आईएफए टेस्ट क्या है। एंजाइम इम्युनोसे (ईआईए) ये परीक्षण क्यों लें?

- एक आधुनिक प्रयोगशाला अध्ययन, जिसके दौरान न केवल एटियलजि की पहचान करने के लिए, बल्कि रोग के चरण की पहचान करने के लिए विशिष्ट रोगों के लिए रक्त या एंटीजन में विशिष्ट एंटीबॉडी की खोज की जाती है। एलिसा परिणाम गुणात्मक और मात्रात्मक रूप से जारी किए जा सकते हैं।

वर्तमान में, एलिसा का उपयोग निम्नलिखित स्थितियों में किया जाता है:

1) किसी भी संक्रामक रोग के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी की खोज करें;
2) किसी भी रोग (संक्रामक, यौन रोग) के प्रतिजनों की खोज करें;
3) रोगी की हार्मोनल स्थिति का अध्ययन;
4) ट्यूमर मार्करों के लिए परीक्षा;
5) ऑटोइम्यून बीमारियों की उपस्थिति के लिए परीक्षा।

एलिसा विधि के लाभ:

1) एलिसा विधि की उच्च विशिष्टता और संवेदनशीलता (90% से अधिक)।
2) रोग को निर्धारित करने और प्रक्रिया की गतिशीलता को ट्रैक करने की क्षमता, यानी अलग-अलग समय अंतराल में एंटीबॉडी की मात्रा की तुलना करना।
3) किसी भी चिकित्सा संस्थान में एलिसा डायग्नोस्टिक्स की उपलब्धता।

सापेक्ष नुकसान:

1) प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (एंटीबॉडी) की पहचान, लेकिन स्वयं रोगज़नक़ की नहीं।

बुनियादी अवधारणाओं

एलिसा पद्धति के सार को स्पष्ट करने से पहले, आइए कुछ अवधारणाओं को संक्षेप में समझते हैं।
एंटीबॉडी (या इम्युनोग्लोबुलिन - आईजी) - बी द्वारा उत्पादित विशिष्ट प्रोटीन -
किसी भी संक्रामक रोगज़नक़ (वायरस, बैक्टीरिया, कवक, आदि) के अंतर्ग्रहण के जवाब में लिम्फोसाइट्स (प्रतिरक्षा कोशिकाएं)। इम्युनोग्लोबुलिन ए (आईजीए), इम्युनोग्लोबुलिन ई (आईजीई), इम्युनोग्लोबुलिन एम (आईजीएम), इम्युनोग्लोबुलिन जी (आईजीजी), इम्युनोग्लोबुलिन डी (आईजीडी) हैं। वे आणविक आकार और द्रव्यमान, अर्ध-जीवन, संक्रामक प्रक्रियाओं में भागीदारी / गैर-भागीदारी, संक्रमण के क्षण से पता लगाने के समय में एक दूसरे से भिन्न होते हैं। यदि हम आणविक भार पर विचार करते हैं, तो अधिकांश आईजीएम में यह होता है - यह एक पेंटामर (950,000 डाल्टन) है, बाकी आईजी (150 से 200,000 डीए से) के विपरीत, जिसके कारण आईजीएम प्लेसेंटल बाधा से आसानी से नहीं गुजर सकता है। इसलिए, 1 वर्ष की आयु के बच्चे में आईजीएम का पता लगाना हमेशा भ्रूण में संक्रमण का संकेत होता है। रक्त सीरम में, इम्युनोग्लोबुलिन के थोक का प्रतिनिधित्व IgG (75-85%) द्वारा किया जाता है, और सबसे कम IgE (0.003%) होता है। केवल IgA, M, G संक्रामक प्रक्रिया में सीधे शामिल होते हैं। IgE एलर्जी प्रतिक्रियाओं और बीमारियों का संकेत है, और IgD केवल लिम्फ नोड्स और टॉन्सिल के ऊतक में पाया जा सकता है, स्थानीय प्रतिरक्षा के निर्माण में भूमिका निभाता है।

एंटीजन - कार्बनिक मूल के मैक्रोमोलेक्यूलर पदार्थ, विशेष रूप से संक्रामक और अन्य रोगों के रोगजनकों के साथ-साथ एक विशेष बीमारी (ऑटोइम्यून रोग, ऑन्कोलॉजी) में गठित विभिन्न परिवर्तित कोशिकाओं के पदार्थ।

प्रतिरक्षा परिसर - प्रतिरक्षा प्रक्रिया में शामिल एक एंटीजन-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स।

एलिसा पद्धति का आधार क्या है।

एलिसा के कई प्रकार हैं (प्रत्यक्ष, अप्रत्यक्ष, अवरोधक विधि, प्रतिस्पर्धी), हालांकि, व्यवहार में, विषम ठोस-चरण इम्युनोसे या एलिसा (एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख) का सबसे अधिक उपयोग किया जाता है

एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख का आधार एक एंटीजन की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और एक प्रतिरक्षा परिसर के गठन के साथ एक एंटीबॉडी है: एंटीजन-एंटीबॉडी, जिसके परिणामस्वरूप एंटीबॉडी की सतह पर विशिष्ट लेबल की एंजाइमेटिक गतिविधि में परिवर्तन होता है।

सरल शब्दों में, इस प्रक्रिया को कई चरणों में विभाजित किया जा सकता है:

1) परीक्षा आयोजित करने वाले डॉक्टर की गोली के कुओं की सतह पर एक निश्चित रोगज़नक़ का शुद्ध प्रतिजन होता है। जब एक मरीज की जैविक सामग्री (रक्त सीरम) जोड़ा जाता है, तो इस एंटीजन और वांछित एंटीबॉडी (इम्युनोग्लोबुलिन) के बीच एक विशिष्ट प्रतिक्रिया होती है। यह यौगिक अगले चरण में "विशेष प्रतिजन" के रूप में कार्य करेगा।

2) इस स्तर पर, आईआर (प्रतिरक्षा परिसरों) का गठन हो रहा है - एक "विशेष प्रतिजन" और एक संयुग्म के बीच एक प्रतिक्रिया (यह एंजाइम पेरोक्सीडेज के साथ लेबल किया गया एक इम्युनोग्लोबुलिन है)। एक विशेष क्रोमोजेन जोड़ा जाता है। इस तरह की एक एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया का परिणाम टैबलेट के कुएं में एक रंगीन पदार्थ का निर्माण होता है, जिसकी रंग तीव्रता रोगी की सामग्री में निहित इम्युनोग्लोबुलिन (एंटीबॉडी) की मात्रा पर निर्भर करती है।

3) अगला, परिणाम का मूल्यांकन किया जाता है: मल्टीचैनल स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग करके फोटोमेट्री, नियंत्रण नमूनों के ऑप्टिकल घनत्व के साथ परीक्षण सामग्री के ऑप्टिकल घनत्व की तुलना, परिणामों की गणितीय प्रसंस्करण। एक रोगी में एंटीबॉडी की मात्रा सीधे किसी दिए गए कुएं के ऑप्टिकल घनत्व की ऊंचाई पर निर्भर करती है।

आमतौर पर, अभ्यास में 96 कुओं की प्लेटों का उपयोग किया जाता है।

परीक्षण तरल के ऑप्टिकल घनत्व (OD) को मापते समय, एक निश्चित मात्रा इकाई में एंटीबॉडी की मात्रा (या एकाग्रता) की गणना की जाती है। फिर परिणाम की तुलना एक नियंत्रण नमूने से की जाती है।

आपको याद रखने की जरूरत है:प्रत्येक परीक्षण प्रणाली के लिए, परिणाम, मानदंड और विकृति के संकेतक (अर्थात, "संदर्भ मान") को ध्यान में रखने के लिए व्यक्तिगत संकेतक विकसित किए जाते हैं। प्रत्येक विशिष्ट अध्ययन के परिणामों का मूल्यांकन करते समय इसे ध्यान में रखा जाना चाहिए। एक प्रयोगशाला के परिणामों की दूसरी प्रयोगशाला के "संदर्भ मूल्यों" से व्याख्या करना सही नहीं है। विभिन्न प्रयोगशालाओं के परिणामों की एक दूसरे से तुलना करना भी गलत है।

एलिसा प्रतिक्रियाओं की स्थापना करते समय, एंटीबॉडी की अम्लता जैसी अवधारणा भी महत्वपूर्ण है।
एंटीबॉडी अम्लता - यह एंटीबॉडी-एंटीजन बॉन्ड की ताकत और एंटीजन की मात्रा है जो इम्युनोग्लोबुलिन (एंटीबॉडी) के साथ संबंध में है। संक्रमण की प्रत्याशित अवधि का आकलन करने में अम्लता का बहुत महत्व है, जो गर्भवती महिलाओं में प्राथमिक संक्रमण के निदान में अत्यंत महत्वपूर्ण है।

एंटीबॉडी अम्लता परीक्षण के आधार में प्रोटीन को नष्ट करने के लिए यूरिया समाधान के साथ प्रतिरक्षा परिसर (एंटीजन-एंटीबॉडी) का इलाज करना शामिल है। उच्च उग्र बंधन बरकरार रहते हैं, जबकि कम उग्र बंधन नष्ट हो जाते हैं। परिणाम एक अम्लता सूचकांक के रूप में दिया जाता है, जिसे प्रतिशत (%) के रूप में व्यक्त किया जाता है।

एलिसा डायग्नोस्टिक्स द्वारा किन बीमारियों का पता लगाया जाता है?

2. ऑटोइम्यून बीमारियों के मार्कर और मानव प्रतिरक्षा के संकेतक(कुल IgE, कुल IgG, कुल IgA, कुल IgM, कुल IgD, स्रावी IgA, IgG 2, IgG4, CEC- परिसंचारी प्रतिरक्षा परिसर, IgA और IgG से gliadin और अन्य)

3. ऑन्कोलॉजिकल मार्कर(टीएनएफ - ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर, सीईए - कैंसर-भ्रूण प्रतिजन, पीएसए - प्रोस्टेट-विशिष्ट एंटीजन, एचसीजी - कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन, सीए 125, एल्वोम्यूसीन और कई अन्य)

4. प्रजनन संबंधी विकारमैं (एस्ट्राडियोल, प्रोजेस्टेरोन, प्रोलैक्टिन, टेस्टोस्टेरोन, एएफपी-अल्फाफेटोप्रोटीन, एफएसएच - कूप-उत्तेजक हार्मोन और अन्य)

5. थायरॉइड ग्रंथि के रोग(मुक्त और बाध्य T3, T4, थायरोग्लोबुलिन, थायरोपरोक्सीडेज - TPO, थायरॉयड उत्तेजक हार्मोन - TSH)।

यह सूची उन सभी बीमारियों का प्रतिनिधित्व नहीं करती है जिनका निदान एंजाइम इम्यूनोएसे का उपयोग करके किया जाता है।

एलिसा विश्लेषण के लिए सामग्री और इसके संग्रह के नियम

एलिसा प्रतिक्रिया के लिए सबसे आम सामग्री रोगी का रक्त सीरम है, जिसे खाली पेट लिया जाता है। सामग्री मस्तिष्कमेरु द्रव, एमनियोटिक द्रव, कांच के शरीर की सामग्री, ग्रीवा नहर और मूत्रमार्ग के बलगम, स्मीयर के रूप में भी काम कर सकती है।

एलिसा के लिए सामग्री की डिलीवरी के लिए मरीजों को तैयार करना

एलिसा उत्पादन समय

सामग्री का इम्यूनोएंजाइमेटिक विश्लेषण एक दिन के भीतर जल्दी से किया जाता है। सीरा की एक निश्चित मात्रा के जमा होने के कारण विभिन्न प्रयोगशालाओं में देरी हो सकती है।

एलिसा निदान के संभावित परिणाम

विशिष्ट संक्रमणों के परिणामों का मूल्यांकन करते समय, एंटीबॉडी के वर्ग का पता लगाया जाता है और उनकी संख्या महत्वपूर्ण होती है। यह न केवल संक्रमण के एटियलजि (चाहे वह है या नहीं) के सवाल को निर्धारित करता है, बल्कि रोग की अपेक्षित अवस्था (तीव्र, जीर्ण), साथ ही साथ एक सक्रिय संक्रमण (तीव्र या जीर्ण का तेज) की उपस्थिति भी निर्धारित करता है। परीक्षा के समय।

एंटीबॉडी (इम्युनोग्लोबुलिन - आईजी) की उपस्थिति का अनुमानित समय क्या है?

जल्द से जल्द एंटीबॉडी IgM . हैं. संभावित संक्रमण के 1-3 सप्ताह बाद उनका पता लगाया जा सकता है, जो संक्रामक प्रक्रिया के तीव्र चरण की विशेषता है। आईजीएम एंटीबॉडी की उपस्थिति के लिए दूसरी स्थिति एक पुरानी प्रक्रिया की सक्रियता (या तेज) है। IgM एंटीबॉडी औसतन लगभग 3 महीने तक प्रसारित होते हैं, फिर उनकी संख्या धीरे-धीरे गायब हो जाती है। हालांकि, कुछ रोगियों में, संक्रमण के 1-2 वर्षों के भीतर आईजीएम की मात्रा का पता लगाया जा सकता है।

आधुनिक परीक्षण प्रणालियां अत्यधिक संवेदनशील हैं, जिसके परिणामस्वरूप गैर-विशिष्ट झूठे सकारात्मक परिणाम (अक्सर गर्भवती महिलाओं में) होते हैं। इसलिए मरीजों के इस समूह में पॉजिटिव आईजीएम की दोबारा जांच होनी चाहिए!

IgA एंटीबॉडी संक्रमण के 2-4 सप्ताह बाद दिखाई देते हैं, लेकिन पता लगाने के लिए पर्याप्त मात्रा में - एक महीने के बाद। सीरम IgA को प्लीहा, लिम्फ नोड्स और श्लेष्मा झिल्ली के प्लाज्मा कोशिकाओं द्वारा संश्लेषित किया जाता है, स्रावी IgA अपने सुरक्षात्मक कार्य करने के लिए श्लेष्म झिल्ली पर केंद्रित होते हैं - वे स्थानीय प्रतिरक्षा में शामिल होते हैं।

संक्रमण के चौथे सप्ताह से, IgG एंटीबॉडी दिखाई देने लगती हैं। अधिकांश संक्रमणों में, उनका अनुमापांक धीरे-धीरे अलग-अलग समय पर अधिकतम के साथ बढ़ता है (औसतन, 1.5-2 महीने के बाद), फिर अनुमापांक निम्न स्तर पर रहता है और प्रतिरक्षा को इंगित करता है। कुछ रोगों (माइकोप्लाज्मोसिस, क्लैमाइडिया, ट्राइकोमोनिएसिस) में आईजीजी का स्तर अधिक नहीं होता है, इन संक्रमणों में प्रतिरक्षा की कमी के कारण यह काफी कम हो जाता है।

विभिन्न वर्गों के एंटीबॉडी का पता लगाने के विकल्प:

आईजीएम एंटीबॉडी का पृथक पता लगाने से प्राथमिक का पता चलता है
संक्रमण।
- रक्त में IgM और IgG का एक साथ पता लगाना प्राथमिक संक्रमण की विशेषता है
पिछले 2-3 महीनों में, साथ ही एक पुरानी बीमारी के तेज होने के दौरान। इसलिए, गर्भावस्था के दौरान, आईजीएम की उपस्थिति हमेशा प्राथमिक संक्रमण का संकेत नहीं होती है।
- आइसोलेशन में आईजीजी का पता लगाना इस बीमारी के प्रति प्रतिरोधक क्षमता दोनों का संकेत दे सकता है,
साथ ही पुराने संक्रमण। दूसरी स्थिति में, एंटीबॉडी (टाइटर) की मात्रा और समय के साथ इस टिटर में बदलाव दोनों मायने रखते हैं। आमतौर पर, अध्ययन 2-4-6 सप्ताह के अंतराल पर किया जाता है।
- अकेले या IgM से IgA का पता लगाना प्राथमिक संक्रमण का संकेत देता है। पर
IgG के साथ IgA की उपस्थिति से एक पुराने संक्रमण (अतिशयोक्ति के क्षण से औसतन 2 सप्ताह) को सक्रिय करने की उम्मीद है।

