एचआईवी के निदान में इम्यून ब्लॉटिंग। प्रतिरक्षा सोख्ता प्रतिरक्षा सोख्ता तंत्र व्यावहारिक उपयोग

इम्युनोब्लॉटिंग -(अंग्रेजी "ब्लॉट" से - स्पॉट) - ज्ञात सीरा (या एंटीजन) का उपयोग करके एंटीजन (या एंटीबॉडी) की पहचान करने की एक विधि। यह एलिसा के साथ जेल वैद्युतकणसंचलन का एक संयोजन है। प्रारंभ में, अल्ट्रासाउंड का उपयोग करके जीवाणु कोशिकाओं या विषाणुओं को नष्ट कर दिया जाता है, और फिर वायरस या जीवाणु कोशिकाओं के सभी एंटीजन को वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किया जाता है और एक विशेष नाइट्रोसेल्यूलोज फिल्म पर एक वाणिज्यिक अभिकर्मक प्राप्त किया जाता है। इम्युनोब्लॉटिंग की स्थापना करते समय, रोगी के सीरम को ज्ञात एंटीजन के साथ फिल्म पर लगाया जाता है। अनबाउंड एंटीबॉडी के ऊष्मायन और धोने के बाद, वे एलिसा के लिए आगे बढ़ते हैं - एक एंजाइम के साथ मानव इम्युनोग्लोबुलिन के लिए एक एंटीसेरम और एक क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट जो एंजाइम के साथ बातचीत करते समय रंग बदलता है, फिल्म पर लागू होता है। इम्युनोग्लोबुलिन-एंजाइम परिसरों में एंटीजन-एंटीबॉडी-एंटीसेरम की उपस्थिति में, वाहक पर रंगीन धब्बे दिखाई देते हैं। इम्युनोब्लॉटिंग की विधि आपको रोगज़नक़ के विभिन्न प्रतिजनों के लिए अलग से एंटीबॉडी का पता लगाने की अनुमति देती है (उदाहरण के लिए, एचआईवी संक्रमण में, इम्युनोब्लॉटिंग gp120, gp24 और वायरस के अन्य एंटीजन के लिए एंटीबॉडी का पता लगाता है)।

रेडियोइम्यूनोसे (आरआईए)

विधि एक रेडियोन्यूक्लाइड के साथ एंटीजन या एंटीबॉडी लेबल का उपयोग करके एंटीजन-एंटीबॉडी प्रतिक्रिया पर आधारित है। 125I, 14C, 3H, 51Cr और अन्य रेडियोन्यूक्लाइड एक लेबल के रूप में उपयोग किए जाते हैं। परिणामी प्रतिरक्षा परिसरों को सिस्टम से अलग कर दिया जाता है और उनकी रेडियोधर्मिता काउंटरों (β-विकिरण) पर निर्धारित की जाती है। विकिरण की तीव्रता बाध्य प्रतिजन और एंटीबॉडी अणुओं की संख्या के सीधे आनुपातिक है।

पॉलीस्टायर्न पैनल के कुओं में लेबल किए गए एंटीबॉडी या एंटीजन का उपयोग करते हुए एक व्यापक ठोस-चरण आरआईए संस्करण।

आरआईए का उपयोग रोगाणुओं, वायरस, विभिन्न हार्मोन, एंजाइम, औषधीय पदार्थ, इम्युनोग्लोबुलिन, साथ ही 10-12-10-15 ग्राम / एल की मामूली सांद्रता में परीक्षण सामग्री में निहित अन्य पदार्थों के एंटीजन का पता लगाने के लिए किया जाता है।

नियंत्रण प्रश्न

प्रतिरक्षा बैक्टीरियोलिसिस प्रतिक्रिया: यह प्रतिक्रिया क्या है; एंटीजन क्या है, एंटीबॉडी क्या है, प्रतिक्रिया तंत्र, सेटिंग के तरीके, व्यावहारिक अनुप्रयोग। प्रतिरक्षा हेमोलिसिस प्रतिक्रिया: आवश्यक सामग्री, सेटिंग की विधि; नियंत्रण, व्यावहारिक अनुप्रयोग। जेल में स्थानीय हेमोलिसिस की प्रतिक्रिया (जर्न प्रतिक्रिया): प्रतिक्रिया का सिद्धांत, सेटिंग की विधि, व्यावहारिक अनुप्रयोग। पूरक बाध्यकारी प्रतिक्रिया: प्रतिक्रिया का सिद्धांत; जब प्रतिरक्षा सीरम एक विशिष्ट प्रतिजन के साथ परस्पर क्रिया करता है तो क्या बनता है; यदि पूरक इस अंतःक्रिया के दौरान मौजूद है तो उसका क्या होगा? यदि प्रतिजन और प्रतिरक्षी के बीच कोई विशिष्ट आत्मीयता नहीं है तो पूरक का भाग्य क्या है? पूरक के साथ क्या हुआ यह निर्धारित करने के लिए किस प्रतिक्रिया का उपयोग किया जा सकता है; इस विशेष प्रतिक्रिया का उपयोग क्यों किया जाता है; आरएसके का स्पष्ट सकारात्मक परिणाम क्या है? क्यों? सीबीसी के पहले चरण में पूरक के किस गुण का उपयोग किया जाता है? दूसरे चरण में? यदि सीएससी का अंतिम परिणाम हेमोलिसिस है, तो इसका क्या अर्थ है - सकारात्मक या नकारात्मक? परिणामों की व्याख्या करें: आरएसके + + + +, आरएसके + + +, आरएसके + +, आरएसके +। पहली आरएससी प्रणाली के अवयवों और दूसरे आरएससी प्रणाली के अवयवों के नाम बताइए। परीक्षण सीरम को निष्क्रिय करने की आवश्यकता क्यों है? पूरक शीर्षक कैसे दिया जाता है? हेमोलिटिक सीरम: इसमें क्या होता है, इसे कैसे प्राप्त किया जाता है, टिटर क्या है और यह कैसे निर्धारित किया जाता है? आरएसी घटक प्राप्त करने के लिए किन जानवरों का उपयोग किया जाता है? ठंड में आरएससी स्थापित करने की पद्धति। सूचीबद्ध प्रतिक्रियाओं में से कौन सा मंचन करते समय, पूरक की भागीदारी आवश्यक है: वर्षा, फ्लोक्यूलेशन, एग्लूटिनेशन, अपूर्ण एंटीबॉडी का पता लगाना, प्रतिरक्षा बैक्टीरियोलिसिस, प्रतिरक्षा हेमोलिसिस, यर्न, सीएससी? इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रतिक्रिया (आरआईएफ) - प्रत्यक्ष कून प्रतिक्रिया में घटनाओं के अनुक्रम को इंगित करें; आवश्यक सामग्री। प्रतिजन क्या होता है, प्रतिरक्षी क्या होता है, प्रतिरक्षी का लेबल क्या होता है, अभिक्रिया के परिणाम को कैसे ध्यान में रखा जाता है, सकारात्मक परिणाम कैसा दिखता है? व्यावहारिक अनुप्रयोग - इस प्रतिक्रिया से क्या निर्धारित किया जा सकता है? अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रतिक्रिया - इस प्रतिक्रिया के लिए घटनाओं के अनुक्रम को इंगित करें, आवश्यक सामग्री, एंटीजन क्या है, जो प्रतिरक्षा सीरा का उपयोग किया जाता है; प्रायोगिक उपयोग; प्रत्यक्ष प्रतिक्रिया पर अप्रत्यक्ष RIF का लाभ। एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) - प्रतिक्रिया का सिद्धांत; आवश्यक सामग्री; परीक्षण सामग्री में एंटीजन का पता लगाने के लिए प्रतिक्रिया का मंचन करते समय घटनाओं के क्रम को इंगित करें; आवश्यक सामग्री; सकारात्मक परिणाम के साथ क्या होता है, यह कैसा दिखता है? परीक्षण सीरम में एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए एलिसा सेट करते समय क्रियाओं का क्रम निर्दिष्ट करें; आवश्यक सामग्री; क्या होगा यदि परिणाम सकारात्मक है? इम्युनोब्लॉटिंग - प्रतिक्रिया का सिद्धांत; मुख्य कदम; आवश्यक सामग्री; परिणाम को कैसे ध्यान में रखा जाता है; प्रतिक्रिया के लाभ। Radioimmunoassay (RIA) - प्रतिक्रिया के मुख्य चरण क्या हैं; एंटीबॉडी या एंटीजन किसके साथ लेबल किए जाते हैं, परिणाम को कैसे ध्यान में रखा जाता है? इम्यूनोइलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी - विधि का सिद्धांत; मुख्य कदम; आवश्यक सामग्री; किस एंटीबॉडी के साथ लेबल किया गया है; प्रतिक्रिया के परिणाम को कैसे ध्यान में रखा जाता है। स्थिरीकरण प्रतिक्रियाएं - विधि का सिद्धांत, सेटिंग की तकनीक, घटक, परिणामों का लेखा-जोखा।

