcie buď, aby sa určilo, aká choroba sa vyskytuje a monitoruje proces liečby. Vysoká analytická citlivosť imunoopementálnej analýzy detekuje antigén P24 v biologickom materiáli v HIV prvého podtypu v koncentrácii od 5 do 10 pkg / ml, s druhým podtypovým HIV 0,5 ng / ml a menej.

Pod pochybný Výsledkom imuno-enzýmovej analýzy je určený, že počas diagnózy sa niekde mýlila, spravidla lekár zdravotníci zmätení, alebo u ľudí existujú známky infekcie a výsledok je negatívny, čo spôsobuje podozrenie, osoba je odoslané na prehodnotenie.

Pod falošne pozitívne Výsledkom je výsledok, keď sa uskutočnilo dodávanie krvných testov v nasledujúcich stavoch pacienta:

• tehotenstvo;
• ak má osoba porušené hormonálne pozadie;
• s predĺženou imunosupresiou.

Ako dešifrovať analýzu v tomto prípade? Falošný pozitívny výsledok je umiestnený, ak sa odhaľuje aspoň jeden proteín. Vzhľadom k tomu, že antigén P24 je veľmi závislý od individuálnych variácií, potom použitie tohto spôsobu, v prvom období infekcie sa deteguje od 20% do 30% pacientov.

Ako spoľahlivý je pozitívny výsledok testu?

Niekedy IFA má falošne pozitívne výsledky (asi 1% prípadov), príčinou tohto výsledku môže byť tehotenstvo, rôzne vírusové infekcie, ako aj jednoduchú nehodu. Po obdržaní pozitívneho výsledku, presnejší test - imunoblot, na základe výsledkov, z ktorých je diagnóza vyrobená. Pozitívny výsledok imunoblot po pozitívnom ELISA je spoľahlivý o 99,9% - to je maximálna presnosť pre akýkoľvek lekársky test. Ak je imunoblot negatívny, to znamená, že prvý test bol falošný a v skutočnosti HIV u ľudí.

Čo je to neurčitý (pochybný) výsledok?

Ak je IFA pozitívna alebo negatívna, potom imunoblot môže byť pozitívny, negatívny alebo neistý. Neurčitý výsledok imunoblot, t.j. Prítomnosť aspoň jedného proteínu v imunoblotov môže byť pozorovaná, ak sa infekcia nedávno stala a existuje menej protilátok proti HIV v krvi, v tomto prípade sa imunoblot stane pozitívnym po chvíli. Tiež sa neurčitý výsledok môže objaviť v neprítomnosti HIV infekcie v hepatitíde, niektoré chronické metabolické ochorenia, alebo počas tehotenstva. V tomto prípade bude imunoblot negatívny, alebo príčina neistého výsledku sa zistí.

Koľko je analýza?

Immunoblot na HIV sa nevzťahuje na lacný výskum. V priemere, skríningové vyšetrenie s metódami imunofementov stojí od 500 do 900 rubľov. Imunobloting je overenie štúdia, na ktoré sa pohybuje od troch do piatich tisíc rubľov. Komplexnejšie metódy sú oveľa drahšie. Napríklad na analýzu polymerázovej reťazovej reakcie (PCR), bude potrebné zaplatiť asi 12 000 rubľov.

Kde analýzu?

Kde môžem prejsť HIV? ELISA, imunoblot výskum sa vykonáva v mestských súkromných klinikách, výsledky sa vydávajú počas dňa. Možná je urgentná diagnostika. V štátnych zdravotníckych inštitúciách sa IFA testy a imunoblotovanie vykonávajú zadarmo, podľa legislatívy Ruskej federácie. V povinných, tehotných žien sa kontrolujú na infekčné choroby, ako aj pacienti, ktorí majú hospitalizáciu alebo prevádzkovú intervenciu.

Epizóda s pevnou fázou - Možnosť testu, keď je jedna zo zložiek imunitnej reakcie (antigén alebo protilátka) sorbovaná na pevnom nosiči, napríklad v jamkách polystyrénových tabliet. Zložky sú detegované pridaním značených protilátok alebo antigénov. S pozitívnym výsledkom sa farba chromogénu líši. Zakaždým po pridaní ďalšieho komponentu z jamiek sa nestranné reagencie odstránia praním,

Pri určovaní protilátok (ľavým výkresom) v jamkách s sorbovaným antigénom, postupne pridané sérum pacienta, antihyglobulínové sérum značené enzýmom a substrátom / chromogénom pre enzým.

II. Pri určovaní antigénu (vpravo obrázok) v jamkách s sorbedovými protilátkami sa pripraví antigén (napríklad. Sérum s výškovým antigénom), diagnostické sérum proti nemu a sekundárne protilátky (proti diagnostickému séru) označené enzýmom a potom Substrát / chromogén pre enzým.

Konkurenčné IFA na stanovenie antigénov: požadovaný antigén a antigén označený enzýmom súťažia navzájom pre väzbu obmedzeného množstva imunitných sérových protilátok.