परिभाषा आईजीजी एंटीबॉडी की अम्लतालंबे समय से चले आ रहे संक्रमण से प्राथमिक संक्रमण के निदान में एक उत्कृष्ट पूरक कदम है, जिसका नैदानिक ​​महत्व है, मुख्य रूप से भ्रूण के अंतर्गर्भाशयी संक्रमण के जोखिम का आकलन करने में। लो-एविड आईजीजी का पता लगाना एक प्राथमिक संक्रमण का संकेत देता है और संक्रमण के बाद औसतन 4-6 महीने में इसका पता चलता है, शायद ही कभी लंबे समय तक। कम उग्र आईजीजी को प्राथमिक संक्रमण (आईजीएम) की अन्य प्रयोगशाला पुष्टि की आवश्यकता होती है। अत्यधिक उत्साही एंटीबॉडी या तो एक पुरानी बीमारी और इसके तेज होने का संकेत हैं, या एक विकसित प्रतिरक्षा है।

शिशुओं में विशेषताएं:एक वर्ष तक के बच्चों में, और कभी-कभी 1.5 वर्ष तक, मातृ आईजीजी रक्त में विभिन्न संक्रमणों के लिए प्रसारित होते हैं (अर्थात, वे भ्रूण के विकास के दौरान मां से भ्रूण तक प्लेसेंटा के माध्यम से प्रवेश करते हैं)। वे अपने आप में वर्तमान में संक्रमण की उपस्थिति के संकेत नहीं हैं। यदि इस उम्र में आईजीएम का पता चलता है (याद रखें कि मातृ आईजीएम प्लेसेंटा को पार नहीं कर सकती है), तो यह अंतर्गर्भाशयी संक्रमण या जन्म के बाद प्राप्त संक्रमण का संकेत है।

मात्रात्मक एलिसा विधि

एलिसा डायग्नोस्टिक्स (एंजाइम इम्यूनोएसे एनालाइज़र का उपयोग करके) का परिणाम माप की कुछ इकाइयों में जारी किया जाता है:
- एक नमूने का ऑप्टिकल घनत्व (OD) प्रति इकाई आयतन विशिष्ट एंटीबॉडी की सांद्रता है। नमूने का OD जितना अधिक होगा, एंटीबॉडी की सांद्रता उतनी ही अधिक होगी। कुछ परिणाम सकारात्मकता गुणांक (पीसी) के बारे में बात करते हैं - यह नमूने का ऑप्टिकल घनत्व भी है।
- एंटीबॉडी एकाग्रता की इकाइयां (नैनोग्राम/मिलीलीटर या एनजी/एमएल)।
- सीरम टाइटर्स के रूप में: 1:20, 1:40, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1200 और इसी तरह। डायग्नोस्टिक टाइटर्स (जिस पर रोग का निदान किया जाता है, न कि संक्रमण का तथ्य) विभिन्न रोगों के लिए अलग-अलग होते हैं।
- प्रतीकों के रूप में - "+", "-", "?" (+, ++, +++, ++++)।
- किसी दिए गए मानदंड (सकारात्मक या नकारात्मक) के अनुसार गुणात्मक मूल्यांकन के रूप में।

एंटीबॉडी की मात्रा का सही आकलन करें, इम्युनोग्लोबुलिन के वर्ग का पता लगाने का एक प्रकार, और इसलिए, केवल एक डॉक्टर ही रोग के चरण और उपचार की आवश्यकता को निर्धारित कर सकता है।

हमें यह नहीं भूलना चाहिए कि किसी भी परीक्षण प्रणाली के लिए, उनके अपने "संदर्भ मूल्य" (आदर्श के रूपांतर) विकसित होते हैं, यदि वे पार हो जाते हैं, तो एक विशेष बीमारी (पैथोलॉजी वेरिएंट) का निदान किया जाता है। विभिन्न परीक्षण प्रणालियों के लिए, "संदर्भ मान" भिन्न होते हैं।

डायनामिक्स में लिए गए एलिसा के परिणामों की सही तुलना तभी संभव है जब उन्हें एक ही प्रयोगशाला में बनाया जाए।

संक्रामक रोग विशेषज्ञ बायकोवा एन.आई.

एंजाइम इम्यूनोएसे रोगजनकों के हमले का विरोध करने के लिए मानव शरीर की क्षमता का आकलन करने के लिए किए गए सबसे महत्वपूर्ण अध्ययनों में से एक है। यह आपको यह समझने की अनुमति देता है कि प्रतिरक्षा प्रणाली कितनी अच्छी तरह संक्रामक प्रक्रियाओं का सामना करती है। यह, बदले में, उपचार के नियम को समायोजित करना संभव बनाता है, यदि कोई हो।

और यह इस परीक्षण की सभी विशेषताओं से बहुत दूर है, तो आइए इस सवाल पर करीब से नज़र डालें कि एलिसा विश्लेषण क्या है, इसे किसके लिए दिखाया गया है, इसे कैसे किया जाता है, और प्राप्त डेटा क्या कह सकता है।

यह क्या है अध्ययन

तो, यह क्या है - एलिसा विश्लेषण? यह संक्षिप्त नाम "एंजाइमी इम्युनोसे" के लिए है। यह इस घटना में किया जाता है कि विभिन्न प्रकार के एंटीजन के लिए एंटीबॉडी की उपस्थिति का निर्धारण करना आवश्यक है।

एंटीजन रोग पैदा करने वाले एजेंट हैं जो विभिन्न विकृति के विकास में योगदान करते हैं। एंटीबॉडी वे पदार्थ हैं जो विदेशी कोशिकाओं को नष्ट करने के लिए आवश्यक हैं।

रक्त इम्युनोसे का उद्देश्य इम्युनोग्लोबुलिन के स्तर को निर्धारित करना है जिसे इम्युनोकोम्पलेक्स में जोड़ा जा सकता है। वे शरीर में एंटीजन की शुरूआत के जवाब में प्रतिरक्षा प्रणाली द्वारा सक्रिय रूप से उत्पादित होते हैं।

टिप्पणी। प्रत्येक व्यक्तिगत प्रकार के एंटीजन का मुकाबला करने के लिए, अपने स्वयं के विशिष्ट एंटीबॉडी का उत्पादन किया जाता है। यह वही है जो एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख की मदद से बीमारी और यहां तक ​​कि इसके चरण की पहचान करने में मदद करता है।

जब एक विदेशी प्रतिजन मानव शरीर में प्रवेश करता है, तो एंटीबॉडी उसे "बांध" देते हैं, जिसके बाद वे इसके प्रभाव को बेअसर कर देते हैं। यह एंजाइमेटिक लसीका और फागोसाइटोसिस प्रतिक्रियाओं के कारण होता है। इस प्रक्रिया के माध्यम से रक्त से एंटीजन को हटा दिया जाता है।

परीक्षण कब निर्धारित है?

एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख क्या है, यह समझने के बाद, हम उन स्थितियों को समझेंगे जिनमें इसे किया जाना दिखाया गया है। इसलिए, शोध आवश्यक है जब:

• ऑन्कोलॉजिकल रोग;
• वायरल हेपेटाइटिस;
• त्वचा या श्लेष्मा झिल्ली पर हर्पेटिक विस्फोट;
• साल्मोनेलोसिस;
• खसरा;
• एन्सेफलाइटिस;
• उपदंश;
• पेचिश;
• एटोपिक जिल्द की सूजन या एलर्जी प्रतिक्रियाओं की असामान्य अभिव्यक्तियाँ।

इसके अलावा, एलिसा विधि का उपयोग रोगजनकों की पहचान और पहचान के लिए किया जाता है:

• यौन संचारित रोगों;
• साइटोमेगालोवायरस संक्रमण;
• कृमिनाशक।

एंजाइम इम्यूनोएसे एक अध्ययन है जो अंतःस्रावी रोगों की प्रकृति को निर्धारित करने में मदद करता है, साथ ही पुरुषों और महिलाओं में इम्युनोडेफिशिएंसी और बांझपन की उपस्थिति की पहचान करता है। इसकी मदद से, दिल के दौरे, स्ट्रोक, तंत्रिका संबंधी और गुर्दे की बीमारियों के आगे के पाठ्यक्रम के लिए पूर्वानुमान लगाए जाते हैं।

एलिसा विश्लेषण भी निवारक उद्देश्यों के लिए किया जाता है। गर्भावस्था के दौरान, साथ ही उन रोगियों को भी करना सुनिश्चित करें, जो पहले उपरोक्त बीमारियों से गुजर चुके हैं। जिन लोगों को पहले बताई गई बीमारियों के विकसित होने का खतरा है, वे भी नियमित रूप से एलिसा के लिए रक्तदान करते हैं।

परीक्षण और डिकोडिंग की विशेषताएं

ज्यादातर मामलों में, एंजाइम इम्युनोसे के लिए रोगी का रक्त लिया जाता है। लेकिन कुछ परिस्थितियों में, कांच के शरीर की सतह से ऊतकों को लिया जा सकता है। गर्भवती महिलाओं में, एमनियोटिक द्रव की संरचना का अध्ययन करके एलिसा निदान किया जा सकता है।

रक्त का नमूना एक सिरिंज का उपयोग करके किया जाता है, जबकि अनुसंधान के लिए सामग्री, एक नियम के रूप में, कोहनी मोड़ के अंदर स्थित एक नस से ली जाती है। रोगी को आराम की स्थिति में, बैठने की स्थिति में होना चाहिए।

जरूरी! परीक्षण के परिणाम, इसकी व्याख्या और डेटा की व्याख्या नैदानिक ​​हेरफेर की कार्यप्रणाली और उपयोग किए गए उपकरणों पर निर्भर करती है। एक नियम के रूप में, प्रत्येक प्रयोगशाला इम्युनोग्लोबुलिन संकेतकों के आदर्श के रूप में इंगित करती है।

तैयारी की विशेषताएं

एलिसा के लिए एक रक्त परीक्षण के लिए कुछ प्रारंभिक प्रक्रियाओं की आवश्यकता होती है:

• परीक्षण के दिन नाश्ता छोड़ना;
• ब्लड थिनर और अन्य औषधीय एजेंटों को बंद करना जो परिणामों को प्रभावित कर सकते हैं (आपके डॉक्टर से पूर्व परामर्श के बाद);
• अध्ययन के दिन धूम्रपान से परहेज;
• रक्त के नमूने से एक दिन पहले शराब पीने से इनकार;
• मादक पदार्थों के उपयोग का बहिष्करण (उन दवाओं सहित जिनमें वे शामिल हैं)।

इम्यूनोकेमिकल रक्त परीक्षण की तैयारी के लिए ऐसे नियमों का अनुपालन डेटा विरूपण की संभावना को समाप्त करता है।

आंकड़ा निर्वचन

अध्ययन के परिणाम रोगी को उसके हाथों में दिए जाते हैं, जिसके बाद वह एक विशेषज्ञ के साथ दूसरे परामर्श से गुजरता है। एलिसा डेटा की व्याख्या सकारात्मक या नकारात्मक हो सकती है। इस मामले में, इंगित करने वाली संख्या (यदि कोई हो) को भी ध्यान में रखा जाता है।

यदि एलिसा नकारात्मक है, तो यह रोग प्रक्रियाओं की अनुपस्थिति या उनके विकास के प्रारंभिक चरण का संकेत दे सकता है। इसके अलावा, अध्ययन का एक "नकारात्मक" परिणाम तब देखा जाता है जब रोगी चिकित्सा के दौरान ठीक हो जाता है। लेकिन ऐसा डेटा एक निश्चित अवधि (1 - 2 महीने) के बाद ही प्राप्त किया जा सकता है।

यदि रक्त में कोई आईजीएम नहीं है, और आईएफ विश्लेषण ने सकारात्मक परिणाम दिखाया है, तो यह संकेत दे सकता है कि रोगी ने एक निश्चित प्रकार के एंटीजन के लिए एक मजबूत प्रतिरक्षा विकसित की है। टीकाकरण के साथ यही होता है।

IgG और IgA की अनुपस्थिति की पृष्ठभूमि के खिलाफ IgM की उच्च सांद्रता के साथ, हम एक भड़काऊ प्रक्रिया के बारे में बात कर सकते हैं जो तीव्र चरण में होती है।

इसका क्या अर्थ है यदि एलिसा सभी प्रकार के इम्युनोग्लोबुलिन के लिए सकारात्मक है? ऐसे मामलों में, हम एक संक्रामक विकृति विज्ञान की पुनरावृत्ति के बारे में बात कर सकते हैं। इस मामले में, एंटीबॉडी की उपस्थिति केवल एक पुरानी बीमारी के तीव्र चरण में तय की जाती है।

जब रोग क्षीणन चरण में प्रवेश करता है, तो यह नकारात्मक होगा। लेकिन आईजीजी और आईजीए के लिए एलिसा सकारात्मक होगा।

परीक्षण के पेशेवरों और विपक्ष

एलिसा द्वारा रक्त के अध्ययन की अपनी ताकत और कमजोरियां हैं। फायदे में शामिल हैं:

• अपेक्षाकृत कम लागत;
• शुद्धता;
• उपचार की प्रभावशीलता का आकलन करने के लिए नियमित आचरण की संभावना;
• निष्पादन की गति;
• विश्वसनीय परिणाम प्राप्त करने के लिए उच्च-सटीक और अत्यधिक सूचनात्मक प्रौद्योगिकियों का उपयोग;
• रोग प्रक्रिया के एक ही फोकस के क्षेत्र में कई अध्ययन करने की संभावना;
• पूर्ण दर्द रहितता;
• रोगी के स्वास्थ्य के लिए किसी भी जोखिम की अनुपस्थिति;
• अध्ययन की सापेक्ष आसानी।

एलिसा रक्त परीक्षण, ऊपर वर्णित लाभों के कारण व्यापक हो गया है, और विभिन्न रोगों के निदान में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है।

नुकसान

रक्त एलिसा का एक महत्वपूर्ण नुकसान गलत सकारात्मक या गलत नकारात्मक परिणाम प्राप्त करने की संभावना है। लेकिन ज्यादातर मामलों में यह शोध पद्धति के कारण नहीं, बल्कि मानवीय कारक के कारण होता है।

एक और बारीकियां जो अंतिम डेटा को प्रभावित कर सकती हैं, वह है परीक्षण के दौरान इस्तेमाल की जाने वाली दवाएं। यदि उनका गलत उपयोग किया जाता है, या विवाह के मामले में, एलिसा विश्लेषण का डिकोडिंग अविश्वसनीय होगा। इसलिए, अध्ययन को दोहराना होगा।

जरूरी! रोगी के शरीर में चयापचय प्रक्रियाओं का उल्लंघन परीक्षण डेटा को प्रभावित कर सकता है। इसके अलावा, परिणाम एक साथ संक्रामक (पुरानी!) बीमारियों के कई foci की उपस्थिति से प्रभावित हो सकते हैं।

एक एलिसा रक्त परीक्षण की पहचान करने के लिए किया जाता है:

• एस्कारियासिस;
• opisthorchiasis - तीव्र या जीर्ण;
• गियार्डियासिस;
• टोक्सोप्लाज्मोसिस।

साथ ही, अध्ययन के दौरान रोगी के शरीर में पिनवर्म या अमीबा पाए जा सकते हैं। एलिसा रक्त परीक्षण डेटा के आधार पर रोगियों को "लीशमैनियासिस" और "ट्रिचिनोसिस" का निदान भी अक्सर किया जाता है।

उपसंहार

बेशक, परीक्षण डेटा को अपने दम पर समझना बहुत मुश्किल है, क्योंकि इस प्रक्रिया के दौरान कई कारकों को ध्यान में रखा जाना चाहिए। बुरी आदतें, सहवर्ती रोगों की उपस्थिति, दवाओं के कुछ समूहों का उपयोग - यह सब एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है और परिणामों को प्रभावित कर सकता है, जिसे डॉक्टर एलिसा के परिणामों को डिक्रिप्ट करते समय ध्यान में रखते हैं।

हालाँकि, "सूचित का अर्थ है सशस्त्र", इसलिए प्रत्येक व्यक्ति के लिए उन प्रयोगशाला परीक्षणों के डेटा के संचालन और व्याख्या की विशेषताओं को जानना महत्वपूर्ण है जो उपस्थित चिकित्सक उसे निर्धारित करते हैं। और एलिसा विधि कोई अपवाद नहीं है!