स्व-अध्ययन प्रक्रिया में पूरा करने के लिए कार्य।

इस विषय में शामिल प्रतिक्रियाओं के लिए प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया तालिका को पूरा करें।

प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया

छात्र एक व्यावहारिक पाठ में काम करता है

आरएसके के पहले चरण की सेटिंग के साथ तुरंत काम शुरू करें, लेकिन बाद में इसे नोटबुक में लिख लें (नीचे देखें)।

1. प्रतिरक्षा हेमोलिसिस की प्रतिक्रिया। प्रतिरक्षा हेमोलिसिस की एक प्रदर्शन प्रतिक्रिया देखें, एक आरेख के रूप में स्केच करें, एक प्रयोगात्मक और नियंत्रण परीक्षण ट्यूबों में परिणाम की व्याख्या करें।

2. बाध्यकारी पूरक की प्रतिक्रिया

ए) तालिका के अनुसार आरएसके को अलग करें;

बी) एक नोटबुक में तालिका के रूप में डीएससी स्थापित करने की योजना बनाएं;

ग) डीएससी के दूसरे चरण पर रखें (पहला चरण पाठ की शुरुआत में रखा गया है);

डी) आरएसी के लिए आवश्यक नैदानिक ​​उत्पादों को अलग करना;

ई) परिणाम को ध्यान में रखें। अध्ययन किए गए सीरम में विशिष्ट एंटीबॉडी की उपस्थिति के बारे में एक निष्कर्ष तैयार करें।

3. इम्यूनोफ्लोरेसेंस की प्रतिक्रिया। तालिका का अध्ययन करें, एक नोटबुक में प्रतिक्रिया स्थापित करने के लिए एक योजना तैयार करें; डायग्नोस्टिक सीरा देखें; निर्धारित करें कि मट्ठा में क्या है, इसे कैसे तैयार किया जाता है, जिसके लिए प्रतिक्रिया (प्रत्यक्ष या अप्रत्यक्ष आरआईएफ) का उपयोग किया जाता है। एक फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोप में डेमो आरआईएफ परिणाम देखें।

4. एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा)। एक नोटबुक में, दो संस्करणों में प्रतिक्रिया के मंचन के लिए एक योजना तैयार करें: परीक्षण सामग्री में एंटीजन का पता लगाने के लिए और सीरम में एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए। एचआईवी और हेपेटाइटिस बी डायग्नोस्टिक टूलकिट की समीक्षा करें। निर्धारित करें कि प्रत्येक घटक में क्या है और इसका उपयोग किस लिए किया जाता है।

5. इम्यूनोब्लॉटिंग। एक नोटबुक में प्रतिक्रिया के मंचन के लिए एक योजना बनाएं; डेमो देखें - प्रतिक्रिया का परिणाम।

6. रेडियोइम्यूनोसे (आरआईए)। एक नोटबुक में प्रतिक्रिया की योजना बनाएं।

7. इम्यून इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (आईईएम)। प्रदर्शन देखें - प्रतिक्रिया का परिणाम, एक नोटबुक में प्रतिक्रिया योजना तैयार करें, तीर के साथ एंटीजन (वायरस) और लेबल एंटीबॉडी को इंगित करें।

इम्युनोब्लॉटिंग वैद्युतकणसंचलन और एलिसा या आरआईए के संयोजन के आधार पर प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील तरीका है। इम्यूनोब्लॉटिंग का उपयोग एचआईवी संक्रमण आदि के निदान के लिए किया जाता है।

एक सामान्य अर्थ में, इम्युनोब्लॉटिंग को एक ठोस समर्थन-झिल्ली में स्थानांतरित प्रोटीन के मिश्रण के विश्लेषण के रूप में समझा जाता है, जिससे वे सहसंयोजक बंधों द्वारा बंधते हैं, बाद में प्रतिरक्षण के साथ।

एक सब्सट्रेट पर सीधे लागू प्रोटीन के मिश्रण का विश्लेषण करना संभव है - डॉट ब्लॉट विश्लेषण - या इलेक्ट्रोफोकसिंग, डिस्क वैद्युतकणसंचलन या द्वि-आयामी वैद्युतकणसंचलन - पश्चिमी सोख्ता के तरीकों द्वारा इसके प्रारंभिक विभाजन के बाद।

रोगज़नक़ प्रतिजनों को पॉलीएक्रिलामाइड जेल में वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किया जाता है, फिर जेल से सक्रिय कागज या नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित किया जाता है और एलिसा का उपयोग करके विकसित किया जाता है।

फर्म ऐसे एंटीजन ब्लॉटेड स्ट्रिप्स का उत्पादन करती हैं। इन पट्टियों पर रोगी का सीरम लगाया जाता है। . फिर, ऊष्मायन के बाद, रोगी के अनबाउंड एंटीबॉडी को धोया जाता है और एंजाइम के साथ लेबल किए गए मानव इम्युनोग्लोबुलिन के खिलाफ सीरम लगाया जाता है। . स्ट्रिप पर बनने वाले कॉम्प्लेक्स (एंटीजन + रोगी की एंटीबॉडी + मानव आईजी के खिलाफ एंटीबॉडी) का पता एक क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट जोड़कर लगाया जाता है जो एक एंजाइम की क्रिया के तहत रंग बदलता है।

इस पद्धति का उपयोग लक्ष्य क्लोन जीन के उत्पादों को व्यक्त करने वाले बैक्टीरिया, फेज या वायरस के क्लोन के चयन के लिए भी किया जाता है।

झिल्ली में प्रोटीन का स्थानांतरण या तो निष्क्रिय रूप से या इलेक्ट्रोट्रांसफर उपकरण का उपयोग करके किया जाता है। प्रोटीन को झिल्ली में स्थानांतरित करने की दक्षता कई कारकों से प्रभावित होती है, जैसे कि प्रोटीन का आणविक भार, जेल की सरंध्रता, स्थानांतरण समय और उपयोग किए गए बफर समाधान (ट्रांस-बफर) की संरचना।

प्रयोग के कार्यों और शर्तों के आधार पर, स्थानांतरण शर्तों का चयन किया जाता है जो सर्वोत्तम परिणाम प्रदान करते हैं। नाइट्रोसेल्यूलोज, पॉलीविनाइलिडिन डिफ़्लुओराइड (PVDF), या सकारात्मक रूप से चार्ज किए गए नायलॉन झिल्ली को आमतौर पर सब्सट्रेट के रूप में उपयोग किया जाता है। नाइट्रोसेल्यूलोज 80 - 100 माइक्रोग्राम प्रोटीन प्रति 1 सेमी2 तक बांध सकता है।

कम आणविक भार वाले प्रोटीन (20 केडीए से कम आणविक भार के साथ) धोने के परिणामस्वरूप खो सकते हैं, और संबंधित प्रतिबंध डीएनए टुकड़ों की लंबाई के साथ कुछ आनुवंशिक लोकी के बहुरूपता की प्रारंभिक जांच करना संभव है।

इसके अलावा, दक्षिणी संकरण का उपयोग करके, कोई भी आसानी से पता लगा सकता है कि लक्ष्य जीन के आंतरिक भाग में एक निश्चित प्रतिबंध एंजाइम द्वारा हाइड्रोलिसिस की साइट है, जो जीनोम के अध्ययन क्षेत्र के क्लोनिंग के लिए इष्टतम रणनीति चुनने की अनुमति देता है।

इसी तरह की योजना का उपयोग करके आरएनए अणुओं को एक agarose जेल से नाइट्रोसेल्यूलोज फिल्टर में भी स्थानांतरित किया जा सकता है। दक्षिणी सोख्ता के विपरीत इस विधि को उत्तरी सोख्ता कहा गया है, क्योंकि अंग्रेजी में दक्षिणी नाम का अर्थ "दक्षिणी" है।

जेल से फिल्टर पर प्रोटीन के स्थानांतरण को उचित रूप से वेस्टर्न ब्लॉटिंग कहा जाता था। सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) समाधान में विकृत बड़े प्रोटीन (१०० केडीए से अधिक) को खराब रूप से झिल्ली में स्थानांतरित किया जा सकता है यदि इथेनॉल ट्रांस बफर में मौजूद है। अल्कोहल एसडीएस-पॉलीएक्रिलामाइड जेल से प्रोटीन के स्थानांतरण में काफी सुधार करता है, लेकिन जेल में छिद्रों को संकरा कर देता है, जिससे बड़े प्रोटीन की अवधारण होती है।