Ďalším testom je konkurenčná ELISA na stanovenie protilátok: Požadované protilátky a protilátka označené protilátkami súťažia navzájom pre antigény, sorbón na pevnej fáze.

Imunoblotovanie - Vysoko citlivý spôsob detekovania proteínov na základe kombinácie elektroforézy a ELISA alebo RIA. Imunoblotovanie sa používa ako diagnostická metóda pre infekciu HIV atď.

Antigény patogénu sú oddelené elektroforézou v polyakrylamidovom géli, potom ich prenášajú z gélu do aktivovanej papierenskej nitrocelulózovej membrány a vykazujú s použitím ELISA. Firmy produkujú takéto prúžky s "blotmi" antigénov. Na tieto pásy sa aplikuje choré sérum. . Potom, po inkubácii, sú prane z nereaktívnych protilátok pacienta a séra proti ľudským imunoglobulínom, označeným enzýmom . (Antigén + protilátka + antigén antigén + protilátka + antigén antigén antigénu antigénu osoby] sa deteguje pridaním chromogénneho substrátu, ktorý sa mení farbou pod pôsobením enzýmu.

52. Interferóny, príroda. Metódy získavania a používania.

Interferónoznačuje dôležité ochranné proteíny imunitného systému. Otvorené pri štúdiu interferencie vírusov, t.j. javov, keď zvieratá alebo kultúry buniek infikovaných jedným vírusom sa necitliví na infekciu iným vírusom. Ukázalo sa, že interferencia bola spôsobená výsledným proteínom s ochrannou antivírusovou vlastnosťou. Tento proteín bol pomenovaný interferón.

Interferón je rodina glykoproteínov proteínov, ktoré sú syntetizované bunkami imunitného systému a spojivového tkaniva. V závislosti od toho, aké bunky je interferón syntetizovaný, izolované tri typy: a, p a y-interferóny.

Alfa interferónprodukované leukocytmi a dostal meno leukocytov; beta interferónnazývaný fibroblastický, pretože je syntetizovaný fibroblastmi - spojivovými tkanivovými bunkami a gamatový interferón- Imunita, ako je generovaná aktivovanými T-lymfocytom, makrofágmi, prírodnými vrahmi, t.j. imunitnými bunkami.

Interferón sa neustále syntetizuje v tele, a jeho koncentrácia krvi sa udržiava na úrovni približne 2 me / ml (1 medzinárodná jednotka - ja je množstvo interferónu, chrániacou bunkovú kultúru od 1 CPD 50 vírusu). Výroba interferónu sa prudko zvyšuje, keď je infikovaný vírusmi, ako aj pri vystavení interferónom induktorov, ako je RNA, DNA, komplexné polyméry. Takýto interferón induktory dostali meno interferonogén.

Okrem antivírusového účinku má interferón protinádorový ochranu, pretože oneskoruje proliferáciu (reprodukciu) nádorových buniek, ako aj imunomodulačnú aktivitu, stimulujúca fagocytózu, prírodné vrahov, nastavovanie protilátok v bunkách, aktiváciu expresie hlavného komplexu histokompatibility.

Mechanizmus akcieinterferón je komplikovaný. Interferón priamo na vírus mimo bunky nekonajú, ale je spojené so špeciálnymi bunkovými receptormi a ovplyvňuje proces reprodukcie vírusu vo vnútri bunky v štádiu syntézy proteínu.

Aplikácia interferónu. Účinok interferónu je účinnejší ako predtým, ako sa začne syntetizovať alebo vstúpiť do tela zvonku. Preto sa používa s profylaktickým cieľom s mnohými vírusovými infekciami, ako je chrípka, ako aj s terapeutickými účely v chronických vírusových infekciách, ako je parenterálna hepatitída (B, C, D), herpes, roztrúsená skleróza atď. Interferón dáva Pozitívne výsledky pri liečbe malígnych nádorov a ochorení spojených s imunodeficiami.

Interferóny majú druhovú špecifickosť, t.j. ľudský interferón je menej účinný pre zvieratá a naopak. Táto špecifickosť je však relatívna.

Získanie interferónu. Interferón sa získava dvoma spôsobmi: a) infikovaním leukocytov alebo lymfocytov ľudského krvi bezpečným vírusom, v dôsledku čoho sa infikované bunky syntetizujú interferónom, ktorý sa potom izoluje a navrhuje interferónové prípravky; b) geneticky inžinierska metóda - kultiváciou vo výrobných podmienkach rekombinantných kmeňov baktérií schopných produkovať interferón. Používajú sa rekombinantné pseudomonadové kmene, črevné palice s interferónovými génmi zakotvenými v ich DNA. Interferón, získaný metódou genetického inžinierstva, sa nazýva rekombinantný. V našej krajine dostal rekombinantný interferón oficiálny názov "Refaferon". Výroba tohto lieku je do značnej miery efektívnejšia a lacnejšia ako leukocyt.

Rekombinantný interferón bol široko používaný v medicíne ako preventívne a terapeutické činidlo pre vírusové infekcie, neoplazmy a imunodeficiencie.