(एलिसा) विशेष कोशिकाओं की खोज के आधार पर प्रयोगशाला में रक्त परीक्षण की एक विधि है - विभिन्न रोगों के लिए एंटीबॉडी। विधि न केवल रोगज़नक़ की पहचान करने की अनुमति देती है, बल्कि यह भी स्थापित करती है कि रोग प्रक्रिया किस चरण में है। उत्तरार्द्ध रोगी के रोग का निदान और आगे के उपचार के लिए बहुत महत्वपूर्ण है।

विधि के फायदे और नुकसान

सभी आधुनिक निदान विधियों में, एलिसा सबसे नवीन और तकनीकी रूप से सटीक है। इसके मुख्य लाभ हैं:

1. रोगी के रक्त में संक्रामक रोगों के लिए सभी मौजूदा एंटीबॉडी की खोज करने की क्षमता।
2. अनुसंधान पद्धति की उच्च उपलब्धता। आज, एलिसा विश्लेषण किसी भी मध्यम आकार की प्रयोगशाला द्वारा किया जा सकता है।
3. विधि की लगभग 100% विशिष्टता और संवेदनशीलता।
4. एंटीबॉडी और एंटीजन की खोज की संभावना, साथ ही रोग प्रक्रिया के चरण को स्थापित करना और इसकी गतिशीलता को ट्रैक करना, संख्या की तुलना के लिए धन्यवाद।

अन्य परीक्षणों की तुलना में इस तरह के कई फायदे पूरी तरह से विश्लेषण के एकमात्र दोष की देखरेख करते हैं: यह एंटीबॉडी का पता लगाने में सक्षम है, लेकिन स्वयं रोगज़नक़ नहीं।

विश्लेषण के मूल्यांकन के लिए बुनियादी शर्तें

यह समझने के लिए कि एलिसा विश्लेषण क्या है, यह क्या है और इसे कैसे किया जाता है, आपको विशेषज्ञों द्वारा उपयोग की जाने वाली बुनियादी शर्तों से परिचित होने की आवश्यकता है।

1. एंटीबॉडी- एक प्रोटीन जो मानव प्रतिरक्षा प्रणाली (टाइप बी लिम्फोसाइट्स) की कोशिकाओं द्वारा निर्मित होता है। वे एक विदेशी एजेंट या पदार्थ के अंतर्ग्रहण के लिए एक विशिष्ट प्रतिक्रिया के साथ प्रतिक्रिया करते हैं। एंटीबॉडी का दूसरा नाम इम्युनोग्लोबुलिन है, वे विभिन्न वर्गों से संबंधित हैं: ए, ई, एम, जी। वे द्रव्यमान, प्रतिक्रिया गति, आधा जीवन और कई अन्य विशेषताओं में एक दूसरे से भिन्न होते हैं। आम तौर पर, मानव रक्त में मुख्य रूप से जी श्रेणी के इम्युनोग्लोबुलिन होते हैं। यदि कोई संक्रमण होता है, तो इम्युनोग्लोबुलिन ए और एम की मात्रा तेजी से बढ़ जाती है। इम्युनोग्लोबुलिन ई एलर्जी प्रतिक्रियाओं में शामिल होते हैं।
2. एंटीजन- कार्बनिक मूल और उच्च आणविक भार का एक विदेशी एजेंट। अक्सर यह रोगजनक या उनके जैविक रूप से सक्रिय पदार्थ होते हैं।
3. एंटीजन-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स, या इम्यून कॉम्प्लेक्स, सीधे एक विदेशी पदार्थ और एक इम्युनोग्लोबुलिन का एक संयोजन है, जो एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को जन्म देता है।

विधि का सार और दायरा

मरीजों के पास अक्सर एक प्रश्न होता है: एलिसा विश्लेषण, यह क्या है, यह कैसे किया जाता है और इसके लिए क्या है? आप इसके चरणों का संक्षेप में वर्णन करके विधि के बारे में सुलभ तरीके से बात कर सकते हैं।

प्रारंभिक चरण. लैब डॉक्टर 96 कुओं के साथ एक विशेष प्लेट का उपयोग करता है। प्रत्येक कुएं की सतह पर एक विशिष्ट रोगज़नक़ का प्रतिजन लगाया जाता है।

प्रथम चरणखून लिया जाता है, जिसे बाद में बूंद-बूंद करके कुएं में डाला जाता है। कुआं रक्त में एंटीजन और एंटीबॉडी के बीच प्रतिक्रिया शुरू करता है।

चरण 2कुएं में, प्रतिरक्षा परिसरों के गठन के साथ प्रतिक्रिया पूरे जोरों पर है। नतीजतन, एक निश्चित रंग का पदार्थ बनता है। रंग की तीव्रता प्रत्येक विशिष्ट रोगज़नक़ के लिए रोगी के रक्त में एंटीबॉडी की मात्रा पर निर्भर करती है।

चरण 3फोटोमेट्री द्वारा परिणाम का मूल्यांकन। इसके लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर नामक एक विशेष उपकरण का उपयोग किया जाता है। यह कुएं में सामग्री के घनत्व और नियंत्रण नमूने की तुलना करता है। इसके अलावा, डिवाइस गणितीय विश्लेषण द्वारा परिणाम उत्पन्न करता है।

एलिसा के परिणामों और उद्देश्य का मूल्यांकन

परिणाम की व्याख्या कई महत्वपूर्ण बारीकियों पर निर्भर करती है:

1. कुएं का ऑप्टिकल घनत्व।
2. वेल प्लेट निर्माता (परीक्षण प्रणाली)।
3. प्रयोगशाला जहां अध्ययन किया गया था।

इन बारीकियों को देखते हुए, आपको कभी भी अलग-अलग परीक्षण प्रणालियों या विभिन्न प्रयोगशालाओं के दो परिणामों की तुलना नहीं करनी चाहिए।

एक अन्य महत्वपूर्ण बिंदु जो एलिसा के विश्लेषण को प्रभावित करता है, वह है एंटीबॉडी की तथाकथित प्रबलता। यह पैरामीटर एंटीजन की मात्रा, एंटीजन-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स में बंधन की ताकत की विशेषता है। इसकी परिभाषा प्रोटीन संरचनाओं को हल करने के लिए यूरिया के साथ प्रतिरक्षा परिसर के उपचार पर आधारित है। यह आपको एंटीजन और एंटीबॉडी के बीच कमजोर बंधनों को नष्ट करने और केवल मजबूत को छोड़ने की अनुमति देता है। अम्लता के अध्ययन का महत्व इस तथ्य में निहित है कि इसका उपयोग संक्रमण की अवधि का पता लगाने के लिए किया जा सकता है। गर्भवती महिलाओं के निदान के लिए यह जानकारी अत्यंत महत्वपूर्ण है।

एक एलिसा रक्त परीक्षण कार्य करता है:

1. रोगजनकों के विभिन्न प्रतिजनों की खोज करना।
2. हार्मोनल पृष्ठभूमि का अध्ययन करने के लिए।
3. एक ऑटोइम्यून बीमारी की उपस्थिति के लिए परीक्षण करने के लिए।
4. कैंसर मार्करों का पता लगाने के लिए।

एलिसा की किस्में

एलिसा विश्लेषण में निम्नलिखित किस्में हैं:

1. परोक्ष।
2. सीधा।
3. प्रतिस्पर्द्धी।
4. अवरुद्ध करने की विधि।

लेकिन वास्तव में, आज केवल एलिसा (एंजाइम लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख) नामक एक विधि का उपयोग किया जाता है। यह कुएं की सतह पर रंग परिवर्तन के साथ एक एंटीजन-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स के गठन की उपरोक्त वर्णित प्रतिक्रिया पर आधारित है।

सीधे मात्रात्मक एलिसा रक्त परीक्षण विशेष ध्यान देने योग्य है। यह एक प्रकार का विश्लेषण नहीं है, बल्कि परिणामों के मूल्यांकन का एक तरीका है। उसके लिए धन्यवाद, एंटीबॉडी की संख्या की गणना की जाती है और उनकी कक्षाएं निर्धारित की जाती हैं। परिणाम नमूने के ऑप्टिकल घनत्व पर निर्भर करता है, परीक्षण प्रणाली जिस पर एलिसा किया गया था, और प्रयोगशाला पर भी।

एलिसा द्वारा पता लगाए गए रोग

एलिसा एक रक्त परीक्षण है जो आपको बड़ी संख्या में विभिन्न संक्रामक रोगों की पहचान करने की अनुमति देता है। इसके अलावा, वायरल और बैक्टीरियल दोनों रोगों का समान सटीकता के साथ पता लगाया जाता है। उदाहरण के लिए, प्रतिरक्षा परिसरों के गठन की मदद से, निम्नलिखित रोगों के प्रेरक एजेंटों के प्रतिजनों की उपस्थिति को साबित करना संभव है:

इसके अलावा, एलिसा आपको पता लगाने की अनुमति देता है:

1. कैंसर मार्कर - TNF (ट्यूमर नेक्रोसिस फैक्टर), PSA (प्रोस्टेट-विशिष्ट एंटीजन), CEA (कैंसर-भ्रूण प्रतिजन), CA-125 (डिम्बग्रंथि ट्यूमर मार्कर)
2. गर्भावस्था हार्मोन एचसीजी (मानव कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन) है।
3. प्रजनन प्रणाली विकार: महिला और पुरुष प्रजनन प्रणाली के हार्मोन।
4. थायरॉयड ग्रंथि की विकृति।

यह उल्लेख करना महत्वपूर्ण है कि एचआईवी के लिए एलिसा परीक्षण आज इस खतरनाक बीमारी के निदान का मुख्य तरीका है।

एलिसा सामग्री और नमूना तकनीक

एलिसा करने के लिए मरीज का खून खाली पेट लिया जाता है। इसके अलावा, सीरम रक्त से प्राप्त किया जाता है, जिसका उपयोग सीधे विश्लेषण के लिए किया जाता है। इसके अलावा, एलिसा को मस्तिष्कमेरु द्रव (सीएसएफ), ग्रीवा बलगम (गर्भाशय ग्रीवा), एमनियोटिक द्रव और यहां तक ​​कि कांच के तरल पदार्थ (नेत्रगोलक) पर भी किया जा सकता है।

रक्तदान करने से पहले, रोगी को चेतावनी दी जाती है कि उसे कोई दवा नहीं लेनी चाहिए, और रक्त के नमूने से कम से कम दो सप्ताह पहले एंटीबायोटिक्स और एंटीवायरल दवाओं के साथ उपचार समाप्त करने की सिफारिश की जाती है।

परिणामों की प्राप्ति और व्याख्या की शर्तें

प्रयोगशाला से प्रतिक्रिया प्राप्त करने का समय उसके काम की गति पर निर्भर नहीं करता है, लेकिन रोग के चरण पर और रक्त में पहले से ही कौन से एंटीबॉडी दिखाई दे चुके हैं। इसलिए, उदाहरण के लिए: इम्युनोग्लोबुलिन एम विश्लेषण के लिए रक्त लेने के लगभग 2 सप्ताह बाद दिखाई देता है और इसका मतलब है कि प्रक्रिया प्राथमिक संक्रमण के चरण में है या एक पुरानी बीमारी का तेज हो गया है। वहीं, प्राथमिक संक्रमण के दौरान एम और जी वर्ग के एंटीबॉडी दिखाई देते हैं। इसके अलावा, बाद वाले का 4 सप्ताह के बाद पता लगाया जा सकता है।

आईजीए 2-3 सप्ताह के बाद या तो अकेले या एम के साथ प्रकट होता है, एक तीव्र संक्रमण का संकेत देता है, या जी के साथ मिलकर, एक पुरानी प्रक्रिया का संकेत देता है।

रक्त में एंटीबॉडी की उपस्थिति के लिए इस तरह के अलग-अलग शब्द रोगी को परिणाम के लिए लंबे समय तक इंतजार करने के लिए मजबूर करेंगे। एलिसा विश्लेषण किए जाने के बाद एक महीने से अधिक प्रतीक्षा करना स्वीकार्य है। डॉक्टर द्वारा डिकोडिंग और व्याख्या में भी एक निश्चित समय लगता है।

नैदानिक ​​प्रयोगशाला निदान विभाग के समोइलिकोव पावेल व्लादिमीरोविच इंटर्न

रूसी राज्य चिकित्सा विश्वविद्यालय

चिकित्सा पद्धति में इम्यूनोसे के तरीकों का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। आधुनिक चिकित्सा के सभी क्षेत्रों में, इम्यूनोसे का उपयोग मुख्य रूप से नैदानिक ​​और विश्लेषणात्मक उद्देश्यों के लिए किया जाता है। यह विशेष रूप से महत्वपूर्ण है कि वे कम और बहुत कम सांद्रता पर जैविक घटकों (हार्मोन, एंजाइम, न्यूरोपैप्टाइड्स, प्रतिरक्षा प्रणाली उत्पाद, एंटीजन, आदि) की पहचान करना संभव बनाते हैं। इन विधियों द्वारा सभी उत्पादों का पता लगाया जाता है जिनके खिलाफ एंटीबॉडी प्राप्त करना संभव है।

प्रतिरक्षा विश्लेषण एक घटक (एंजाइम, रेडियोन्यूक्लाइड, फ्लोरोसेंट डाई, और अन्य) में से एक के लिए विभिन्न लेबलिंग विकल्पों का उपयोग करके एक एंटीजन (एजी) और एक एंटीबॉडी (एटी) की बातचीत पर आधारित है। प्रतिक्रिया का मूल्यांकन विशेष उपकरणों पर स्वचालित रूप से किया जाता है, जिससे इन विधियों को मानकीकृत करना संभव हो जाता है।

उपयोग किए गए लेबल के प्रकार और परीक्षण की स्थापना के लिए शर्तों के आधार पर, इम्यूनोसे को एंजाइम इम्यूनोसे (एलिसा), रेडियोइम्यूनोसे (आरआईए), इम्यूनोफ्लोरेसेंस और अन्य के रूप में जाना जाता है। जब प्रतिक्रियाओं का मंचन एक या अधिक चरणों में किया जाता है, तो उन्हें प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष रूप से नामित किया जाता है। जिस माध्यम में प्रतिक्रिया की जाती है वह मायने रखता है। यदि प्रतिक्रिया सतह पर तय किए गए अभिकर्मकों के साथ की जाती है, तो परीक्षण को ठोस चरण परीक्षण के रूप में नामित किया जाता है, उदाहरण के लिए, एलिसा (एंजाइम लिंक्ड इम्यूनोसॉर्बेंट परख)।

इस पत्र में, केवल एंजाइम इम्युनोसे पर विचार किया जाएगा - जीव विज्ञान और चिकित्सा में व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली एक विधि, व्यावहारिक और मौलिक दोनों।

एलिसा 60 के दशक के मध्य में दिखाई दिया और मूल रूप से एक हिस्टोलॉजिकल तैयारी में एक एंटीजन की पहचान करने के लिए एक विधि के रूप में विकसित किया गया था, साथ ही एक इम्यूनोडिफ्यूजन परीक्षण और इम्यूनोइलेक्ट्रोफोरेसिस में वर्षा लाइनों की कल्पना करने के लिए, और फिर एंटीजन के मात्रात्मक निर्धारण के लिए उपयोग किया जाने लगा। जैविक तरल पदार्थों में एंटीबॉडी। E. Engvall और R. Pelman ने विधि के विकास में भाग लिया, साथ ही, उनमें से स्वतंत्र रूप से, W. Van Veeman और R. Schurs ने भाग लिया।

चित्रा 1. एलिसा का मूल सिद्धांत।

1) एंटीजन का पता लगाने के लिए। 2) एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए।

विधि प्रतिजन के प्रति एंटीबॉडी के विशिष्ट बंधन पर आधारित है, जबकि घटकों में से एक एंजाइम के साथ संयुग्मित होता है; संबंधित क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट के साथ प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप, एक रंगीन उत्पाद बनता है, जिसकी मात्रा हो सकती है स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से निर्धारित (चित्र 1)।

अपनी बाध्यकारी गतिविधि को बनाए रखते हुए विभिन्न वाहकों पर एंटीजन और एंटीबॉडी स्थिरीकरण की संभावना की खोज ने जीव विज्ञान और चिकित्सा के विभिन्न क्षेत्रों में एलिसा के उपयोग का विस्तार करना संभव बना दिया है।

मोनोक्लोनल एंटीबॉडी की उपस्थिति ने एलिसा के एक और विकास के रूप में कार्य किया, जिससे इसकी संवेदनशीलता, विशिष्टता और परिणामों की पुनरुत्पादकता को बढ़ाना संभव हो गया।

सैद्धांतिक रूप से, एलिसा आधुनिक इम्यूनोकेमिस्ट्री और रासायनिक एंजाइमोलॉजी के डेटा पर आधारित है, एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के भौतिक-रासायनिक कानूनों के ज्ञान के साथ-साथ विश्लेषणात्मक रसायन विज्ञान के मुख्य सिद्धांतों पर आधारित है। एलिसा की संवेदनशीलता और इसकी अवधि कई मुख्य कारकों द्वारा निर्धारित की जाती है: एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया की गतिज और थर्मोडायनामिक विशेषताएं, अभिकर्मकों का अनुपात, एंजाइम गतिविधि और इसके पता लगाने के तरीकों का संकल्प। सामान्य तौर पर, प्रतिजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया को एक सरल योजना द्वारा वर्णित किया जा सकता है:

+[एजी]↔[एटीएजी]

कम आणविक भार यौगिकों से लेकर वायरस और बैक्टीरिया तक अध्ययन की वस्तुओं की विविधता, साथ ही एलिसा के उपयोग के लिए विभिन्न प्रकार की स्थितियों से जुड़े कार्यों की एक असामान्य रूप से विस्तृत श्रृंखला, इस पद्धति के बहुत बड़ी संख्या में विकास का निर्धारण करती है। .