PVDF झिल्ली प्रतिरक्षण के लिए अनुकूलित है और बहुत कम स्तर के गैर-विशिष्ट बंधन के साथ 160 μg / cm2 तक विशेष रूप से बाध्य प्रोटीन को बनाए रखने में सक्षम है।

immunoblotting

इस झिल्ली का एक महत्वपूर्ण गुण इसकी पुन: प्रयोज्यता है। Zeta-Probe नायलॉन झिल्ली शराब की अनुपस्थिति में एसडीएस प्रोटीन को प्रभावी ढंग से बांधती है, और यह बंधन बाद के उपचारों के लिए प्रतिरोधी है। कम आणविक भार प्रोटीन भी प्रभावी ढंग से बनाए रखा जाता है। उनकी उच्च बाध्यकारी क्षमता के कारण - लगभग 480 μg प्रोटीन प्रति 1 सेमी2 - Zeta-Probe झिल्ली विश्लेषण किए गए मिश्रणों में प्रोटीन की ट्रेस मात्रा का पता लगाने की अनुमति देती है।

झिल्ली पर एंटीजन के स्थिर होने के बाद, शेष बाध्यकारी साइटों को जिलेटिन, या गोजातीय सीरम एल्ब्यूमिन, या स्किम दूध के घोल से अवरुद्ध कर दिया जाता है।

फिर झिल्ली को अध्ययन के तहत प्रतिजन के लिए पॉलीक्लोनल या मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के घोल में इनक्यूबेट किया जाता है। अनबाउंड एंटीबॉडी को धोने के बाद, झिल्ली को द्वितीयक एंटीबॉडी के घोल में डाला जाता है, जो एंटी-प्रजाति एंटीबॉडी (एक खरगोश, माउस के इम्युनोग्लोबुलिन के लिए बकरी एंटीबॉडी) के साथ एंजाइम क्षारीय फॉस्फेट (एपी) या हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज (एचआरपी) का एक संयुग्म है। , या मानव) (स्टैफिलोकोकस ऑरियस प्रोटीन) या जी (स्ट्रेप्टोकोकस एसपी प्रोटीन), जो इम्युनोग्लोबुलिन के एफसी क्षेत्र के लिए उच्च आत्मीयता रखते हैं।

गठित प्रतिरक्षा परिसरों का पता लगाना एक रासायनिक या रसायनयुक्त विधि द्वारा किया जाता है। क्षारीय फॉस्फेट संयुग्मों का उपयोग करते समय रासायनिक प्रतिक्रिया के लिए सब्सट्रेट 5-ब्रोमो-4-क्लोरो-3-इंडोलिल फॉस्फेट (बीसीआईपी) या टेट्राजोलियम ब्लू (एनबीटी) होते हैं, और जब हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज संयुग्म का उपयोग किया जाता है, तो 4-क्लोरो-1-नेफ्थॉल और हाइड्रोजन पेरोक्साइड।

एंजाइमी प्रतिक्रियाओं के परिणामस्वरूप, एंटीजन-एंटीबॉडी कॉम्प्लेक्स के स्थानीयकरण के स्थल पर झिल्ली पर एक रंगीन पट्टी या स्पॉट बनता है।

इस विधि की संवेदनशीलता एआर संयुग्मों का उपयोग करते समय १०० स्नातकोत्तर प्रोटीन और एचआरपी संयुग्मों का उपयोग करते समय १००-५०० स्नातकोत्तर है। प्रतिरक्षा परिसरों की केमिलुमिनेसेंट का पता लगाने से एंटीजन के 5 पीजी से कम के निर्धारण की अनुमति मिलती है। इस पद्धति का सिद्धांत यह है कि जब एचआरपी हाइड्रोजन पेरोक्साइड और चक्रीय डायसीलहाइड्राजाइन ल्यूमिनॉल के साथ प्रतिक्रिया करता है, तो प्रकाश 428 एनएम की तरंग दैर्ध्य के साथ उत्सर्जित होता है, जिसे एक प्रकाश संवेदनशील फिल्म पर तय किया जा सकता है।

इम्युनोब्लॉटिंग (आरआई) की प्रतिक्रिया एलिसा के आधार पर विकसित की गई थी। यह इम्यूनोकेमिकल विश्लेषण का सबसे विशिष्ट और संवेदनशील तरीका है। इम्युनोब्लॉटिंग (अंग्रेजी ब्लॉट से - गीला हो जाओ, दाग) एलिसा को वैद्युतकणसंचलन के साथ जोड़ती है। इसका उपयोग एचआईवी के लिए जटिल एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए नहीं किया जाता है, बल्कि इसके व्यक्तिगत संरचनात्मक प्रोटीन (प्रोटीन-पी 24, ग्लाइकोप्रोटीन-जीपी120, जीपी 41, आदि) के एंटीबॉडी का पता लगाने के लिए किया जाता है। एचआईवी संक्रमण के निदान में विशेषज्ञ (पुष्टिकरण) प्रतिक्रियाओं को संदर्भित करता है।

प्रतिक्रिया कई चरणों में की जाती है:

वायरस घटकों में नष्ट हो जाता है - एंटीजन (p24, gp120, gp 41, आदि), जो पॉलीएक्रिलामाइड जेल में वैद्युतकणसंचलन के अधीन होते हैं, अर्थात आणविक भार द्वारा एंटीजन को अंशों में अलग करना।

2. जेल एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली से ढका होता है और वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके एंटीजन अंशों को इसमें स्थानांतरित किया जाता है। नाइट्रोसेल्यूलोज ब्लॉटिंग पेपर की तरह व्यवहार करता है। झिल्ली को स्ट्रिप्स (स्ट्रिप्स) में काट दिया जाता है। फर्म ऐसे एंटीजन ब्लॉटेड स्ट्रिप्स का उत्पादन करती हैं।

इम्युनोब्लॉटिंग - एक अतिरिक्त अप्रत्यक्ष विधि

उस पर लगाए गए एचआईवी एंटीजन के साथ स्ट्रिप्स को विषय के सीरम में डुबोया जाता है और फिर अनबाउंड सामग्री से धोया जाता है।

4. स्ट्रिप्स को पेरोक्सीडेज-लेबल वाले एंटीग्लोबुलिन सीरम के साथ इनक्यूबेट किया जाता है और धोया जाता है।

सब्सट्रेट जोड़ें और एजी-एटी कॉम्प्लेक्स के स्थानीयकरण क्षेत्र के अनुरूप रंगीन अंशों (धब्बों) की संख्या नोट करें।

पट्टी के कुछ हिस्सों में बैंड की उपस्थिति अध्ययन किए गए सीरम में सख्ती से परिभाषित एचआईवी एंटीजन के एंटीबॉडी की उपस्थिति की पुष्टि करती है। इम्युनोब्लॉटिंग के परिणाम को सकारात्मक माना जाता है यदि तीन एचआईवी एंटीजन - p24, gp41 और gp 120 (चित्र। 37) में से किसी दो के अनुरूप झिल्ली पर बैंड दिखाई दे रहे हैं।

चित्र

प्रयुक्त साहित्य की सूची

मुख्य साहित्य

मेडिकल माइक्रोबायोलॉजी, वायरोलॉजी और इम्यूनोलॉजी: मेडिकल छात्रों के लिए एक पाठ्यपुस्तक। विश्वविद्यालय दूसरा संस्करण।, रेव। और जोड़। - 702 पी। ईडी। ए.ए. वोरोब्योव। एम.: एमआईए, 2012।

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इम्युनोब्लॉट - यह क्या है? संक्रामक रोगों के निदान में इम्युनोब्लॉट

इम्युनोब्लॉट क्या है? मानव वायरल संक्रमण के प्रयोगशाला निदान के लिए यह एक सामान्य तरीका है। यह एचआईवी की उपस्थिति का पता लगाने के सबसे सटीक और विश्वसनीय तरीकों में से एक है।

विश्वसनीयता के लिए, यह एक एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) से भी बड़ा है। इम्युनोब्लॉट परिणामों को असंगत और निश्चित माना जाता है।

इम्युनोब्लॉट - यह क्या है? किसी व्यक्ति को एचआईवी के रूप में पहचानने के लिए, आपको रक्त सीरम में एंटीबॉडी की उपस्थिति के लिए एक प्रयोगशाला परीक्षण से गुजरना होगा।

पश्चिमी धब्बा विधि को पश्चिमी धब्बा (पश्चिमी धब्बा) भी कहा जाता है। इसका उपयोग एक पूरक विशेषज्ञ विधि के रूप में मानव वायरल संक्रमण का पता लगाने के लिए किया जाता है। एलिसा की पुष्टि करने के लिए यह आवश्यक है - एक प्रयोगशाला परीक्षण जो आपको रक्त में एचआईवी के प्रति एंटीबॉडी की उपस्थिति निर्धारित करने की अनुमति देता है। सकारात्मक एलिसा की दोबारा जांच करने के लिए इम्युनोब्लॉट।