किसी भी एलिसा संस्करण में 3 अनिवार्य चरण होते हैं:

1. इसके लिए विशिष्ट एंटीबॉडी द्वारा परीक्षण यौगिक की मान्यता का चरण, जो एक प्रतिरक्षा परिसर के गठन की ओर जाता है;

2. प्रतिरक्षा परिसर या मुक्त बाध्यकारी साइटों के साथ संयुग्म के कनेक्शन के गठन का चरण;

3. एंजाइम लेबल को पंजीकृत सिग्नल में बदलने का चरण।

एलिसा विधियों का वर्गीकरण कई दृष्टिकोणों पर आधारित है:

1. एलिसा के पहले चरण में मौजूद अभिकर्मकों के प्रकार के अनुसार, प्रतिस्पर्धी और गैर-प्रतिस्पर्धी तरीके प्रतिष्ठित हैं।

ए) प्रतिस्पर्धी एलिसा में, पहले चरण में, सिस्टम में विश्लेषण किए गए यौगिक और इसके एनालॉग दोनों होते हैं, जो एंजाइम के साथ लेबल होते हैं और इसके साथ विशिष्ट बाध्यकारी साइटों के लिए प्रतिस्पर्धा करते हैं।

बी) गैर-प्रतिस्पर्धी तरीकों के लिए, केवल विश्लेषण किए गए यौगिक और इसके लिए विशिष्ट बाध्यकारी केंद्रों के पहले चरण में सिस्टम में उपस्थिति विशेषता है।

2. सभी एलिसा विधियों को सजातीय और विषमांगी में विभाजित किया गया है।

यदि एलिसा के सभी तीन चरणों को समाधान में किया जाता है और मुख्य चरणों के बीच गैर-प्रतिक्रिया वाले घटकों से गठित प्रतिरक्षा परिसरों को अलग करने के कोई अतिरिक्त चरण नहीं होते हैं, तो विधि सजातीय लोगों के समूह से संबंधित होती है।

सजातीय एलिसा का आधार, जो आमतौर पर कम आणविक भार वाले पदार्थों को निर्धारित करने के लिए उपयोग किया जाता है, एंजाइम गतिविधि का निषेध है जब इसे एंटीजन या एंटीबॉडी के साथ जोड़ा जाता है। एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप एंजाइम गतिविधि बहाल हो जाती है।

जब एक एंटीबॉडी एक एंजाइम लेबल वाले एंटीजन से बांधता है, तो उच्च आणविक भार सब्सट्रेट के संबंध में एंजाइम गतिविधि 95% तक बाधित होती है, जो एंजाइम के सक्रिय केंद्र से सब्सट्रेट के स्टेरिक बहिष्करण के कारण होती है। जैसे-जैसे एंटीजन की सांद्रता बढ़ती है, अधिक एंटीबॉडी बंधते हैं और अधिक मुक्त एंटीजन-एंजाइम संयुग्म बनाए जाते हैं जो उच्च आणविक भार सब्सट्रेट को हाइड्रोलाइज कर सकते हैं। विश्लेषण बहुत जल्दी किया जाता है, एक निर्धारण के लिए 1 मिनट की आवश्यकता होती है। विधि की संवेदनशीलता काफी अधिक है। इससे आप पिकोमोल के स्तर पर पदार्थ का निर्धारण कर सकते हैं।

विषम तरीकों के लिए, एक ठोस चरण की भागीदारी के साथ दो-चरण प्रणाली में विश्लेषण करना विशिष्ट है - एक वाहक, और अप्रतिबंधित घटकों (धुलाई) से प्रतिरक्षा परिसरों को अलग करने का एक अनिवार्य चरण जो विभिन्न चरणों (गठन) में हैं प्रतिरक्षा परिसरों ठोस चरण पर हैं, और अप्रतिबंधित परिसरों समाधान में हैं)। विषम विधियाँ, जिनमें पहले चरण में प्रतिरक्षा परिसरों का निर्माण ठोस चरण पर होता है, ठोस-चरण विधियाँ कहलाती हैं।

विधियों को सजातीय-विषम के रूप में वर्गीकृत किया जाता है, यदि पहला चरण - विशिष्ट परिसरों का गठन समाधान में होता है, और फिर घटकों को अलग करने के लिए एक स्थिर अभिकर्मक के साथ एक ठोस चरण का उपयोग किया जाता है।

3. परीक्षण पदार्थ के निर्धारण के सिद्धांत के अनुसार:

ए) किसी पदार्थ (एंटीजन या एंटीबॉडी) की एकाग्रता का प्रत्यक्ष निर्धारण इसके साथ बातचीत करने वाले बाध्यकारी केंद्रों की संख्या से होता है। इस मामले में, एंजाइम लेबल परिणामी विशिष्ट एजी-एटी कॉम्प्लेक्स में होगा। विश्लेषण की एकाग्रता पंजीकृत संकेत के सीधे आनुपातिक होगी।

बी) बाध्यकारी साइटों की कुल संख्या और शेष मुक्त बाध्यकारी साइटों के बीच अंतर से किसी पदार्थ की एकाग्रता का निर्धारण। इस मामले में, विश्लेषण की एकाग्रता में वृद्धि होगी, और रिकॉर्ड किए गए सिग्नल में कमी आएगी, इसलिए, इस मामले में, रिकॉर्ड किए गए सिग्नल के परिमाण पर एक व्युत्क्रम निर्भरता है।

एंजाइम।

एंजाइम लेबल का एक अत्यंत शक्तिशाली उत्प्रेरक प्रभाव होता है; एक एंजाइम अणु बड़ी संख्या में सब्सट्रेट अणुओं के साथ प्रतिक्रिया कर सकता है। इस प्रकार, नगण्य मात्रा में मौजूद एक एंजाइम का पता लगाया जा सकता है और उत्पादों के निर्माण से इसकी मात्रा निर्धारित की जा सकती है, यह प्रतिक्रिया उत्प्रेरित करती है। एंजाइमों को लेबल के रूप में उपयोग करने का एक अन्य लाभ कई कार्यात्मक समूहों (सल्फ़हाइड्रील, कार्बोक्सिल, टाइराज़िन अवशेष, आदि) के अणु में उपस्थिति के कारण होता है, जिसके माध्यम से लिगैंड अणुओं को सहसंयोजक रूप से जोड़ा जा सकता है।

एलिसा में प्रयुक्त एंजाइमेटिक मार्करों में निम्नलिखित गुण होने चाहिए:

- विश्लेषण की शर्तों के तहत एंजाइम की उच्च गतिविधि और स्थिरता, संशोधन के दौरान और एंटीबॉडी या अन्य प्रोटीन के साथ संयुग्म में;

- संवेदनशील सब्सट्रेट की उपस्थिति और एंजाइमी प्रतिक्रिया के उत्पादों या सबस्ट्रेट्स को निर्धारित करने की विधि की सादगी;

- सब्सट्रेट सिस्टम को और मजबूत करने के लिए अनुकूलन की संभावना;

- अध्ययन किए गए जैविक द्रव में एंजाइम और उसके अवरोधकों की अनुपस्थिति।

एलिसा कम से कम 15 विभिन्न एंजाइमों का उपयोग कर सकती है। उपरोक्त आवश्यकताओं के अनुसार सबसे बड़ा अनुप्रयोग, हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (HRP), क्षारीय फॉस्फेट (AP) और β-D-galactosidase (तालिका 1) पाया गया। तीनों स्थिर हैं और अत्यधिक संवेदनशील प्रतिक्रियाओं को उत्प्रेरित करते हैं। इसके अलावा, इन एंजाइमों द्वारा उत्प्रेरित प्रतिक्रियाओं से उत्पन्न उत्पादों, उपयोग किए गए सब्सट्रेट के आधार पर, न केवल वर्णमिति विधियों द्वारा, बल्कि फ्लोरोसेंट विधियों द्वारा भी पता लगाया जा सकता है। अन्य एंजाइमों का उपयोग बहुत कम बार किया जाता है। यह एचआरपी और एपी की तुलना में उनकी कम विशिष्ट गतिविधि द्वारा समझाया गया है।

सबस्ट्रेट्स।

सब्सट्रेट की पसंद मुख्य रूप से एक लेबल के रूप में उपयोग किए जाने वाले एंजाइम द्वारा निर्धारित की जाती है, क्योंकि एंजाइम-सब्सट्रेट प्रतिक्रिया अत्यधिक विशिष्ट है।

सब्सट्रेट के लिए बुनियादी आवश्यकताएं:

- संयुग्म में एंजाइम का पता लगाने में विधि की उच्च संवेदनशीलता सुनिश्चित करना;

- एंजाइम-सब्सट्रेट प्रतिक्रिया के अच्छी तरह से परिभाषित (उदाहरण के लिए, रंगीन) उत्पादों का निर्माण;

- सब्सट्रेट सुरक्षित, सस्ता, सुलभ और उपयोग में सुविधाजनक होना चाहिए।

तालिका नंबर एक।

एलिसा में एंजाइम और उनके सबस्ट्रेट्स सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाते हैं।

अधिक बार, क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट का उपयोग किया जाता है, जो नष्ट होने पर एक रंगीन पदार्थ बनाते हैं। उच्च-ऊर्जा सबस्ट्रेट्स - फ्लोरोसेंट, केमिलुमिनसेंट का उपयोग वादा कर रहा है। ऐसे सबस्ट्रेट्स का उपयोग सैद्धांतिक रूप से एलिसा की संवेदनशीलता को परिमाण के दो आदेशों से बढ़ाना संभव बनाता है।

एंटीजन और एंटीबॉडी।

एलिसा में प्रयुक्त एजी और एटी अत्यधिक शुद्ध और अत्यधिक सक्रिय होना चाहिए। इसके अलावा, एजी में उच्च प्रतिजनता, इष्टतम घनत्व और प्रतिजनी निर्धारकों की संख्या, विदेशीता और एकरूपता होनी चाहिए। एलिसा में उपयोग किए जाने पर वायरस और बैक्टीरिया के कई सिंथेटिक और पुनः संयोजक एंटीजन ने खुद को अच्छी तरह साबित कर दिया है। इसने क्रॉस-रिएक्शन को कम करके विधि की विशिष्टता और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्यता में काफी वृद्धि की।

एलिसा में सबसे महत्वपूर्ण अभिकर्मकों में से एक एंटीबॉडी हैं। एलिसा संवेदनशीलता उपयोग किए गए एंटीबॉडी की एकाग्रता, गतिविधि और विशिष्टता पर निर्भर करती है। उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी विभिन्न वर्ग (IgG या IgM) और उपवर्ग (IgGl, IgG2), एंटी-एलोटाइपिक या एंटी-इडियोटाइपिक के पॉली- या मोनोक्लिनल हो सकते हैं। कम एटी आत्मीयता पर, एजी-एटी कॉम्प्लेक्स के टूटने से सिस्टम से बाउंड एजी को हटा दिया जाता है। मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के उपयोग से विधि की संवेदनशीलता और विशिष्टता को बढ़ाया जाता है। इस मामले में, परीक्षण नमूनों में एजी (एटी) की कम सांद्रता का पता लगाना संभव हो जाता है।

संयुग्म गठन

एक संयुग्म एक एंटीजन या एंटीबॉडी है जिसे एंजाइम लेबल के साथ लेबल किया जाता है। संयुग्म का निर्माण एलिसा के महत्वपूर्ण चरणों में से एक है।

संयुग्म बनाते समय, एंजाइम लेबल को शुरू करने के लिए इस तरह की एक इष्टतम विधि का चयन किया जाता है ताकि संयुग्म के दोनों घटक अपनी जैविक गतिविधि को बनाए रखें: एंजाइम - सब्सट्रेट के साथ बातचीत करने की क्षमता, और एंटीजन या एंटीबॉडी - एंटीजेनिटी और एंटीजन-बाइंडिंग गतिविधि, क्रमशः। लेबल किए गए, अत्यधिक शुद्ध प्रतिजन की उपस्थिति प्रतिस्पर्धी तरीकों के उपयोग की अनुमति देती है। इस मामले में, स्थिर एंटीबॉडी के लिए बाध्य नहीं संयुग्म की गतिविधि को अंतिम चरण में मापा जा सकता है, जो धोने की प्रक्रिया से बचा जाता है और विश्लेषण को और अधिक सुविधाजनक बनाता है। हालांकि, एंटीजन अपने भौतिक-रासायनिक गुणों और संरचना में विविध हैं, जिसका अर्थ है कि एंटीजन के साथ संयुग्म प्राप्त करने के लिए सार्वभौमिक तरीकों को विकसित करना असंभव है। इस मामले में, एक एंटीजन-एंजाइम संयुग्म प्राप्त करना एक अलग चुनौती है। एलिसा के लिए लेबल किए गए एंटीबॉडी की तैयारी व्यवस्थित रूप से अधिक सुलभ है।

इम्यूनोकेमिकल सक्रिय प्रोटीन के साथ एक एंजाइम का संयुग्मन विभिन्न तरीकों से किया जाता है: रासायनिक क्रॉस-लिंकिंग, एंजाइम अणु के एजी या एटी के लिए सहसंयोजक बंधन, और गैर-सहसंयोजक बंधनों के माध्यम से यौगिकों का निर्माण, उदाहरण के लिए, जब के बीच संबंध एंटीजन-एंटीबॉडी इंटरैक्शन के माध्यम से एंजाइम और एजी या एटी को प्रतिरक्षात्मक रूप से किया जाता है।

संयुग्मों की तैयारी के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली सहसंयोजक विधियाँ। बाध्यकारी प्रतिक्रिया की पसंद इन प्रोटीन अणुओं में उपलब्ध कार्यात्मक समूहों के प्रकार से निर्धारित होती है। ग्लूटाराल्डिहाइड, सोडियम पीरियोडेट, आदि का उपयोग अभिकर्मकों के रूप में किया जाता है जो एंजाइम को एंटीजन और एंटीबॉडी अणुओं में पेश करने के लिए उपयोग किया जाता है।

ग्लूटाराल्डिहाइड का उपयोग करके संयुग्म प्राप्त करने के लिए एक-चरण और दो-चरणीय विधियां हैं। कम एंजाइमेटिक गतिविधि (मुक्त एंजाइम का 15 - 60%) के साथ विभिन्न आकारों के संयुग्म बन सकते हैं। परिणामी बड़े आकार के संयुग्म परीक्षण पदार्थ के निर्धारण में बाधा डाल सकते हैं। अपेक्षाकृत कम आणविक भार संयुग्म में एक फैब टुकड़ा और एक एंजाइम अणु होता है।