इसे सबसे संवेदनशील, जटिल और महंगा माना जाता है।

लक्ष्य

इम्युनोब्लॉट क्या है? यह वायरस के प्रति एंटीबॉडी की उपस्थिति के लिए रक्त सीरम के प्रयोगशाला परीक्षणों की एक तकनीक है।

विशेष अध्ययन के दौरान, जेल में और नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर कुल वायरल प्रोटीन।

इम्युनोब्लॉटिंग (रोगजनकों के कुछ एंटीजन के रोगियों के सीरा में एंटीबॉडी का पता लगाना)

वर्गों के पश्चिमी सोख्ता की प्रक्रिया विभिन्न चरणों में एचआईवी संक्रमण के निर्धारण के लिए अभिप्रेत है। पहले चरण में, इसके घटक भागों से शुद्ध किए गए वायरस को वैद्युतकणसंचलन के अधीन किया जाता है और इसमें शामिल एंटीजन को आणविक भार से विभाजित किया जाता है।

मानव इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस जीवित कोशिकाओं में गुणा करता है, इसकी आनुवंशिक जानकारी में अंतर्निहित होता है। इस स्तर पर, यदि आप संक्रमित हो गए हैं तो व्यक्ति एचआईवी वायरस का वाहक बन जाता है।

इस रोग की विशेषता यह है कि यह अधिक समय तक प्रकट नहीं होता है। वायरस लिम्फोसाइटों को नष्ट कर देता है, इस प्रकार, एक व्यक्ति की प्रतिरक्षा कम हो जाती है और शरीर संक्रमण से लड़ने में असमर्थ हो जाता है।

यदि एचआईवी का सही ढंग से और समय पर इलाज किया जाता है, तो रोगी एक परिपक्व वृद्धावस्था तक जीवित रहेगा। उपचार के अभाव में अनिवार्य रूप से मृत्यु हो जाती है। संक्रमण के क्षण से, लेकिन उपचार के बिना, अधिकतम अवधि दस वर्ष से अधिक नहीं है।

peculiarities

इम्युनोब्लॉट विश्लेषण एक विश्वसनीय तरीका है जो आपको पहले और दूसरे प्रकार के एचआईवी एंटीजन के लिए एंटीबॉडी की उपस्थिति निर्धारित करने की अनुमति देता है।

यदि कोई व्यक्ति संक्रमित है, तो दो सप्ताह के बाद एंटीबॉडी का पता बहुत बाद में लगाया जा सकता है। एचआईवी की एक विशेषता यह है कि एंटीबॉडी की मात्रा तेजी से बढ़ती है और रोगी के रक्त में रहती है। यदि वे मौजूद भी हों, तो भी यह रोग दो या अधिक वर्षों तक किसी भी रूप में प्रकट नहीं हो सकता है। एलिसा विधि हमेशा रोग की उपस्थिति को सटीक रूप से इंगित नहीं करती है, यदि एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख ने सकारात्मक परिणाम दिखाया है, तो पीसीआर और पश्चिमी धब्बा वर्गों से परिणामों की पुष्टि की आवश्यकता होती है।

के लिए संकेत

किस प्रकार का "इम्युनोब्लॉट" पहले ही पता लगाया जा चुका है, लेकिन अध्ययन में किसका परिचय दिया गया है?

मानव इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) इम्युनोब्लॉट के परीक्षण का कारण सकारात्मक एलिसा परिणाम होगा। जिन रोगियों की सर्जरी होनी है, उनके लिए एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख से गुजरना आवश्यक है। इसके अलावा, आपको गर्भावस्था की योजना बनाने वाली महिलाओं के साथ-साथ उन महिलाओं का भी विश्लेषण करना चाहिए जो एक कामुक यौन जीवन जीती हैं। यदि एलिसा के परिणाम समान हैं, तो एचआईवी संक्रमण वाले रोगियों के लिए पश्चिमी धब्बा अनुभाग निर्धारित किए जाते हैं।

डॉक्टर के पास जाने का कारण निम्नलिखित खतरनाक लक्षण हो सकते हैं: तेजी से वजन कम होना; कमजोरी, कार्य की हानि; आंत्र विकार (दस्त), जो तीन सप्ताह तक रहता है; निर्जलीकरण; बुखार; शरीर में सूजन लिम्फ नोड्स; कैंडिडिआसिस का विकास, तपेदिक, निमोनिया, टोक्सोप्लाज्मोसिस, दाद का तेज होना।

रोगी को शिरापरक रक्त दान करने से पहले तैयारी करने की आवश्यकता नहीं होती है।

परीक्षण से 8-10 घंटे पहले न खाएं। रक्तदान करने से एक दिन पहले शराब और कॉफी पीने, कठिन व्यायाम करने या चिंता का अनुभव करने की अनुशंसा नहीं की जाती है।

विश्लेषण कहां करना है?

मैं एचआईवी के लिए कहां जांच करवा सकता हूं?

एलिसा, शहरी निजी क्लीनिकों में किए गए इम्युनोब्लॉट विश्लेषण, परिणाम दिन के दौरान दिए जाते हैं। तत्काल निदान भी संभव है। सार्वजनिक संस्थानों में, रूसी संघ के कानून के अनुसार, चिकित्सा परीक्षण एलिसा और पश्चिमी धब्बा अनुभाग नि: शुल्क हैं।

गर्भवती महिलाओं के संक्रामक रोगों और अस्पताल में भर्ती या सर्जरी की आवश्यकता वाले रोगियों के लिए अनिवार्य जांच। यह अध्ययन कैसे किया जाता है?

एलिसा कैसे करें? एक सकारात्मक / नकारात्मक इम्युनोब्लॉट एलिसा परिणामों की पुष्टि या खंडन करता है। प्रक्रिया काफी सरल है। विशेषज्ञ शिरापरक रक्त का संग्रह करता है, समय में इसमें पांच मिनट से भी कम समय लगता है।

नमूना लेने के बाद, इंजेक्शन साइट को कीटाणुरहित किया जाना चाहिए और एक प्लास्टर के साथ सील कर दिया जाना चाहिए। नमूना खाली पेट किया जाता है, इसलिए प्रक्रिया के बाद डार्क चॉकलेट या मीठा गर्म पेय खाने से कोई दिक्कत नहीं होगी।

किसी सार्वजनिक स्वास्थ्य सुविधा केंद्र में नि:शुल्क परीक्षण के लिए रेफ़रल प्राप्त करने के लिए, आपको एक चिकित्सक को अवश्य दिखाना चाहिए।

सामान्य तौर पर, इम्युनोब्लॉट अन्य रक्त नमूनाकरण परीक्षणों से भिन्न नहीं होता है। अनुसंधान पद्धति सरल है। यदि किसी व्यक्ति के रक्त में कोई वायरस मौजूद है, तो शरीर उसे नष्ट करने के लिए एंटीबॉडी का उत्पादन करना शुरू कर देता है। प्रत्येक वायरस के लिए कई प्रोटीन एंटीजन होते हैं। इन एंटीबॉडी का पता लगाना वेस्टर्न ब्लॉट सेक्शन विधि का आधार है। कीमत

कितना विश्लेषण? इम्यूनोब्लॉट एचआईवी सस्ते शोध को संदर्भित करता है।

औसतन, स्क्रीनिंग इम्युनोसे के तरीके 500 से 900 रूबल तक होते हैं। पश्चिमी धब्बा अनुभाग एक अध्ययन जांच है, जिसकी लागत तीन से पांच हजार रूबल तक होती है। अधिक जटिल तरीके बहुत अधिक महंगे हैं। उदाहरण के लिए, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) के विश्लेषण के लिए, आपको लगभग 12,000 रूबल का भुगतान करना होगा।

परिणामों की व्याख्या

एचआईवी संक्रमण के निदान के लिए सबसे आम तरीके एंजाइम इम्युनोसे और इम्युनोब्लॉट हैं।

उनका उपयोग सीरम में मानव इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस के प्रति एंटीबॉडी का निर्धारण करने के लिए किया जाता है। संक्रमण की पुष्टि आमतौर पर दो परीक्षणों द्वारा की जाती है: स्क्रीनिंग और पुष्टिकरण। परिणामों की व्याख्या डॉक्टर द्वारा की जानी चाहिए, वह निदान करता है और उपचार निर्धारित करता है। यदि इम्युनोब्लॉट सकारात्मक है, तो इसका मतलब है कि मानव शरीर में एक वायरस है।