एक दो-चरण संश्लेषण के परिणामस्वरूप, जिसमें पहले एक क्रॉस-लिंकिंग एजेंट के साथ संशोधित एंजाइम की चरण-दर-चरण तैयारी होती है, इसका अलगाव, और फिर एक एंटीजन (एंटीबॉडी), अणुओं के साथ इसकी बाद की बातचीत होती है। सजातीय संरचना प्रति इम्युनोग्लोबुलिन अणु में 1-2 एंजाइम अणुओं से युक्त होती है और एक उच्च एंजाइमेटिक और प्रतिरक्षाविज्ञानी गतिविधि को बनाए रखती है। हालांकि, बनने वाले ऐसे संयुग्मों की मात्रा कम होती है (हॉर्सरडिश पेरोक्सीडेज के लिए यह 5-10% है)।

सोडियम पीरियडेट के साथ एंजाइम के कार्बोहाइड्रेट घटक के ऑक्सीकरण के आधार पर इम्युनोपरोक्सीडेज संयुग्म प्राप्त करने की विधि (संयुग्म के लिए पेरोक्सीडेज का बंधन एंजाइम की प्रारंभिक मात्रा के 70-90% तक पहुंच जाता है), सबसे बड़ा व्यावहारिक अनुप्रयोग पाया गया है।

एक विश्वसनीय संयुग्म में निम्नलिखित गुण होने चाहिए:

उच्च प्रतिरक्षी बाघ और प्रतिजन के लिए उच्च आत्मीयता ताकि इसे उच्च तनुकरण में उपयोग किया जा सके और इस प्रकार गैर-विशिष्ट बंधन को कम किया जा सके;

कार्य प्रजनन में पर्याप्त विशिष्टता;

बहुलक वाले पर मोनोमेरिक रूपों की प्रबलता, क्योंकि बहुलक रूप गैर-विशेष रूप से प्लास्टिक का पालन करते हैं, जिसके परिणामस्वरूप उच्च पृष्ठभूमि स्तर की प्रतिक्रिया होती है;

एंजाइम और एंटीबॉडी के बीच इष्टतम दाढ़ अनुपात (इष्टतम अनुपात लगभग 1:1 है);

संयुग्म की पर्याप्त एंजाइमेटिक गतिविधि। यह गुण मुख्य रूप से संयुग्मन की स्थितियों और संयुग्म में एंजाइम और एंटीबॉडी अणुओं के अनुपात से निर्धारित होता है।

सॉलिड फ़ेज़

एलिसा के ठोस चरण के रूप में विभिन्न सामग्रियों का उपयोग किया जा सकता है: पॉलीस्टाइनिन, पॉलीविनाइल क्लोराइड, पॉलीप्रोपाइलीन और अन्य पदार्थ। ठोस चरण एक टेस्ट ट्यूब, 96-वेल और अन्य प्लेटों, गेंदों, मोतियों, साथ ही नाइट्रोसेल्यूलोज और अन्य झिल्ली की दीवारें हो सकती हैं जो सक्रिय रूप से प्रोटीन को अवशोषित करती हैं।

ठोस चरण पर प्रतिजन या एंटीबॉडी का स्थिरीकरण तीन तरीकों से संभव है:

- प्रोटीन और सिंथेटिक सतह के बीच मजबूत हाइड्रोफोबिक इंटरैक्शन के आधार पर निष्क्रिय सोखना;

- ठोस चरण के लिए सहसंयोजक लगाव;

- इम्यूनोकेमिकल, आदि (गैर-सहसंयोजक और गैर-सोखना लगाव)।

नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर अनुमापन बोर्डों पर एलिसा का संचालन करते समय प्रोटीन के निष्क्रिय सोखना का व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है। निष्क्रिय सोखना संतृप्ति के सिद्धांत का पालन करता है और सोखने वाले पदार्थ के आणविक भार के साथ संबंध रखता है। विभिन्न प्रकार की झिल्लियों (नाइट्रोसेल्यूलोज, नायलॉन, आदि) की सोखने की सतह प्लास्टिक की तुलना में 100-1000 गुना अधिक होती है।

पॉलीसेकेराइड और अत्यधिक ग्लाइकोसिलेटेड प्रोटीन में अक्सर पॉलीस्टाइनिन के लिए कम आत्मीयता होती है। उन्हें स्थिर करने के लिए अन्य तरीकों की आवश्यकता होती है, जैसे ग्लूटाराल्डिहाइड के साथ सहसंयोजक लगाव। सहसंयोजक लगाव प्रभावी होता है यदि हाइड्रोफिलिक मोतियों (एग्रोसे) और पॉलीस्टाइन मोतियों को ठोस चरण के रूप में उपयोग किया जाता है।

इम्यूनोकेमिकल विधियां एंटीजन या एंटीबॉडी को स्थिर करने के लिए पूर्व-सोखने वाले "ट्रैप" एंटीबॉडी के उपयोग पर आधारित होती हैं। प्रतिरक्षात्मक रूप से स्थिर प्रतिजन निष्क्रिय रूप से अधिशोषित प्रतिजन की तुलना में 10 गुना अधिक सक्रिय होता है। बैक्टीरिया के लेक्टिन या इम्युनोग्लोबुलिन-बाध्यकारी प्रोटीन जो आसानी से प्लास्टिक या अन्य हाइड्रोफोबिक सतहों को सोख लेते हैं, जैसे कि कॉन्कानावेलिन ए (कॉन ए) या स्टेफिलोकोकल प्रोटीन ए, का उपयोग किया जा सकता है। कॉन ए एचआईवी वायरस के जीपी 120 प्रोटीन को स्थिर करने में सक्षम है।

ठोस चरण की सतह पर मुक्त साइटें जो adsorbed एजेंट के लिए बाध्य नहीं हैं, परीक्षण के दौरान अन्य अणुओं को ठीक कर सकती हैं, जिसमें संयुग्म शामिल हैं, जिससे पृष्ठभूमि संकेत में वृद्धि होती है। आधार सामग्री के ठोस चरण पर स्थिरीकरण के बाद गैर-विशिष्ट बंधन को रोकने के लिए, परीक्षण के लिए तटस्थ पदार्थों के साथ उपचार किया जाता है। सबसे लोकप्रिय अवरोधक एजेंट गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए), कैसिइन, आदि हैं। अवरोधक एजेंट की पसंद और इस चरण के लिए शर्तें ठोस चरण के प्रकार, सिस्टम की संवेदनशीलता पर निर्भर करती हैं।

वर्तमान में, एलिसा की विभिन्न किस्मों और संशोधनों की एक बड़ी संख्या का उपयोग किया जाता है। एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) के विभिन्न प्रकार व्यापक हो गए हैं।

ठोस चरण एलिसा 1971 में प्रस्तावित किया गया था। ठोस-चरण एलिसा के मूल सिद्धांत, संशोधन की परवाह किए बिना, इस प्रकार हैं:

1. प्रतिक्रिया के पहले चरण में, ठोस चरण पर एंटीजन या एंटीबॉडी का विज्ञापन किया जाता है। इस मामले में, ठोस चरण से बंधे हुए अभिकर्मकों को धोने से आसानी से हटा दिया जाता है।

2. परीक्षण के नमूने को संवेदनशील कुओं में इनक्यूबेट किया जाता है। सकारात्मक नियंत्रण कुओं में मानक अभिकर्मक होते हैं। इस मामले में, ठोस चरण की सतह पर प्रतिरक्षा परिसरों का निर्माण होता है। अनबाउंड घटकों को धोने से हटा दिया जाता है।

3. जब एक एंटीबॉडी-एंजाइम या एंटीजन-एंजाइम संयुग्म जोड़ते हैं और इसे स्थिर प्रतिरक्षा परिसर से बांधते हैं, तो एंजाइम की सक्रिय साइट सब्सट्रेट के साथ बाद की बातचीत के लिए उपलब्ध रहती है। स्थिर संयुग्म के साथ कुओं में सब्सट्रेट के ऊष्मायन से रंग प्रतिक्रिया का विकास होता है। इस प्रतिक्रिया को वांछित स्तर पर रोका जा सकता है, धुंधलापन की गंभीरता का आकलन नेत्रहीन या ऑप्टिकल घनत्व द्वारा किया जा सकता है।

ठोस-चरण विश्लेषण के किसी भी प्रकार में एक महत्वपूर्ण कदम अनबाउंड अभिकर्मकों को धोने की प्रक्रिया है। यह न केवल ठोस चरण पर तय घटकों को कुल्ला करने के लिए महत्वपूर्ण है, बल्कि अभिकर्मकों को परत की पूरी गहराई से हटाने के लिए भी महत्वपूर्ण है। ये विश्लेषण के सबसे अधिक समय लेने वाले और श्रम-गहन चरण हैं। एक मल्टीचैनल पिपेट के साथ एक विशेष उपकरण - एक वॉशर या मैन्युअल रूप से नमूने का उपयोग करके नमूनों को स्वचालित रूप से धोया जा सकता है। एलिसा का संचालन करने के लिए, आपको चाहिए:

- पॉलीस्टाइनिन टैबलेट या अन्य ठोस चरण विकल्पों का उपयोग किया जाता है;

- धोने का घोल;

- संयुग्म (एंजाइमी लेबल वाले एंटीजन या एंटीबॉडी);

- प्रयुक्त सबस्ट्रेट्स का मिश्रण;

- रोक समाधान (रोक अभिकर्मक - प्रतिक्रिया को रोकने के लिए समाधान);

- सकारात्मक और / या नकारात्मक नियंत्रण के लिए उपयोग किए जाने वाले नमूने;

- मानक प्रतिजन (अंशांकन वक्र बनाने के लिए);

- सिंगल और मल्टीचैनल पिपेट;

- वॉशर (वॉशर);

- परीक्षण समाधान के ऑप्टिकल घनत्व को निर्धारित करने के लिए एक ऑप्टिकल उपकरण (एलिसा रीडर, एक पाठक जो क्रमिक रूप से सभी कुओं को फोटोमीटर करता है);

- अध्ययन की गई जैविक सामग्री के 5-100 μl।

प्रत्यक्ष एलिसा

1. एंटीजन या एंटीबॉडी (परीक्षण सामग्री) पैनलों के कुओं में सोख लिए जाते हैं। यह ऊपर उल्लेख किया गया था कि एंटीजन विभिन्न प्रकार के प्लास्टिक पर सोखने की उनकी क्षमता में काफी भिन्न होते हैं, यह इस बात पर निर्भर करता है कि वे किस वर्ग के पदार्थों (प्रोटीन, कार्बोहाइड्रेट, या लिपोप्रोटीन) से संबंधित हैं। अक्सर प्रत्यक्ष एलिसा में, ठोस चरण पर स्थिर प्रतिजन कोशिकाएं और अन्य कण प्रतिजन होते हैं।

नियंत्रण। एक नियंत्रण के रूप में, एक सोखने वाले सकारात्मक नियंत्रण नमूने वाले कुओं का उपयोग किया जाता है, जिसमें आवश्यक रूप से वांछित प्रतिजन होता है, और एक नकारात्मक नियंत्रण नमूना, जिसमें स्पष्ट रूप से परीक्षण प्रतिजन नहीं होता है, का उपयोग किया जाता है। एक शुद्ध मानक प्रतिजन की उपस्थिति में, प्रतिक्रिया कई कमजोर पड़ने पर की जाती है ताकि एक अंशांकन वक्र का निर्माण किया जा सके।

2. "ठोस चरण पर शेष मुक्त बाध्यकारी साइटों को कैसिइन बीएसए, आदि के साथ ब्लॉक करें (ठोस चरण पर संयुग्म के गैर-विशिष्ट सोखना को रोकने के लिए)।

3. एंजाइम-लेबल एंटीबॉडी या एंटीजन (संयुग्म) को कुओं में जोड़ा जाता है और इनक्यूबेट किया जाता है। संयुग्म का ठोस चरण से बंधन तभी होगा जब सिस्टम के दोनों घटक पूरक हों। संयुग्म के साथ ऊष्मायन के बाद, कुओं को धोया जाता है, इस प्रकार संयुग्म के अनबाउंड भाग को हटा दिया जाता है।

4. उपयोग किए गए एंजाइम के लिए विशिष्ट सब्सट्रेट को फिर कुओं में जोड़ा जाता है और इनक्यूबेट किया जाता है। जब सकारात्मक नियंत्रण कुओं में धुंधलापन का इष्टतम स्तर पहुंच जाता है, तो एंजाइम प्रतिक्रिया बंद हो जाती है।

5. प्रतिक्रिया के लिए लेखांकन। सबसे पहले, प्रतिक्रिया के परिणामों को नेत्रहीन रूप से ध्यान में रखा जाता है। परिणामों के अधिक सटीक विवरण के लिए, धुंधला तीव्रता का मूल्यांकन एक उपयुक्त प्रकाश फिल्टर के साथ एलिसा रीडर पर किया जाता है। विश्लेषण के परिणामों के अनुसार, एकाग्रता पर ऑप्टिकल घनत्व की निर्भरता का एक ग्राफ तैयार किया गया है (चित्र 2)।

चित्रा 2. प्रत्यक्ष एलिसा।

ए) एक एंटीजन का पता लगाने के लिए; बी) एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए।

एलिसा के इस प्रकार का उपयोग आमतौर पर विशिष्ट एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए किया जाता है। मानक प्रतिजन पैनलों के कुओं में सोख लिया जाता है और रोगी से प्राप्त सीरम या अन्य जैविक सामग्री (मस्तिष्कमेरु द्रव, लार, आदि) के नमूनों के साथ इनक्यूबेट किया जाता है। एंटीग्लोबुलिन संयुग्म का उपयोग करके ठोस चरण पर एंटीजन से बंधे विशिष्ट एंटीबॉडी का पता लगाया जाता है। विश्लेषण के उद्देश्य के आधार पर, विभिन्न एंटीग्लोबुलिन अभिकर्मकों का उपयोग किया जाता है जो सभी आइसोटाइप के एंटीबॉडी का पता लगाते हैं, या अलग-अलग वर्गों और इम्युनोग्लोबुलिन के उपवर्गों के लिए विशिष्ट होते हैं। विधि का मुख्य लाभ संयुग्म की सार्वभौमिकता है। किसी भी नमूने में विभिन्न प्रकार के एंटीजन के लिए मानव एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एक ही संयुग्म का उपयोग किया जा सकता है। प्रतिक्रिया व्यवस्थित रूप से सरल है।

एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए अप्रत्यक्ष एलिसा के मुख्य चरण:

1. एंटीजन को ठोस चरण पर सोख लिया जाता है, फिर अनबाउंड घटकों से धोया जाता है।

2. फ्री बाइंडिंग साइट्स को ब्लॉक करें। धुलाई की गई।

3. परीक्षण सामग्री को कुओं में जोड़ा जाता है, ऊष्मायन किया जाता है और फिर धोया जाता है। समानांतर में, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण वाले नमूने रखे जाते हैं।

4. काम करने वाले कमजोर पड़ने में एंटीग्लोबुलिन संयुग्म जोड़ें, इनक्यूबेट करें, अनबाउंड घटकों को धो लें।

5. सब्सट्रेट पेश किया गया है, ऊष्मायन किया गया है। सकारात्मक नियंत्रण कुओं में धुंधला होने के इष्टतम स्तर तक पहुंचने पर, स्टॉप सॉल्यूशन जोड़कर प्रतिक्रिया को रोक दिया जाता है।

6. एलिसा रीडर पर प्रतिक्रिया उत्पाद की मात्रा को मापें (चित्र 3)।

इष्टतम परख स्थितियों के तहत, विधि अत्यधिक विशिष्ट और संवेदनशील है। यह आपको अध्ययन किए गए रोगियों के सीरा में एंटीबॉडी की नैनोग्राम मात्रा का पता लगाने की अनुमति देता है। संतोषजनक परिणाम प्राप्त करने के लिए, अभिकर्मकों और कार्यप्रणाली का मानकीकरण आवश्यक है। इस एलिसा संस्करण का उपयोग मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का परीक्षण करने के लिए भी किया जा सकता है।

इस एलिसा संस्करण का उपयोग करके पाए गए एंटीजन में कई एंटीबॉडी-बाइंडिंग एपिटोप्स होने चाहिए या एक ही विशिष्टता के दोहराव वाले, स्थानिक रूप से अलग किए गए एपिटोप्स होने चाहिए।

एलिसा के इस प्रकार को करते समय, ठोस चरण पर अधिशोषित अत्यधिक विशिष्ट पॉली- या मोनोक्लोनल एंटीबॉडी परीक्षण नमूने के साथ इनक्यूबेट किए जाते हैं। धोने की प्रक्रिया के बाद, उसी एंटीजन में एंजाइम-लेबल एंटीबॉडी (संयुग्म) को कुओं में जोड़ा जाता है, और फिर प्रतिक्रिया के अन्य सभी चरणों को अंजाम दिया जाता है। विश्लेषण के प्रत्येक चरण में एक विशिष्ट परिसर के गठन की दक्षता एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया के बाध्यकारी स्थिरांक पर निर्भर करती है।

विश्लेषण के मुख्य चरण:

1. मोनोक्लोनल एंटीबॉडी या आत्मीयता-शुद्ध पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी ठोस चरण पर स्थिर होते हैं।

2. परीक्षण नमूना पैनलों के कुओं में पेश किया जाता है, एक सकारात्मक नियंत्रण नमूना और एक नकारात्मक नियंत्रण नमूना विभिन्न कमजोरियों में समानांतर में रखा जाता है। ऊष्मायन और धोया।

3. एंजाइम-लेबल वाले मोनोक्लोनल या पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी (संयुग्म) को कुओं में पेश किया जाता है। ऊष्मायन के बाद धुलाई की जाती है।

4. सब्सट्रेट पेश किया गया है, ऊष्मायन किया गया है। सकारात्मक नियंत्रण कुओं में इष्टतम धुंधलापन प्राप्त होने पर प्रतिक्रिया रोक दी जाती है।

5. एलिसा रीडर पर परिणामों के लिए लेखांकन।

विधि का मुख्य लाभ इसकी उच्च संवेदनशीलता है, जो अन्य एलिसा योजनाओं (छवि 4) की क्षमताओं से अधिक है।

चित्रा 3. एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए अप्रत्यक्ष एलिसा।

यह विश्लेषण विकल्प ठोस चरण पर अधिशोषित प्रतिजन के लिए बाध्यकारी के लिए लेबल (संयुग्म) और गैर-लेबल (परीक्षण) एंटीबॉडी की प्रतिस्पर्धा पर आधारित है। ठोस चरण से जुड़े एंजाइम की मात्रा मिश्रण में मुक्त एंटीबॉडी की सामग्री के अनुपात में घट जाएगी। प्रतिजन का निर्धारण करने के लिए, एक ही विकल्प का उपयोग किया जाता है, लेकिन इस मामले में वांछित प्रतिजन ठोस चरण की सतह पर स्थिर एंटीबॉडी के लिए बाध्य करने के लिए लेबल, मानक प्रतिजन के साथ प्रतिस्पर्धा करता है।

प्रतिस्पर्धी पद्धति के लिए न्यूनतम संख्या में संचालन, अभिकर्मकों की कम खपत की आवश्यकता होती है, और इसे आसानी से स्वचालित किया जा सकता है। एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एक प्रतिस्पर्धी एलिसा आयोजित करते समय, लेबल किए गए मोनोक्लिनल एंटीबॉडी का उपयोग करना बेहतर होता है, फिर परीक्षण नमूने के साथ संयुग्म की प्रतियोगिता ठोस चरण पर सोखने वाले एंटीजन के एकल एपिटोप के लिए होती है। इस एलिसा संस्करण का उपयोग विभिन्न यौगिकों, जैसे मानव इम्युनोग्लोबुलिन, कैंसर-भ्रूण प्रतिजन, इंसुलिन आदि को निर्धारित करने के लिए किया जाता है। यह संक्रामक एजेंटों के नैदानिक ​​​​रूप से महत्वपूर्ण एपिटोप्स के लिए एंटीबॉडी का पता लगाने की अनुमति देता है।

एंटीजन का पता लगाने के लिए विश्लेषण के मुख्य चरण (चित्र 5):

1. एंटीजन का पता लगाने के लिए विशिष्ट मोनोक्लोनल एंटीबॉडी ठोस चरण पर स्थिर होते हैं।

2. एंजाइम और परीक्षण नमूने के साथ लेबल किए गए एंटीजन को पैनलों के कुओं में एक ज्ञात एकाग्रता में जोड़ें। ऊष्मायन और धुलाई करें। समानांतर में, सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण आसन्न कुओं में रखे जाते हैं। विभिन्न तनुकरणों में एक मानक गैर-लेबल प्रतिजन का उपयोग करके अंशांकन का निर्माण करना।

3. सकारात्मक नियंत्रण कुओं में इष्टतम धुंधला विकसित होने पर सब्सट्रेट जोड़ें, इनक्यूबेट करें, प्रतिक्रिया रोकें।

4. एलिसा रीडर पर प्रतिक्रिया के लिए लेखांकन।

इस मामले में, परीक्षण नमूने में एंटीजन की मात्रा ठोस चरण पर एंजाइमी गतिविधि के विपरीत आनुपातिक है।

एलिसा के इस प्रकार में, परीक्षण नमूने में मौजूद एंटीजन एंजाइम-लेबल वाले मोनोक्लोनल एंटीबॉडी से बांधता है और ठोस चरण पर स्थिर मानक एंटीजन के साथ उनकी बातचीत को रोकता है। संयुग्म के लिए विशिष्ट एंटीजन की सम ट्रेस मात्रा के नमूने में उपस्थिति स्थिर एंटीजन के लिए लेबल एंटीबॉडी के बंधन को रोक देगी। निषेध की डिग्री समाधान में प्रतिजन की सामग्री के सीधे आनुपातिक है। मात्रात्मक विश्लेषण के लिए, मानक एंटीजन के सीरियल कमजोर पड़ने का उपयोग करके एक अंशांकन वक्र बनाया जाता है। एंटीजन का पता लगाने के लिए निरोधात्मक एलिसा के मुख्य चरण (चित्र 6)।

1. पैनलों के कुओं में मानक एंटीजन को सोखें। अनुमापन द्वारा लेबल एंटीबॉडी के एक कार्यशील कमजोर पड़ने का चयन करें।

चित्रा 4. "सैंडविच" - एलिसा संस्करण।

2. संयुग्म परीक्षण नमूने, मानक प्रतिजन और सकारात्मक नियंत्रण नमूनों के कमजोर पड़ने के साथ काम कर रहे कमजोर पड़ने पर पूर्व-ऊष्मायन किया जाता है।

3. मिश्रण को पैनलों के कुओं में स्थानांतरित किया जाता है। 100% बंधन को नियंत्रित करने के लिए, केवल लेबल एंटीबॉडी को कई कुओं में जोड़ा जाता है, बिना निरोधात्मक प्रतिजन के। पैनलों को इनक्यूबेट किया जाता है और फिर धोया जाता है।

4. सब्सट्रेट जोड़ें।

5. परिणाम रिकॉर्ड करें।

परीक्षण नमूने में निर्धारित किए जाने वाले प्रतिजन की सांद्रता ठोस चरण पर एंजाइमी गतिविधि के व्युत्क्रमानुपाती होती है।

एलिसा का उपयोग न केवल घुलनशील एंटीजन या एंटीबॉडी को निर्धारित करने के लिए किया जा सकता है, बल्कि विभिन्न प्रोटीन उत्पन्न करने वाली कोशिकाओं के लिए भी किया जा सकता है।

1983 में, एलिसा तकनीक को इन विट्रो में एंटीबॉडी या एंटीजन (जैसे, साइटोकिन्स) को स्रावित करने वाली लिम्फोइड कोशिकाओं का पता लगाने के लिए अनुकूलित किया गया था। विधि को ELISPOT (एंजाइमेटिक इम्यूनोसे या स्पॉट मेथड) कहा जाता है। विधि का मुख्य सिद्धांत:

1. एक पॉलीस्टायर्न कुएं की सतह पर (24-वेल सेल कल्चर पैनल का उपयोग करके), एंटीजन या एंटीबॉडी को सोख लिया जाता है, जो "ट्रैपिंग" अभिकर्मकों के रूप में काम करते हैं।

2. अध्ययन की गई लिम्फोइड कोशिकाओं को जोड़ा जाता है, 37 डिग्री सेल्सियस पर कई घंटों तक सुसंस्कृत किया जाता है, जिससे उन्हें एक निश्चित स्थान पर कब्जा करने और एक स्रावी कार्य करने का अवसर मिलता है। ऐसी कोशिकाओं द्वारा स्रावित प्रतिपिंडों या प्रतिजनों को ठोस चरण पर अधिशोषित अभिकर्मकों द्वारा ग्रहण किया जाता है।

3. सेल लाइसिंग डिटर्जेंट के साथ वाशिंग सॉल्यूशन का उपयोग करके कोशिकाओं को हटा दिया जाता है।

4. स्रावी उत्पादों के संचय की साइटों को एंजाइम (एंटीग्लोबुलिन अभिकर्मक) से जुड़े एंटीबॉडी जोड़कर दिखाया जाता है।

5. सब्सट्रेट-अगारोज मिश्रण जोड़ा जाता है (उपयोग किए गए सब्सट्रेट को agarose में घुलना चाहिए और अघुलनशील प्रतिक्रिया उत्पादों का निर्माण करना चाहिए), भूरे या नीले धब्बे ठोस चरण की सतह पर बनते हैं (उपयोग किए गए एंजाइम और सब्सट्रेट के आधार पर), उन क्षेत्रों का खुलासा करते हैं जहां कोशिकाएं हैं स्थित थे।

परिणामी धब्बों को एक माइक्रोस्कोप के तहत गिना जाता है, यह स्रावी कोशिकाओं की संख्या होगी।

एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली को एक ठोस चरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस मामले में, कई फायदे हैं: एनसीएम की उच्च सोखना क्षमता के कारण, "ट्रैपिंग" अभिकर्मक के रूप में उपयोग किए जाने वाले एंटीजन की काफी कम मात्रा की आवश्यकता होती है; इसके अलावा, सब्सट्रेट में agarose को शामिल करने की कोई आवश्यकता नहीं है।

एक साथ स्रावित कोशिकाओं की संख्या और कुएं में स्रावित प्रतिजन या एंटीबॉडी की कुल मात्रा का निर्धारण करके, जो एक अलग सब्सट्रेट का उपयोग करते समय संभव है, एक एकल कोशिका द्वारा स्रावित पदार्थ की मात्रा निर्धारित करना संभव है।

इस पद्धति ने उन कोशिकाओं की संख्या का आकलन करने के लिए व्यापक आवेदन पाया है जो adsorbed एंटीबॉडी द्वारा कब्जा किए गए एंटीजन को स्रावित करते हैं, इसका उपयोग साइटोकिन्स (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6) को स्रावित करने वाली कोशिकाओं की संख्या निर्धारित करने के लिए किया जाता है। आईएफएन-वाई, टीएनएफ-ए)।

उच्च-आत्मीयता एंटीबॉडी का उपयोग करते समय, व्यक्तिगत एलिसा वेरिएंट की संवेदनशीलता बहुत अधिक होती है और सैद्धांतिक रूप से एकल एंटीजन अणुओं का पता लगाना संभव हो जाता है, लेकिन व्यवहार में संवेदनशीलता कई कारकों द्वारा सीमित होती है: एंजाइम गतिविधि, सिग्नल तीव्रता और सिग्नल लेखांकन विधियां . सिग्नल एम्प्लीफिकेशन सिस्टम विभिन्न एलिसा वेरिएंट की संवेदनशीलता को बढ़ाना संभव बनाता है। इनमें से कुछ प्रणालियों पर विचार करें:

एविडिन-बायोटिन की परस्पर क्रिया के आधार पर।

बायोटिन कोएंजाइम अणु (मिमी 244 दा) बायोटिनिल-एन-हाइड्रॉक्सीसुसीमाइड का उपयोग करके एंटीबॉडी के साथ संयुग्मित होते हैं। एक छोटा बायोटिन अणु अपनी प्रतिरक्षा या एंजाइमी गुणों का उल्लंघन किए बिना एक इम्युनोग्लोबुलिन या अन्य प्रोटीन से जुड़ना आसान होता है। इस मामले में एंजाइम अंडे के सफेद ग्लाइकोप्रोटीन एविडिन से बंधा होता है। बायोटिन के लिए एविडिन की बाध्यकारी आत्मीयता बहुत अधिक है (कॉम्प्लेक्स का पृथक्करण स्थिरांक 10-15 mol है), एविडिन-एंजाइम संयुग्म एंटीजन-एंटीबॉडी-बायोटिन कॉम्प्लेक्स पर मजबूती से तय होता है। उपयुक्त सब्सट्रेट जोड़ने के बाद, प्रतिक्रिया उत्पाद स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से या ल्यूमिनेसेंस तीव्रता द्वारा निर्धारित किया जाता है।

एक एविडिन अणु में चार समान सबयूनिट होते हैं, जो चार बायोटिन अणुओं के साथ बातचीत करने में सक्षम होते हैं, जो इसे दो बायोटिन युक्त यौगिकों के बीच एक लिंकिंग अणु के रूप में उपयोग करने की अनुमति देता है। इस मामले में, एंजाइम भी बायोटिनाइलेटेड होता है, और एविडिन एक सेतु के रूप में कार्य करता है, जो बायोटिन अवशेषों वाले दो अणुओं को जोड़ता है। मुक्त एविडिन को परिणामी एंटीजन-एंटीबॉडी-बायोटिन कॉम्प्लेक्स में जोड़ा जाता है, इसके बाद बायोटिनाइलेटेड एंजाइम होता है। प्रतिक्रिया रिकॉर्ड करें।

एविडिन प्रोटीन को अन्य अणुओं पर गैर-विशिष्ट रूप से अवशोषित किया जा सकता है; इसलिए, एक अन्य बायोटिन-बाध्यकारी प्रोटीन, स्ट्रेप्टाविडिन, जीवाणु स्ट्रेप्टोमाइसेस एविडिनी में पाया जाता है, का तेजी से उपयोग किया जा रहा है। स्ट्रेप्टाविडिन भी बायोटिन के साथ एक मजबूत परिसर बनाता है और इसमें चार समान सबयूनिट होते हैं।

एविडिन-बायोटिन कॉम्प्लेक्स के उपयोग से एलिसा की संवेदनशीलता में उल्लेखनीय वृद्धि संभव हो जाती है, क्योंकि संयुग्म के संश्लेषण के दौरान दर्जनों बायोटिन अणु एक एटी अणु से बंधे हो सकते हैं। संयुग्म (बायोटिन के साथ एंटीबॉडी और एंजाइम) प्राप्त करना काफी आसान है और इसके साथ उनकी प्रतिरक्षात्मक और एंजाइमेटिक गतिविधि में न्यूनतम परिवर्तन होते हैं। बायोटिन के साथ एंजाइमों के संयुग्मों का उपयोग सार्वभौमिक अभिकर्मकों के रूप में किया जा सकता है।

रसायनयुक्त अभिक्रियाओं का उपयोग।

विधि की संवेदनशीलता को बढ़ाने और विश्लेषण के समय को कम करते हुए, एलिसा में एक संकेत प्राप्त करने के लिए केमिलुमिनसेंट प्रतिक्रियाओं का उपयोग किया जा सकता है। हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज का व्यापक रूप से एलिसा में एक लेबल के रूप में उपयोग किया जाता है, और इसका पता लगाने के लिए विभिन्न रसायनयुक्त प्रतिक्रियाओं का भी उपयोग किया जा सकता है। हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ ऑक्सीकृत होने पर केमिलुमिनसेंट प्रतिक्रियाएं ल्यूमिनॉल की चमक की क्षमता पर आधारित होती हैं। प्रत्यक्ष विश्लेषण में, एक एंजाइमैटिक प्रतिक्रिया हाइड्रोजन पेरोक्साइड का उत्पादन करती है और ल्यूमिनॉल का ऑक्सीकरण करती है; यह प्रतिक्रिया हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज द्वारा उत्प्रेरित होती है। संकेत को बढ़ाने के लिए, विभिन्न यौगिकों का उपयोग किया जाता है, उदाहरण के लिए, ल्यूसिफरिन, फिनोल, इस मामले में, ल्यूमिनेसेंस की तीव्रता 10-100 गुना बढ़ जाती है, कुछ मामलों में 500 गुना (बढ़ी हुई रसायनयुक्त विश्लेषण)। ल्यूमिनसेंट सिग्नल बहुत स्थिर है, इसका स्तर अधिकतम 30 एस में पहुंच जाता है (तुलना के लिए: ओपीडी के साथ एक संकेतक के रूप में रंग प्रतिक्रिया पूरी तरह से केवल 30 मिनट में विकसित होती है)।