सकारात्मक परिणाम स्व-उपचार का कारण नहीं होना चाहिए, क्योंकि प्रत्येक रोगी के पास रोग की अपनी तस्वीर हो सकती है।

गुणात्मक विश्लेषण में स्क्रीनिंग और प्रमाणन शामिल हैं। यदि रोगी में कोई वायरस नहीं पाया जाता है, तो परिणाम नकारात्मक होता है। जब यह प्रमाणपत्र मिल जाता है, तो अतिरिक्त स्क्रीनिंग टेस्ट किए जाते हैं। इम्युनोब्लॉट विश्लेषण जो स्क्रीनिंग की पुष्टि या खंडन करता है। यदि परीक्षण स्ट्रिप्स अंधेरे (प्रोटीन स्थानीयकरण) के कुछ क्षेत्रों में दिखाई देते हैं, तो एचआईवी का निदान किया जाता है।

यदि परिणाम संदिग्ध हैं, तो परीक्षण तीन महीने के भीतर किए जाते हैं।

मानव इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस से संक्रमण को रोकने के लिए, यह संभव है यदि आप कुछ नियमों का पालन करते हैं: आकस्मिक संभोग से बचें, संपर्क में कंडोम का उपयोग करें, दवाओं का उपयोग न करें।

यदि एक गर्भवती महिला में बीमारी का पता चला है, तो उपस्थित चिकित्सक की सिफारिशों का पालन करना महत्वपूर्ण है, वायरस की उपस्थिति के लिए परीक्षणों के बारे में नहीं भूलना चाहिए।

वेस्टर्न ब्लॉटिंग क्या है?

जटिल मिश्रण या विभिन्न ऊतकों के अर्क में प्रोटीन की पहचान सबसे आम कार्यों में से एक है। विशिष्ट एंटीबॉडी के रूप में इस तरह के एक उपकरण का उपयोग करके, कम से कम समय और लागत के साथ अध्ययन के तहत प्रोटीन की पहचान करना संभव है।

पश्चिमी सोख्ता विधि में, पहले चरण में, सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) की उपस्थिति में वैद्युतकणसंचलन द्वारा प्रोटीन के मिश्रण को अलग किया जाता है, और फिर इलेक्ट्रोब्लॉटिंग द्वारा नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित किया जाता है।

इस विधि का सार यह है कि वैद्युतकणसंचलन के बाद जेल को फिल्टर पेपर की परतों के बीच एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर रखा जाता है। इस तरह से इकट्ठे किए गए "सैंडविच" को एक विद्युत क्षेत्र में रखा जाता है ताकि प्रोटीन-एसडीएस कॉम्प्लेक्स जेल प्लेट में चले जाएं और नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली की सतह पर स्थिर हो जाएं (गैर-विशिष्ट सोरेशन के परिणामस्वरूप)।

नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली के साथ प्रोटीन-एसडीएस कॉम्प्लेक्स के बंधन में, मुख्य रूप से विद्युत बल शामिल होते हैं, और यह बातचीत कई गुना होती है और झिल्ली की सतह पर प्रोटीन के "फैलने" की ओर ले जाती है। इस प्रकार, इलेक्ट्रोट्रांसफर के बाद, हमें नाइट्रोसेल्यूलोज पर एक जेल की प्रतिकृति मिलती है जिसमें प्रोटीन उसी तरह व्यवस्थित होता है जैसे पॉलीएक्रिलामाइड जेल में होता है।

एसडीएस के बाद - वैद्युतकणसंचलन, इलेक्ट्रोट्रांसफर और एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर जेल से प्रोटीन का शर्बत, प्रोटीन की तृतीयक संरचना बहुत बदल जाती है, अगर इस तरह के कठोर उपचार के बाद प्रोटीन के लिए तृतीयक संरचना के अस्तित्व के बारे में बात करना आम तौर पर सही है। . इसलिए, अध्ययन के तहत प्रोटीन के इम्यूनोकेमिकल का पता लगाने के लिए, आमतौर पर प्रोटीन अणु के रैखिक क्षेत्रों के लिए विशिष्ट मोनो- या पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है।

51. इम्यूनोसे, इम्युनोब्लॉटिंग। तंत्र, घटक, अनुप्रयोग।

कंफर्मेशनल एपिटोप्स (या ऐसे क्षेत्र जिनमें इंटरसबयूनिट कॉन्टैक्ट्स शामिल हैं) के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी आमतौर पर वेस्टर्न ब्लॉटिंग में उपयोग के लिए उपयुक्त नहीं होते हैं।

प्रोटीन के हस्तांतरण के बाद, झिल्ली को अध्ययन के तहत प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ क्रमिक रूप से ऊष्मायन किया जाता है, और फिर द्वितीयक एंटीबॉडी के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी के एफसी टुकड़ों के लिए एक एंजाइम (या कुछ अन्य) लेबल (छवि 1 ए) के साथ संयुग्मित होता है।

1 ए)। मामले में जब अध्ययन किए गए प्रतिजन के लिए विशिष्ट प्राथमिक एंटीबॉडी सीधे लेबल से संयुग्मित होते हैं, तो द्वितीयक एंटीबॉडी की आवश्यकता नहीं होती है (चित्र 1 बी)। अध्ययन के तहत प्रोटीन के स्थानीयकरण के स्थल पर बने प्रतिरक्षा परिसरों को क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट (लेबल के प्रकार के आधार पर) की मदद से "प्रकट" किया जाता है।

विधि की संवेदनशीलता और विशिष्टता इस बात पर निर्भर करती है कि अनुसंधान में कौन से एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है।

उपयोग किए गए एंटीबॉडी केवल अध्ययन के तहत प्रोटीन के लिए एक अद्वितीय अमीनो एसिड अनुक्रम विशेषता के लिए विशिष्ट होने चाहिए। अन्यथा, कई प्रोटीन अणुओं के साथ एंटीबॉडी की बातचीत (विशेष रूप से मोटे प्रोटीन के अर्क के मामले में) संभव है, जो बदले में झिल्ली पर कई रंगीन बैंड की उपस्थिति का कारण बनेगी।

इस मामले में, अध्ययन के तहत प्रोटीन की पहचान अक्सर मुश्किल या असंभव भी होती है।

एंटीबॉडी का चयन करते समय ध्यान रखने वाला दूसरा महत्वपूर्ण कारक आत्मीयता है। उपयोग किए गए एंटीबॉडी की आत्मीयता जितनी अधिक होगी, प्रोटीन बैंड उतने ही उज्जवल और स्पष्ट होंगे, विधि की संवेदनशीलता उतनी ही अधिक होगी। उच्च-आत्मीयता एंटीबॉडी का उपयोग करते समय, 1 एनजी और इससे भी अधिक की संवेदनशीलता प्राप्त की जा सकती है।

झिल्ली से बंधे प्रतिजन और एंटीबॉडी के बीच बातचीत के परिणाम की कल्पना करने के लिए, माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग किया जाता है, जो कुछ शर्तों के तहत एक निश्चित संकेत देने में सक्षम एजेंटों के साथ संयुग्मित होते हैं।

आमतौर पर, एक एंजाइम (पेरोक्सीडेज या फॉस्फेट) का उपयोग ऐसे एजेंट के रूप में किया जाता है, जिसके प्रतिक्रिया उत्पाद का रंग होता है और एक अघुलनशील अवक्षेप के रूप में झिल्ली पर अवक्षेपित होता है।

इस विधि में फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग करना भी संभव है।

चावल। 1. अध्ययन के तहत प्रोटीन के इम्यूनोकेमिकल धुंधला की योजना: ए - एंजाइम लेबल के साथ संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी का उपयोग करना; बी - प्राथमिक एंटीबॉडी सीधे एक एंजाइम लेबल के साथ संयुग्मित होता है।

शिष्टाचार:

I. जेल और झिल्ली की तैयारी और प्रोटीन इलेक्ट्रोट्रांसफर

वैद्युतकणसंचलन के बाद, पॉलीएक्रिलामाइड जेल को एक सोख्ता बफर (25 मिमी ट्रिस, पीएच 8.3, 192 मिमी ग्लाइसिन, 10% इथेनॉल) के साथ स्नान में रखा जाता है।

फिल्टर पेपर की दो शीट, ब्लोटिंग कैसेट के आकार में काटी जाती हैं और ब्लॉटिंग बफर से सिक्त होती हैं, कैसेट के उस हिस्से पर रखी जाती हैं जो एनोड का सामना करेगी। फिर उसी बफर से पहले से सिक्त एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली को फिल्टर पेपर पर रखा जाता है, जिससे यह सुनिश्चित हो जाता है कि झिल्ली और कागज के बीच कोई हवाई बुलबुले नहीं हैं।