ल्यूमिनॉल या इसके डेरिवेटिव के साथ अप्रत्यक्ष विश्लेषण में, एंटीबॉडी को लेबल किया जाता है। मुक्त अवस्था में ऐसा लेबल प्रकाश की रिहाई के साथ हाइड्रोजन पेरोक्साइड द्वारा ऑक्सीकृत होने में सक्षम है। यदि यह एक जटिल बना है, तो यह ऑक्सीकरण करने की क्षमता खो देता है।

कैस्केड सिस्टम के आधार पर।

एलिसा की संवेदनशीलता को बढ़ाने के लिए एंजाइम कैस्केड सिस्टम का उपयोग किया जा सकता है। इस मामले में, पहले एंटीबॉडी-बाध्य एंजाइम का परिणाम दूसरे एंजाइम प्रणाली के लिए एक कम करने योग्य सब्सट्रेट में होता है। दूसरा एंजाइम सिस्टम सब्सट्रेट-साइक्लिक या रेडॉक्सीसाइक्लिक हो सकता है। इस मामले में, फॉस्फो-ग्लूकोइसोमेरेज़, एल्डोलेज़, क्षारीय फॉस्फेट एंजाइम लेबल के रूप में काम कर सकते हैं। अंतिम प्रतिक्रिया उत्पाद नेत्रहीन या स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक रूप से निर्धारित किया जाता है।

एलिसा प्रवर्धन प्रणाली उच्च संवेदनशीलता प्राप्त करती है। इस तरह के एलिसा सिस्टम का उपयोग हार्मोन (थायरॉयड-उत्तेजक, प्रोजेस्टेरोन, आदि) के स्तर को निर्धारित करने के लिए किया जाता है।

एलिसा ने विधि की सापेक्ष सादगी और उच्च संवेदनशीलता के कारण चिकित्सा और जीव विज्ञान के विभिन्न क्षेत्रों में व्यापक आवेदन पाया है। एलिसा का सफलतापूर्वक उपयोग किया गया है:

संक्रामक रोगों का सामूहिक निदान (विभिन्न विशिष्ट प्रतिजनों या उनके प्रति एंटीबॉडी का पता लगाना);

जैविक नमूनों में हार्मोन और दवाओं के स्तर का पता लगाना और उनका निर्धारण करना;

एक विशिष्ट प्रतिजन के खिलाफ एंटीबॉडी के आइसोटाइप निर्धारण (IgG, IgM और अन्य);

प्रतिरक्षा परिसरों का पता लगाना;

ट्यूमर मार्करों का पता लगाना;

रक्त सीरम प्रोटीन (फेरिटिन, फाइब्रोनेक्टिन, आदि) का निर्धारण;

कुल IgE और विशिष्ट IgE एंटीबॉडी का निर्धारण;

मायोक्लोनल एंटीबॉडी के लिए स्क्रीनिंग;

जैविक तरल पदार्थों में साइटोकिन्स की परिभाषा।

विधि संवेदनशीलता

एलिसा ने पहले नैदानिक ​​अभ्यास में व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले एग्लूटीनेशन, वर्षा और आरआईए के तरीकों को बदल दिया है। उपरोक्त विधियों की तुलना में, एलिसा कम श्रमसाध्य और कम समय लेने वाली है, बड़ी संख्या में एक ही प्रकार के विश्लेषण करने के लिए सुविधाजनक है।

एलिसा एंजाइम लेबलिंग की उच्च संवेदनशीलता के साथ एक इम्यूनोकेमिकल परख की अनूठी विशिष्टता को जोड़ती है। विधि की संवेदनशीलता (संवेदनशीलता के तहत एंटीबॉडी या एंटीजन की न्यूनतम पता लगाने योग्य मात्रा का मतलब है) निम्नलिखित कारकों द्वारा निर्धारित किया जाता है: एंटीबॉडी की आत्मीयता, मोनोक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग बेहतर है; एंजाइम की विशिष्ट गतिविधि; संकेत तीव्रता; संकेत संवेदनशीलता। विभिन्न एलिसा वेरिएंट उनकी संवेदनशीलता में भिन्न हैं। ठोस-चरण एलिसा के अलग-अलग प्रकार एक नमूने में एकल अणुओं का पता लगाना संभव बनाते हैं। एलिसा की औसत संवेदनशीलता 10-9 - 10-12 mol है।

गैलाक्टोनोव वी.जी. इम्यूनोलॉजी। मॉस्को यूनिवर्सिटी प्रेस, 1998

किशकुन ए.ए. नैदानिक ​​​​अभ्यास में संक्रामक रोगों के निदान के लिए प्रतिरक्षाविज्ञानी अध्ययन और तरीके। चिकित्सा समाचार एजेंसी, 2009

कोंड्रातिवा आई.ए. इम्यूनोलॉजी पर कार्यशाला। हाई स्कूल के लिए पाठ्यपुस्तक। अकादमी, 2004

लेफकोविट्स आई।, पर्निस बी। इम्यूनोलॉजिकल रिसर्च मेथड्स। शांति, 1988

रोइट ए, ब्रोस्टॉफ डी, मील डी। इम्यूनोलॉजी। शांति, 2000

सोकोलोव ई.आई. क्लिनिकल इम्यूनोलॉजी। चिकित्सा, 1998

फ्रिमेल जी। इम्यूनोलॉजिकल तरीके। चिकित्सा, 1987

खैतोव आर एम इम्यूनोलॉजी। चिकित्सा, 2000

शिगीना यू.वी. इम्यूनोलॉजी: पाठ्यपुस्तक। रियोर पब्लिशिंग हाउस, 2007

यारिलिन ए.ए. इम्यूनोलॉजी की मूल बातें। चिकित्सा, 1999

सेलुलर प्रौद्योगिकियों, आणविक जीव विज्ञान, आनुवंशिकी, भौतिकी, रसायन विज्ञान और कई अन्य उच्च-तकनीकी विषयों के विकास के संबंध में, नए उच्च-सटीक और उच्च-तकनीकी तरीकों को रोजमर्रा के अभ्यास में पेश किया जा रहा है। ये अंतःविषय रुझान चिकित्सा ज्ञान के क्षेत्र और जैविक और जैव रासायनिक समस्याओं के संबंधित क्षेत्रों दोनों को प्रभावित करते हैं। पिछले दस वर्षों में, नैदानिक ​​​​प्रयोगशाला निदान की एक विधि जिसे एंजाइम इम्युनोसे कहा जाता है, व्यापक हो गई है और बड़े पैमाने पर अभ्यास में पेश की गई है।

सामान्य तौर पर, 1980 के दशक की शुरुआत से कोशिकाओं, सेल संस्कृतियों और विभिन्न ऊतकों के टाइपिंग में प्रतिरक्षाविज्ञानी एंजाइमेटिक और रेडियोलॉजिकल प्रतिक्रियाओं की तकनीकों का व्यापक रूप से उपयोग किया गया है। हालांकि, ये विधियां बहुत श्रमसाध्य थीं, एकीकृत नहीं थीं, मानकीकृत नहीं थीं, जो बड़े पैमाने पर चिकित्सा और नैदानिक ​​​​उद्देश्यों के लिए उनके उपयोग को रोकती थीं। केवल संकीर्ण, ज्ञान-गहन और अत्यधिक विशिष्ट प्रयोगशालाओं ने ही इस तरह के तरीकों का इस्तेमाल किया।

हालांकि, प्रौद्योगिकी, सूक्ष्म प्रौद्योगिकी के विकास और विभिन्न बायोपॉलिमर सामग्रियों के उत्पादन के साथ, तैयार एंजाइम इम्यूनोसे किट का उत्पादन संभव हो गया है जिसका उपयोग सामान्य चिकित्सा संस्थानों की प्रयोगशालाओं द्वारा किया जा सकता है। एलिसा का व्यापक रूप से सभी प्रकार के संक्रमणों (क्लैमाइडिया, सिफलिस, साइटोमेगालोवायरस, टोक्सोप्लाज़मोसिज़, दाद, आदि) के निदान के लिए उपयोग किया जाता है, दोनों तीव्र और जीर्ण, साथ ही गुप्त रूप जो नैदानिक ​​लक्षणों के बिना होते हैं। इस पद्धति का उपयोग पुरानी बीमारियों को नियंत्रित करने के लिए भी किया जाता है। . आइए यह पता लगाने की कोशिश करें कि यह किस तरह की विधि है, और इसके कौन से सिद्धांत हैं?

एंजाइम इम्यूनोसे घटक - प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और एंजाइमी प्रतिक्रिया

एंजाइम इम्युनोसे, जैसा कि नाम से ही स्पष्ट है, इसमें दो अलग-अलग घटक होते हैं - एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और एक एंजाइमी प्रतिक्रिया। प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया जैविक अणुओं, कोशिका या सूक्ष्मजीव के तत्वों के बंधन का उत्पादन करती है, जो वास्तव में पता लगाने की कोशिश कर रहे हैं, और एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया आपको प्रतिरक्षात्मक प्रतिक्रिया के परिणाम को देखने और मापने की अनुमति देती है। यानी प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया एक जटिल तकनीक का हिस्सा है जो वास्तव में वांछित सूक्ष्म जीव का पता लगाती है। और एंजाइम प्रतिक्रिया एक जटिल तकनीक का वह हिस्सा है जो आपको प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के परिणाम को एक ऐसे रूप में अनुवाद करने की अनुमति देता है जो आंखों को दिखाई देता है और नियमित रासायनिक विधियों द्वारा माप के लिए सुलभ होता है। एंजाइम इम्यूनोएसे विधि की इस संरचना के आधार पर, हम इसके दोनों भागों का अलग-अलग विश्लेषण करेंगे।

प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, यह क्या है? एंटीबॉडी या एंटीजन क्या है?

एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया क्या है? एक एंटीजन क्या है?
सबसे पहले, आइए देखें कि प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाएं क्या हैं। प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया- ये एक प्रतिरक्षी परिसर के निर्माण के साथ प्रतिरक्षी के प्रतिजन के बंधन की विशिष्ट प्रतिक्रियाएं हैं। इसका क्या मतलब है? किसी भी जीव की प्रत्येक कोशिका की सतह पर विशेष संरचनाएं होती हैं जिन्हें कहा जाता है एंटीजन. सामान्य रूप से प्रतिजन अणु होते हैं जो एक कोशिका के बारे में जानकारी ले जाते हैं (किसी व्यक्ति के बैज की जानकारी के समान, जो इस व्यक्ति के मूल डेटा को इंगित करता है)।

व्यक्तिगत और प्रजाति प्रतिजन - यह क्या है? इन एंटीजन की आवश्यकता क्यों है?

उपलब्ध एंटीजन व्यक्तिगत, अर्थात्, केवल इस विशेष जीव के लिए निहित है। ये अलग-अलग एंटीजन सभी लोगों के लिए अलग-अलग होते हैं, कुछ एक-दूसरे के समान होते हैं, लेकिन फिर भी अलग होते हैं। प्रकृति में अलग-अलग प्रतिजनों की दो समान प्रतियां नहीं हैं!

दूसरा मुख्य प्रकार का प्रतिजन है प्रजाति प्रतिजन, अर्थात्, जीवित प्राणियों की किसी विशेष प्रजाति में निहित है। उदाहरण के लिए, मनुष्यों की अपनी प्रजाति प्रतिजन होती है जो सभी मनुष्यों के लिए समान होती है, चूहों की अपनी माउस प्रजाति प्रतिजन होती है, और इसी तरह। प्रत्येक कोशिका की सतह पर, एक विशिष्ट और व्यक्तिगत प्रतिजन आवश्यक रूप से मौजूद होता है।

प्रजाति प्रतिजन का उपयोग प्रतिरक्षा प्रणाली की कोशिकाओं द्वारा "दोस्त या दुश्मन" की पहचान करने के लिए किया जाता है।

एंटीजन मान्यता कैसे होती है?

एक प्रतिरक्षा कोशिका एक संदिग्ध कोशिका से बंध जाती है और एक व्यक्तिगत प्रतिजन द्वारा सटीक रूप से पहचान करती है। प्रतिरक्षा कोशिका की स्मृति में, यह "रिकॉर्ड" किया जाता है कि "इसका एंटीजन" कैसा दिखता है। इस प्रकार, यदि किसी संदिग्ध कोशिका का प्रतिजन "स्वयं के प्रतिजन" के विवरण से मेल खाता है, तो उसके अपने शरीर की यह कोशिका खतरे में नहीं है। फिर प्रतिरक्षा कोशिका "एकजुट" हो जाती है और निकल जाती है। और यदि प्रतिजन "स्वयं" के विवरण से मेल नहीं खाता है, तो प्रतिरक्षा कोशिका इस कोशिका को "विदेशी" के रूप में पहचानती है, और इसलिए पूरे जीव के लिए संभावित रूप से खतरनाक है। इस मामले में, प्रतिरक्षा कोशिका "मुक्त" नहीं होती है, लेकिन खतरनाक वस्तु को नष्ट करना शुरू कर देती है। ऐसी प्रतिरक्षाविज्ञानी मान्यता की सटीकता अद्भुत है - 99.97%। लगभग कोई गलती नहीं है!

एक एंटीबॉडी, प्रतिरक्षा परिसर क्या है?
एक एंटीबॉडी क्या है?

एक एंटीबॉडी एक विशेष अणु है जो एक प्रतिरक्षा कोशिका की सतह पर स्थित होता है। यह एंटीबॉडी है जो संदिग्ध कोशिका के प्रतिजनों को बांधती है। इसके अलावा, एंटीबॉडी सेल के अंदर सूचना प्रसारित करती है, जहां पहचान होती है, और दो प्रकार के "मित्र" या "विदेशी" का वापसी संकेत प्राप्त करता है। संकेत "स्वयं" पर, एंटीबॉडी प्रतिजन के साथ बंधन को नष्ट कर देता है और कोशिका को छोड़ देता है।

एक प्रतिरक्षा परिसर क्या है?
"विदेशी" संकेत के साथ, स्थिति अलग तरह से सामने आती है। एंटीबॉडी प्रतिजन के साथ संबंध नहीं तोड़ता है, बल्कि इसके विपरीत, विशिष्ट संकेत भेजकर, यह "सुदृढीकरण" का कारण बनता है। जैविक रूप से, इसका मतलब है कि कोशिका के दूसरे हिस्से में स्थित अन्य एंटीबॉडी उस स्थान पर जाने लगते हैं जहां से खतरे का संकेत आता है, और साथ ही अपने और कैप्चर किए गए एंटीजन के बीच एक संबंध भी बनाते हैं। अंत में, प्रतिजन चारों ओर से घिरा होता है और मजबूती से जुड़ा होता है। ऐसे प्रतिजन + प्रतिरक्षी संकुल को कहा जाता है प्रतिरक्षा परिसर. इस क्षण से प्रतिजन का उपयोग शुरू होता है। लेकिन अब हमें एंटीजन न्यूट्रलाइजेशन प्रक्रिया के विवरण में कोई दिलचस्पी नहीं है।

एंटीबॉडी के प्रकार (आईजी ऐ, आईजीएम, आईजीजी, आईजी डी, मैं जीई)
एंटीबॉडी प्रोटीन संरचनाएं हैं, जो तदनुसार, एक रासायनिक नाम है, जो एंटीबॉडी शब्द के पर्याय के रूप में प्रयोग किया जाता है। इसलिए, एंटीबॉडी = इम्युनोग्लोबुलिन.