इसके बाद, जेल को ध्यान से झिल्ली पर रखा जाना चाहिए, फिर से जेल और झिल्ली के बीच हवा के बुलबुले की अनुपस्थिति पर विशेष ध्यान देना चाहिए। सैंडविच का निर्माण सिक्त फिल्टर पेपर की दो परतों द्वारा पूरा किया जाता है, जिन्हें जेल की सतह पर रखा जाता है (चित्र 2)। परिणामी सैंडविच को कैसेट में जकड़ा जाता है और इलेक्ट्रोड के बीच रखा जाता है ताकि झिल्ली एनोड का सामना करे।

चावल। 2. झिल्ली को प्रोटीन के इलेक्ट्रोट्रांसफर की योजना।

द्वितीय. इलेक्ट्रोट्रांसफर

एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में प्रोटीन का इलेक्ट्रोट्रांसफर 25 मिमी ट्रिस, पीएच 8.3, 192 मिमी ग्लाइसिन, 10% इथेनॉल युक्त बफर में 30-50 मिनट के लिए 100 वी के निरंतर वोल्टेज पर किया जाता है।

इलेक्ट्रोट्रांसफर का समय स्थानांतरित प्रोटीन के आकार पर निर्भर करता है; प्रोटीन जितना बड़ा होगा, इलेक्ट्रोट्रांसफर में उतना ही अधिक समय लगेगा। इलेक्ट्रोट्रांसपोर्ट की गुणवत्ता और प्रोटीन बैंड के स्थान का आकलन नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली को 1% एसिटिक एसिड में 0.3% पोंसेउ एस समाधान के साथ धुंधला करके किया जाता है। इम्यूनोकेमिकल धुंधला करने से पहले, प्रोटीन से बंधे डाई को हटाने के लिए झिल्ली को ट्रिस के कमजोर क्षारीय जलीय घोल से कई बार धोना चाहिए।

III. एक नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर स्थिर प्रोटीन का इम्यूनोकेमिकल धुंधला हो जाना

एंटीबॉडी के गैर-विशिष्ट बंधन की साइटों को ब्लॉक करने के लिए, झिल्ली को पीबीएसटी में 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर लगातार सरगर्मी के साथ ऊष्मायन किया जाता है (बेहतर अवरुद्ध करने के लिए, 10% स्किम मिल्क पाउडर युक्त पीबीएसटी समाधान का उपयोग किया जा सकता है)।

अवरुद्ध करने के बाद, झिल्ली को कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए पीबीएसटी में लगातार सरगर्मी के साथ ऊष्मायन किया जाता है जिसमें विशिष्ट एंटीबॉडी के 1-10 माइक्रोग्राम / एमएल होते हैं।

एंटीबॉडी की इष्टतम एकाग्रता अनुभवजन्य रूप से चुनी जाती है और एंटीजन के साथ एंटीबॉडी की बातचीत के संबंध पर निर्भर करती है।

ऊष्मायन के अंत में, झिल्ली को PBST से 5 बार धोएं और हॉर्सरैडिश पेरोक्सीडेज के साथ संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी के समाधान में स्थानांतरित करें। संयुग्म के कमजोर पड़ने को आमतौर पर निर्माता द्वारा पैकेजिंग पर इंगित किया जाता है, या शोधकर्ता द्वारा अनुभवजन्य रूप से चुना जाता है। द्वितीयक एंटीबॉडी के घोल में, झिल्ली को लगातार हिलाते हुए 1 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।

पूरी तरह से धोने के बाद (बफर को कम से कम 5-6 बार बदलते हुए), पीबीएसटी झिल्ली को क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट समाधान में स्थानांतरित किया जाता है जिसमें 3 मिलीग्राम डायमिनोबेंज़िडाइन (डीएबी) और 0.1 एम ट्रिस-एचसीएल के 10 मिलीलीटर में 30% हाइड्रोजन पेरोक्साइड का 10 μl होता है। , पीएच 7.6।

ऊष्मायन 5 से 10 मिनट के लिए सरगर्मी के साथ किया जाता है। सब्सट्रेट के साथ ऊष्मायन के अंत के बाद, झिल्ली को पीबीएसटी से धोया जाना चाहिए, फिल्टर पेपर के साथ सोख्ता द्वारा सुखाया जाना चाहिए, और तुरंत रंग में स्कैन करके एक इलेक्ट्रॉनिक प्रतिलिपि बनाना चाहिए। यदि झिल्ली पूरी तरह से सूख जाती है, तो दागी हुई प्रोटीन धारियां फीकी पड़ जाती हैं, और छवि कम उज्ज्वल और विपरीत होती है।

नोट: डीएबी एक विषैला पदार्थ और एक संभावित कार्सिनोजेन है। रबर के दस्ताने ही पहनें!

इम्युनोब्लॉटिंग एक प्रयोगशाला वातावरण में की जाने वाली एक नैदानिक ​​​​गतिविधि है, जिसके परिणामों के अनुसार विभिन्न रोगों के रोगजनकों के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाया जाता है। इन्हीं में से एक है ह्यूमन इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस। यह तुरंत ध्यान दिया जाना चाहिए कि एचआईवी इम्युनोब्लॉटिंग जैसा अध्ययन एक अतिरिक्त उपाय है जो सकारात्मक एलिसा परिणाम की पुष्टि करने के लिए निर्धारित है।

ह्यूमन इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस धीरे-धीरे बढ़ने वाला संक्रमण है। जब से रोगजनक शरीर में प्रवेश करते हैं और जब तक पहले लक्षण प्रकट नहीं होते हैं, तब तक अक्सर एक लंबा समय लगता है, जो कई वर्षों तक पहुंच सकता है।

विकास के प्रारंभिक चरण में, नैदानिक ​​​​अभिव्यक्तियाँ अनुपस्थित हो सकती हैं। सामान्य तापमान में वृद्धि, अस्वस्थता, गले में खराश, एचआईवी संक्रमण के लक्षण, एक व्यक्ति एक सामान्य सर्दी के साथ भ्रमित होता है, लेकिन संक्रमण जारी रहता है। इसलिए, एचआईवी केंद्रों के विशेषज्ञ ऐसे मामलों में व्यापक निदान की सलाह देते हैं:

• यदि आपने किसी नए साथी के साथ असुरक्षित संभोग किया है;
• यदि एक डिस्पोजेबल चिकित्सा सिरिंज या सुई का पुन: उपयोग किया गया है;
• यदि आपने हाल ही में एक टैटू या छेदा है;
• यदि एक और संक्रमण का पता चला है, जिसके संचरण का मार्ग यौन है (उदाहरण के लिए, सिफलिस, बैक्टीरियल वेजिनोसिस, गोनोरिया);
• अगर किसी संक्रमित व्यक्ति के संपर्क में था।

एचआईवी के लिए इम्युनोब्लॉट सीरम या रक्त प्लाज्मा का उपयोग करके किया जाता है। एक पट्टी पर अध्ययन के लिए 1.5-2 मिली रक्त या 15-25 μl सीरम की आवश्यकता होती है।

नैदानिक ​​​​उपाय न केवल मानव इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस के लिए, बल्कि अन्य रोगजनकों के लिए भी एंटीबॉडी का पता लगाने की अनुमति देता है। अध्ययन के दौरान, विशेष किट का उपयोग किया जाता है जो विभिन्न रोगों के लिए विशिष्ट हैं, उदाहरण के लिए:

• HSV1 और HSV2 IgM / IgG (हर्पीसवायरस संक्रमण का पता लगाने के लिए);
• मशाल आईजीएम प्रोफाइल (टोक्सोप्लाज्मोसिस, रूबेला, साइटोमेगालोवायरस संक्रमण, एचएसवी 1 और एचएसवी 2 का पता लगाने के लिए);
• EBV IgMTIgG (एपस्टीन-बार वायरल संक्रमण का पता लगाने के लिए);
• एचसीवी आईजीजी (वायरल हेपेटाइटिस टाइप सी का पता लगाने के लिए)।

इम्युनोब्लॉटिंग का परिणाम सकारात्मक हो सकता है (जब एंटीबॉडी का पता लगाया जाता है) और नकारात्मक (जब जैविक सामग्री में कोई एंटीबॉडी नहीं होते हैं), साथ ही अनिश्चित, गलत सकारात्मक और गलत नकारात्मक।

आप वायरस संक्रमण के लिए कहां जांच करवा सकते हैं, और आगे क्या करना है

प्रत्येक क्लिनिक, निजी प्रयोगशाला, अस्पताल, क्लिनिक इस तरह के नैदानिक ​​​​उपाय में माहिर हैं। आप एचआईवी परीक्षण केंद्र में परीक्षण करवा सकते हैं। कई निजी क्लीनिक एड्स और एचआईवी के लिए घरेलू परामर्श और परीक्षण की पेशकश करते हैं।