इम्युनोग्लोबुलिन 5 प्रकार के होते हैं (Ig), जो मानव शरीर के विभिन्न स्थानों में विभिन्न प्रकार के प्रतिजनों से बंधते हैं (उदाहरण के लिए, त्वचा पर, श्लेष्मा झिल्ली पर, रक्त में, आदि)। यानी एंटीबॉडी में श्रम का विभाजन होता है। इन इम्युनोग्लोबुलिन को लैटिन वर्णमाला के अक्षर कहा जाता है - ए, एम, जी, डी, ई और निम्नानुसार नामित हैं - आईजीए, आईजीएम, आईजीजी, आईजीडी, आईजीई।

निदान में, केवल एक प्रकार के एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, जो कि सूक्ष्म जीव के निर्धारण के लिए सबसे विशिष्ट है। अर्थात्, इस प्रकार के एंटीबॉडी का निर्धारण किए जा रहे प्रतिजन से बंधन हमेशा होता है। सबसे अधिक उपयोग किए जाने वाले आईजीजी और आईजीएम हैं।

यह प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का सिद्धांत है (जैविक वस्तु की पहचान की अनूठी सटीकता और विशिष्टता निर्धारित की जा रही है) जो एंजाइम इम्यूनोसे को रेखांकित करती है। एंटीजन को पहचानने में एंटीबॉडी की उच्च सटीकता के कारण, संपूर्ण एंजाइम इम्यूनोसे विधि की सटीकता भी है उच्चतम।

एंजाइमी प्रतिक्रिया

एक एंजाइमी प्रतिक्रिया क्या है? आत्मीयता, सब्सट्रेट और प्रतिक्रिया उत्पाद क्या है?
आइए हम एंजाइम इम्यूनोएसे विधि के कार्य में एंजाइमी प्रतिक्रिया पर विचार करें।

एक एंजाइमी प्रतिक्रिया क्या है?

एक एंजाइमेटिक प्रतिक्रिया एक रासायनिक प्रतिक्रिया है जिसमें एक पदार्थ एंजाइम की क्रिया से दूसरे में परिवर्तित हो जाता है। वह पदार्थ जिस पर एंजाइम कार्य करता है, कहलाता है सब्सट्रेट. एक एंजाइम की क्रिया के परिणामस्वरूप प्राप्त होने वाले पदार्थ को कहा जाता है प्रतिक्रिया उत्पाद. इसके अलावा, एंजाइमी प्रतिक्रिया की ख़ासियत ऐसी है कि एक निश्चित एंजाइम केवल एक निश्चित सब्सट्रेट पर कार्य करता है। अपने "स्वयं" सब्सट्रेट को पहचानने के लिए एंजाइम की इस संपत्ति को कहा जाता है आत्मीयता.

इस प्रकार, प्रत्येक एंजाइम केवल एक विशिष्ट प्रतिक्रिया करता है। जैविक दुनिया में बहुत सारे एंजाइम हैं, साथ ही एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाएं भी हैं। एंजाइम इम्युनोसे में, केवल कुछ एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं का उपयोग किया जाता है - 10 से अधिक नहीं। इस मामले में, ऐसी एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं को चुना गया था, जिनमें से उत्पाद रंगीन पदार्थ हैं। एंजाइमी प्रतिक्रिया के उत्पादों को रंगीन क्यों होना चाहिए? क्योंकि रंगीन विलयन से किसी पदार्थ की सांद्रता की गणना करने के लिए एक सरल रासायनिक विधि है - वर्णमिति.

वर्णमिति विधि - सार और सिद्धांत

वर्णमितिसमाधान के रंग घनत्व के माप का उपयोग करता है, और पदार्थ की एकाग्रता की गणना रंग घनत्व से की जाती है। इस मामले में, एक विशेष उपकरण - एक वर्णमापी समाधान के रंग घनत्व को मापता है। वर्णमिति में, किसी पदार्थ की सांद्रता पर रंग घनत्व की निर्भरता के दो प्रकार संभव हैं - यह सीधे आनुपातिक निर्भरता या व्युत्क्रमानुपाती निर्भरता है। सीधे आनुपातिक संबंध के साथ, पदार्थ की सांद्रता जितनी अधिक होगी, घोल का रंग घनत्व उतना ही अधिक होगा। व्युत्क्रमानुपाती संबंध में, किसी पदार्थ की सांद्रता जितनी अधिक होगी, घोल का रंग घनत्व उतना ही कम होगा। तकनीकी रूप से, यह इस तरह होता है: किसी पदार्थ की ज्ञात एकाग्रता के साथ कई समाधान लिए जाते हैं, इन समाधानों का घनत्व मापा जाता है, और रंग घनत्व पर एकाग्रता की निर्भरता का एक ग्राफ तैयार किया जाता है ( अंशांकन ग्राफ).

अगला, समाधान के रंग घनत्व को मापा जाता है, जिसकी एकाग्रता निर्धारित की जा रही है, और अंशांकन ग्राफ के अनुसार, समाधान के मापा रंग घनत्व के स्तर के अनुरूप एकाग्रता मूल्य पाया जाता है। स्वचालित रूप से होता है।

एंजाइम इम्युनोसे में, निम्नलिखित एंजाइमों का सबसे अधिक बार उपयोग किया जाता है: पेरोक्सीडेज, क्षारीय फॉस्फेट, एविडिन।

एंजाइम इम्युनोसे में प्रतिरक्षाविज्ञानी और एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं को कैसे जोड़ा जाता है? अब हम स्वयं एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख के विचार की ओर मुड़ते हैं। इसमें कौन से चरण शामिल हैं और इन प्रतिक्रियाओं के दौरान क्या होता है? एंजाइम इम्युनोसे है प्रत्यक्ष और अप्रत्यक्ष.

प्रत्यक्ष एंजाइम इम्युनोसे - कार्यान्वयन के चरण

एक प्रत्यक्ष एंजाइम इम्युनोसे में, एक विशिष्ट लेबल के साथ संयुक्त एंटीजन का पता लगाने के लिए एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है। यह विशिष्ट लेबल एंजाइमी प्रतिक्रिया का सब्सट्रेट है।

प्रतिजनों को कुएं की सतह से जोड़ना और प्रतिजन को प्रतिरक्षी से बांधना

प्रत्यक्ष एंजाइम इम्यूनोसे कैसे किया जाता है? जैविक सामग्री ली जाती है (रक्त, श्लेष्म झिल्ली से स्क्रैपिंग, स्मीयर) और विशेष कुओं में रखा जाता है। जैविक सामग्री को कुओं में 15-30 मिनट के लिए छोड़ दिया जाता है ताकि एंटीजन कुओं की सतह पर चिपक सकें। इसके अलावा, इन कुओं में पाए गए एंटीजन में एंटीबॉडी जोड़े जाते हैं। इसका मतलब यह है कि जब एंटीजन का पता लगाया जाता है, उदाहरण के लिए, सिफलिस, सिफलिस एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी जोड़े जाते हैं। ये एंटीबॉडी औद्योगिक रूप से उत्पादित होते हैं, और प्रयोगशालाएं तैयार किट खरीदती हैं। परीक्षण सामग्री और एंटीबॉडी का यह मिश्रण कुछ समय (30 मिनट से 4-5 घंटे तक) के लिए छोड़ दिया जाता है ताकि एंटीबॉडी "अपने" एंटीजन को ढूंढ सकें और बांध सकें। नमूना प्रतिजन, जितने अधिक एंटीबॉडी उन्हें बांधेंगे।

"अतिरिक्त" एंटीबॉडी को हटाना

जैसा कि संकेत दिया गया है, एंटीबॉडी भी एक विशिष्ट लेबल के साथ जुड़े हुए हैं। चूंकि एंटीबॉडी अधिक मात्रा में जोड़े जाते हैं, वे सभी एंटीजन से बंधे नहीं होंगे, और यदि नमूने में कोई एंटीजन नहीं है, तो तदनुसार, एक भी एंटीबॉडी बाध्य नहीं होगी वांछित प्रतिजन के लिए। "अतिरिक्त" एंटीबॉडी को हटाने के लिए, कुओं की सामग्री को बस डाला जाता है। नतीजतन, सभी "अतिरिक्त" एंटीबॉडी हटा दिए जाते हैं, और जो एंटीजन से संपर्क करते हैं वे बने रहते हैं, क्योंकि एंटीजन कुओं की सतह पर "चिपके" होते हैं। कुओं को एक विशेष समाधान के साथ कई बार धोया जाता है जो आपको सभी "अतिरिक्त" एंटीबॉडी को धोने की अनुमति देता है।

फिर दूसरा चरण शुरू होता है - एंजाइमी प्रतिक्रिया। एंजाइम के साथ घोल को धुले कुओं में मिलाया जाता है और 30-60 मिनट के लिए छोड़ दिया जाता है। इस एंजाइम में पदार्थ (विशिष्ट लेबल) के लिए एक आत्मीयता होती है जिससे एंटीबॉडी बंधे होते हैं। एंजाइम एक प्रतिक्रिया करता है, जिसके परिणामस्वरूप यह विशिष्ट लेबल (सब्सट्रेट) एक रंगीन पदार्थ (उत्पाद) में परिवर्तित हो जाता है। तब इस रंगीन पदार्थ की सांद्रता वर्णमिति द्वारा ज्ञात की जाती है। चूंकि यह विशिष्ट लेबल एंटीबॉडी से जुड़ा है, इसका मतलब है कि रंगीन प्रतिक्रिया उत्पाद की एकाग्रता एंटीबॉडी की एकाग्रता के बराबर है। और एंटीबॉडी की एकाग्रता एंटीजन की एकाग्रता के बराबर होती है। इस प्रकार, विश्लेषण के परिणामस्वरूप, हमें उत्तर मिलता है कि ज्ञात सूक्ष्म जीव या हार्मोन की एकाग्रता क्या है।

इस प्रकार प्रत्यक्ष एंजाइम इम्यूनोसे काम करता है। हालांकि, अप्रत्यक्ष एंजाइम इम्युनोसे का आज अधिक सामान्यतः उपयोग किया जाता है क्योंकि अप्रत्यक्ष की संवेदनशीलता और सटीकता प्रत्यक्ष की तुलना में अधिक है। तो, चलिए अप्रत्यक्ष एंजाइम इम्युनोसे पर चलते हैं।

अप्रत्यक्ष एंजाइम इम्युनोसे - चरण

अप्रत्यक्ष एंजाइम इम्युनोसे में दो चरण होते हैं। पहले चरण के दौरान, पता लगाए गए एंटीजन के लिए लेबल रहित एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, और दूसरे चरण में, लेबल किए गए एंटीबॉडी का उपयोग पहले लेबल रहित एंटीबॉडी के विरुद्ध किया जाता है। यही है, यह एंटीजन के लिए एंटीबॉडी का प्रत्यक्ष बंधन नहीं है, बल्कि एक दोहरा नियंत्रण है: एंटीजन के लिए एंटीबॉडी का बंधन, जिसके बाद एंटीबॉडी + एंटीजन कॉम्प्लेक्स के लिए दूसरे एंटीबॉडी का बंधन। एक नियम के रूप में, पहले चरण के लिए एंटीबॉडी माउस हैं, और दूसरे चरण के लिए बकरी।

कुएं की सतह पर प्रतिजनों का निर्धारण और प्रतिजन को लेबल रहित प्रतिरक्षी से बांधना
साथ ही प्रत्यक्ष एंजाइम इम्यूनोसे के लिए, जैविक सामग्री ली जाती है - रक्त, स्क्रैपिंग, स्मीयर। अध्ययन की गई जैविक सामग्री को कुओं में पेश किया जाता है और एंटीजन के लिए कुओं की सतह का पालन करने के लिए 15-30 मिनट के लिए छोड़ दिया जाता है। फिर, एंटीजन के लिए लेबल रहित एंटीबॉडी को कुओं में जोड़ा जाता है और कुछ समय (1-5 घंटे) के लिए छोड़ दिया जाता है ताकि एंटीबॉडी "उनके" एंटीजन से बंध जाएं और एक प्रतिरक्षा परिसर बना लें ( प्रथम चरण) उसके बाद, कुओं की सामग्री को बाहर निकालकर "अतिरिक्त", अनबाउंड एंटीबॉडी को हटा दिया जाता है। सभी अनबाउंड एंटीबॉडी को पूरी तरह से हटाने के लिए एक विशेष समाधान के साथ धुलाई की जाती है।

लेबल किए गए एंटीबॉडी को एंटीजन + बिना लेबल वाले एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स से बांधना
उसके बाद, दूसरा एंटीबॉडी लिया जाता है - लेबल किया जाता है, कुओं में जोड़ा जाता है और फिर थोड़ी देर के लिए छोड़ दिया जाता है - 15-30 मिनट ( दूसरा चरण) इस समय के दौरान, लेबल किए गए एंटीबॉडी पहले से बंधे होते हैं - लेबल नहीं होते हैं और एक जटिल - एंटीबॉडी + एंटीबॉडी + एंटीजन बनाते हैं। हालांकि, लेबल किए गए और बिना लेबल वाले दोनों एंटीबॉडी कुओं में अधिक मात्रा में जोड़े जाते हैं। इसलिए, "अतिरिक्त" को फिर से हटाना आवश्यक है, पहले से ही लेबल किए गए एंटीबॉडी जो बिना लेबल वाले एंटीबॉडी से बंधे नहीं थे। ऐसा करने के लिए, कुओं की सामग्री डालने और एक विशेष समाधान के साथ धोने की प्रक्रिया को दोहराएं।

एंजाइमी प्रतिक्रिया - एक रंगीन यौगिक का निर्माण
उसके बाद, एक एंजाइम पेश किया जाता है जो "लेबल" को एक रंगीन पदार्थ में बदलने की प्रतिक्रिया करता है। रंग 5-30 मिनट के भीतर विकसित हो जाता है। फिर वर्णमिति की जाती है और रंगीन पदार्थ की सांद्रता की गणना की जाती है। चूंकि रंगीन पदार्थ की सांद्रता लेबल किए गए एंटीबॉडी की एकाग्रता के बराबर होती है, और लेबल की एकाग्रता बिना लेबल वाले एंटीबॉडी की एकाग्रता के बराबर होती है, जो बदले में एंटीजन की एकाग्रता के बराबर होती है। इस प्रकार, हम ज्ञात एंटीजन की एकाग्रता प्राप्त करते हैं।
दो प्रकार के एंटीबॉडी के उपयोग के रूप में इस तरह के दोहरे नियंत्रण ने एंजाइम इम्यूनोएसे विधि की संवेदनशीलता और विशिष्टता को बढ़ाना संभव बना दिया। विश्लेषण के समय को लंबा करने और अतिरिक्त चरणों को शामिल करने के बावजूद, इन नुकसानों की भरपाई परिणाम की सटीकता से होती है। यही कारण है कि वर्तमान में एंजाइम इम्यूनोसे के विशाल बहुमत अप्रत्यक्ष एंजाइम इम्यूनोसे हैं।

एंजाइम इम्यूनोएसे द्वारा किन रोगों का पता लगाया जाता है?

आइए इस बात पर विचार करें कि एंजाइम इम्युनोसे द्वारा किन बीमारियों और जैविक रूप से सक्रिय पदार्थों का पता लगाया जाता है। एंजाइम इम्युनोसे द्वारा पता लगाए गए पदार्थ तालिका में प्रस्तुत किए गए हैं।

थायराइड रोग के हार्मोन और मार्कर	थायरोपरोक्सीडेज (टीपीओ)
	थायरोग्लोबुलिन (टीजी)
	थायराइड उत्तेजक हार्मोन (TSH)
	थायरोक्सिन (T4)
	ट्राईआयोडोथायरोनिन (T3)
	मुक्त थायरोक्सिन (T4)
	मुक्त ट्राईआयोडोथायरोनिन (T3)
प्रजनन कार्य का निदान	ल्यूटिनाइजिंग हार्मोन (एलएच)
	कूप उत्तेजक हार्मोन (FSH)
	प्रोलैक्टिन
	प्रोजेस्टेरोन
	एस्ट्राडियोल
	टेस्टोस्टेरोन
	कोर्टिसोल
	स्टेरॉयड बाइंडिंग ग्लोब्युलिन (SHB)
	अल्फाफेटोप्रोटीन (एएफपी)
ट्यूमर मार्कर्स	कोरियोनिक गोनाडोट्रोपिन (सीजी)
	प्रोस्टेट विशिष्ट प्रतिजन (PSA)
	एसए - 125
	एसए - 19.9
	सीवाईएफआरए-21-1
	एम -12 (एसए - 15.3)
	एमयूसी-1 (एम-22)
	एमयूसी1 (एम-20)
	एल्वोम्यूसीन
	के - चेन
	एल - चेन
	ट्यूमर परिगलन कारक (TNFα)
	- इंटरफेरॉन
	कैंसर-भ्रूण प्रतिजन (सीईए)
संक्रामक रोगों का निदान