जरूरी! अध्ययन के परिणाम प्राप्त करने के बाद, आपको उपयुक्त चिकित्सा के लिए अपने चिकित्सक से संपर्क करने की आवश्यकता है।

सकारात्मक नमूने

यदि इम्युनोब्लॉट के परिणाम सकारात्मक हैं, तो इसका मतलब यह नहीं है कि एचआईवी संक्रमण शरीर में विकसित होता है। निदान की पुष्टि करने के लिए, अन्य अध्ययन निर्धारित हैं, उदाहरण के लिए, अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस।

हालांकि इम्युनोब्लॉट विधि अत्यधिक संवेदनशील है, हालांकि, कक्षा जी इम्युनोग्लोबुलिन के निर्धारण के कारण, संक्रमण के बाद पहले 3 सप्ताह में एक गलत सकारात्मक परिणाम संभव है। इस मामले में, परीक्षण एक निश्चित समय के बाद दोहराया जाता है।

झूठे सकारात्मक परिणाम के सभी कारण अज्ञात हैं। सबसे आम स्रोत गर्भावस्था के दौरान और हाल ही में एक प्रतिरक्षाविज्ञानी टीके की शुरूआत हैं। यदि, ऐसे कारकों के संपर्क में आने के एक निश्चित समय के बाद, एचआईवी के लिए इम्युनोब्लॉट अभी भी सकारात्मक है, तो इसका मतलब है कि व्यक्ति संक्रमित है।

नकारात्मक परिणाम

इम्युनोब्लॉट एक नकारात्मक परिणाम दे सकता है, जो शरीर में एचआईवी संक्रमण के लिए एंटीबॉडी की अनुपस्थिति का संकेत देता है और, परिणामस्वरूप, पूर्ण स्वास्थ्य।

एक नकारात्मक इम्युनोब्लॉट अक्सर "खिड़की अवधि" (संक्रमण और रक्त में एंटीबॉडी की उपस्थिति के बीच पहले 3 महीनों में) के दौरान मनाया जाता है। इस अवधि के दौरान, परीक्षण संबंधित एंटीबॉडी का पता नहीं लगाता है, लेकिन एक अन्य तरल पदार्थ (वीर्य, ​​योनि स्राव) में, बड़ी मात्रा में उनका पता लगाना संभव है।

विश्लेषण कैसे किया जाता है

इम्युनोब्लॉट आपको रक्त की जांच और जेल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग करके एंटीबॉडी की पहचान करने की अनुमति देता है।

सबसे पहले, जीवाणु कोशिकाओं या विषाणुओं का विनाश अल्ट्रासाउंड द्वारा किया जाता है, जिसके बाद वैद्युतकणसंचलन द्वारा, वायरस या जीवाणु कोशिकाओं के सभी एंटीजन को अलग किया जाता है। परिणाम एक वाणिज्यिक अभिकर्मक है जिसे एक विशेष नाइट्रोसेल्यूलोज फिल्म पर रखा गया है।

इम्युनोब्लॉटिंग के उत्पादन के दौरान, एक ज्ञात एंटीजन के साथ सामग्री पर परीक्षण सीरम भी लगाया जाता है। अनबाउंड एंटीबॉडी के ऊष्मायन और धुलाई के बाद, एंजाइम इम्युनोसे शुरू किया जाता है, इम्युनोग्लोबुलिन को सीरम पर लगाया जाता है, जिसे एक एंजाइम के साथ लेबल किया जाता है, और एक क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट जो एंजाइम के संपर्क में रंग बदलता है।

यदि एंटीबॉडी मौजूद हैं, तो मीडिया पर दाग बन जाते हैं।

एचआईवी इम्युनोब्लॉटिंग के लिए रक्त के नमूने का उपयोग किया जाता है

रैखिक विधि

एचआईवी के लिए रैखिक धब्बा एक अप्रत्यक्ष प्रतिरक्षाविज्ञानी अध्ययन है, जिसके द्वारा आईजीजी स्वप्रतिपिंडों का गुणात्मक संकेतक प्राप्त किया जाता है।

एक प्रतिरक्षाविज्ञानी अध्ययन के दौरान, एक एचआईवी-प्रारूप वायरल पदार्थ या एंटीजन का उपयोग किया जाता है। प्रयोगशाला में, एचआईवी प्रोटीन और रक्त सीरम से प्राप्त व्यक्तिगत एंटीबॉडी संयुक्त होते हैं। अगला, लेबल एंटीबॉडी और मानव इम्युनोग्लोबुलिन को जोड़कर ऊष्मायन किया जाता है।

नवजात शिशुओं में एचआईवी का निदान

9 महीने से कम उम्र के बच्चे के शरीर में, एक संक्रमित महिला से पैदा हुए, मां के एचआईवी के प्रति एंटीबॉडी मौजूद होते हैं, जो झूठी सकारात्मक एलिसा परिणाम का कारण बनता है। इस कारण से, वायरोलॉजिकल परीक्षणों को वरीयता दी जाती है - आरएनए और डीएनए पीसीआर का मात्रात्मक विश्लेषण। संक्रमण के निदान के लिए सांस्कृतिक पद्धति अधिक संवेदनशील है।

जरूरी! नवजात शिशुओं में एचआईवी संक्रमण की पहचान के लिए नैदानिक ​​उपाय करने के संकेत हैं: एक संक्रमित महिला से जन्म, पहले से संभव विश्लेषण का संदिग्ध परिणाम प्राप्त करना।

गर्भावस्था के दौरान अध्ययन

चूंकि एक गर्भवती महिला में विकसित होने वाला एचआईवी संक्रमण एक अजन्मे बच्चे को संचरित किया जा सकता है, इसलिए इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस का शीघ्र निदान आवश्यक है।

सबसे पहले, एक एंजाइम इम्यूनोसे किया जाता है, जिसका उपयोग स्क्रीनिंग के रूप में किया जाता है। नैदानिक ​​उपाय रक्त सीरम में संक्रमण के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाने में मदद करता है। गर्भावस्था के दौरान विश्लेषण के सटीक परिणामों के बावजूद, एक दूसरे अध्ययन की आवश्यकता है।

एलिसा का एक प्रकार प्रतिरक्षा सोख्ता है, जिसका प्रयोग अक्सर गर्भावस्था के दौरान किया जाता है। नैदानिक ​​​​परिणामों के अनुसार, कुछ एंटीजन के प्रति एंटीबॉडी की पहचान करना संभव है, जो इलेक्ट्रोफोरोसिस द्वारा आणविक भार द्वारा वितरित किए जाते हैं।

परीक्षा को सही तरीके से कैसे पास करें

एचआईवी के लिए प्रतिरक्षा सोख्ता रोग के निदान के लिए अन्य विधियों की तरह विशेष प्रशिक्षण की आवश्यकता है। यदि आप कुछ शोध करते हैं और पूरे दिन कुछ संकेतकों के परिणाम प्राप्त करते हैं (उदाहरण के लिए, एक एलर्जेन की प्रतिक्रिया), तो आपको केवल सुबह में एक प्रतिरक्षाविज्ञानी परीक्षण के लिए रक्त दान करने की आवश्यकता है।

परिणामों को डिकोड करना

डिक्रिप्शनइम्युनोब्लॉट के परिणाम एक प्रयोगशाला कार्यकर्ता द्वारा किए जाते हैं। यदि 3 में से 2 प्रोटीन HIV-1 या HIV-2 पाए जाते हैं, तो यह शरीर में संबंधित संक्रमण की उपस्थिति को इंगित करता है। अध्ययन एक सकारात्मक एंजाइम इम्युनोसे की पुष्टि करने के लिए किया जाता है। इसलिए, p24 के संयोजन में gp120 / 160, gp41 जैसे प्रोटीन के लिए प्रतिक्रिया की जाँच की जाती है। उत्तरार्द्ध तीन एड्स जीन का हिस्सा हैं - गैग पोल और एनवी।

एचआईवी इम्युनोब्लॉट परिणामों का योजनाबद्ध प्रदर्शन

प्रारंभिक निदान में प्रोटीन p25, gp110 / 120 और gp160 का अध्ययन शामिल है, जो रोग के विकास के प्रारंभिक चरण का संकेत देता है। एक सकारात्मक परिणाम के साथ, जो दूसरे सीरोलॉजिकल एंजाइम इम्युनोसे द्वारा दिया गया था, एक इम्युनोब्लॉट किया जाता है। यदि बाद वाला भी सकारात्मक परीक्षण करता है, तो एचआईवी निदान की पुष्टि की जाती है।

सकारात्मक परिणाम की संभावना उस अवधि पर निर्भर करती है जो संक्रमण के क्षण से निदान तक चली गई है:

• 28 दिनों के बाद - 60-65%;
• 42 दिनों के बाद - 80%;
• 56 दिनों के बाद - 90%;
• 84 दिनों के बाद - 95%।

एक गलत सकारात्मक परिणाम संभव है यदि गर्भावस्था के दौरान आगे के निदान के लिए जैविक सामग्री का संग्रह किया गया था, हार्मोनल असंतुलन के मामले में, कुछ दवाओं द्वारा प्रतिरक्षा समारोह का लंबे समय तक दमन जो एक व्यक्ति लेता है।

विश्लेषण मूल्यांकन मानदंड

एलिसा और पश्चिमी धब्बा विश्लेषण परिणामों को निम्नलिखित मानदंडों को पूरा करना चाहिए:

• अध्ययन के तहत जैविक सामग्री का धब्बा संदर्भ नमूने के धब्बा से मेल खाता है;
• मुख्य पहचाने गए घटक का आणविक भार विनिर्देश आवश्यकताओं को पूरा करता है।

एक विशेष प्रयोगशाला में प्राप्त परिणाम सबसे सटीक होंगे

पहचानी गई अशुद्धता और उसकी सामग्री को संदर्भ नमूने के लिए प्रमाणपत्र की आवश्यकताओं को पूरा करना चाहिए।

गैर-व्याख्यात्मक परिणाम

कुछ मामलों में, एचआईवी और एड्स के लिए इम्युनोब्लॉटिंग नकारात्मक और सकारात्मक परिणाम के अनुरूप नहीं है, और डॉक्टर संदिग्ध जानकारी का सही कारण निर्धारित नहीं कर सकते हैं। एक अलग सीरोटाइप के साथ संक्रमण अक्सर गलत व्याख्या का कारण होता है।

शंकाओं को दूर करने के लिए पीसीआर और एलिसा को गतिकी में किया जाता है। छह महीने तक रोग के लक्षण लक्षण और जोखिम कारकों के अभाव में, वे पूर्ण स्वास्थ्य की बात करते हैं। इस स्तर पर, नैदानिक ​​​​उपाय पूरे किए जाते हैं।

एक अन्य संक्रामक रोग, एक कैंसरयुक्त रसौली, या एक एलर्जी प्रतिक्रिया के शरीर में विकास के साथ एक संदिग्ध परिणाम भी प्राप्त किया जा सकता है।

जरूरी! यदि परिणाम संदिग्ध है, तो कोई व्यक्ति रक्त और अन्य जैविक सामग्री का दाता नहीं हो सकता है।

एचआईवी संक्रमण के निदान में विशिष्ट गलतियाँ

जैविक सामग्री का संग्रह, प्रयोगशाला निदान में प्रयुक्त सामग्री का वितरण और पंजीकरण निम्नलिखित नियमों का पालन करना चाहिए:

1. परीक्षण प्रणाली के नाम, इसकी समाप्ति तिथि और बैच का संकेत देते हुए साथ-साथ प्रलेखन तैयार किया गया है।
2. विषय का पासपोर्ट डेटा, तिथि और जैविक सामग्री के संग्रह का स्थान पूरी तरह से इंगित किया गया है।
3. सीरम को स्थापित अवधि से अधिक समय तक संग्रहीत नहीं किया जाता है, अध्ययन के लिए बायोप्सी की स्वीकार्य मात्रा ली जाती है - 2-5 मिलीलीटर से कम नहीं।
4. शीशी पर संख्या दिशा में संकेतित संख्या से मेल खाती है।
5. जैविक सामग्री का संग्रह स्थापित नियमों के अनुसार होता है, अर्थात् क्यूबिटल नस से। परीक्षण रक्त में कोई थक्का नहीं होना चाहिए।

सामग्री एकत्र करने के लिए एक सूखी परखनली का उपयोग किया जाता है। गर्भनाल रक्त अक्सर नवजात शिशुओं से लिया जाता है, जो दिशा में इस तरह के एक तथ्य को दर्शाता है।

डॉक्टरों की एक सामान्य गलती कमरे के तापमान पर 12 घंटे से अधिक और सेल्सियस से ऊपर 4-8 डिग्री के तापमान पर 1 दिन से अधिक समय तक प्राप्त सामग्री का भंडारण कर रही है। हेमोलिसिस की शुरुआत के कारण, नैदानिक ​​​​उपाय के परिणाम विकृत होते हैं।

तो, एचआईवी संक्रमण के निदान के दौरान विशिष्ट गलतियों में शामिल हैं:

• जैविक सामग्री का अनुचित संग्रह;
• बायोप्सी का अनुचित भंडारण;
• निदान प्रणालियों का गलत परिवहन;
• परीक्षण प्रणाली का दीर्घकालिक भंडारण।

परिणाम उस कंटेनर को कुल्ला करने के लिए उपयोग किए जाने वाले पानी की गुणवत्ता से भी प्रभावित होता है जिसमें जैविक सामग्री रखी जाती है।

अध्ययन के परिणाम प्राप्त करने के बाद, प्रयोगशाला कार्यकर्ता को डॉक्टर के लिए एक राय जारी करनी चाहिए। यदि निदान "विंडो अवधि" के दौरान किया गया था, तो वह एक निश्चित समय के बाद बार-बार निदान की नियुक्ति करता है। किसी भी मामले में, एचआईवी संक्रमण का निदान करने के लिए, एक इम्युनोब्लॉट पर्याप्त नहीं है। व्यापक निदान की आवश्यकता है।

संक्रामक रोगों के प्रयोगशाला निदान के अभ्यास में, कभी-कभी रोगज़नक़ों के लिए एंटीबॉडी निर्धारित करने की आवश्यकता नहीं होती है, लेकिन इसके कुछ प्रोटीन (एंटीजन), यानी विशिष्ट एंटीबॉडी के स्पेक्ट्रम के लिए। यदि इस उद्देश्य के लिए एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख की विधि का उपयोग किया जाता है, तो इस मामले में पहले रोगज़नक़ की संस्कृति से आवश्यक एंटीजन को अलग करना और शुद्ध करना आवश्यक है। परिणामी प्रोटीन ठोस चरण में अलग से लागू होते हैं। ९६-वेल प्लेट का उपयोग करने के मामले में - प्रत्येक कुएं में एक प्रकार का एंटीजन। फिर, विशिष्ट एंटीबॉडी को एक अप्रत्यक्ष विधि द्वारा निर्धारित किया जाता है।

एक या दूसरे एंटीजन के साथ कुएं में सकारात्मक प्रतिक्रिया की उपस्थिति से, कोई संबंधित विशिष्ट एंटीबॉडी की उपस्थिति का न्याय कर सकता है। इस तरह के एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख सिस्टम निर्माण फर्मों द्वारा पेश किए जाते हैं, हालांकि, अधिक जानकारी सामग्री और अध्ययन की सादगी के कारण, प्रतिरक्षा सोख्ता (पश्चिमी धब्बा) की विधि व्यापक हो गई है।

प्रतिरक्षा सोख्ता रक्त सीरम में एक साथ और एक ही समय में एंटीबॉडी के निर्धारण की अनुमति देता है, रोगज़नक़ के सभी नैदानिक ​​​​रूप से महत्वपूर्ण प्रोटीन के लिए विभेदित। अंग्रेजी से अनुवादित वेस्टर्न ब्लॉट का अर्थ है वेस्टर्न ट्रांसफर (शाब्दिक रूप से - ब्लॉटिंग)। इस असामान्य शब्द का इतिहास इस प्रकार है।

ई. सदर्न नाम के एक वैज्ञानिक ने 1975 में पहली बार इलेक्ट्रोफोरेटिक रूप से अलग किए गए डीएनए अंशों को एक जेल से एक झिल्ली में स्थानांतरित करने के लिए एक विधि का प्रस्ताव दिया था। लेखक के अनुसार इस विधि को दक्षिणी धब्बा नाम दिया गया था, जिसका अर्थ है "दक्षिणी स्थानान्तरण"। आरएनए अणुओं को स्थानांतरित करने की विधि, बदले में, विशेषज्ञों द्वारा उपनाम दिया गया था उत्तरी धब्बा - "उत्तरी स्थानांतरण"। पहले तो मजाक के रूप में, और फिर यह नाम आधिकारिक वैज्ञानिक साहित्य में दर्ज किया गया।

1979 में जी. टूबिन ने प्रोटीन सोख्ता पर पहले प्रयोगों के परिणाम प्रकाशित किए। जैविक मैक्रोमोलेक्यूल्स के हस्तांतरण के लिए "भौगोलिक" नामकरण विधियों की परंपरा को जारी रखते हुए, इस पद्धति को "पश्चिमी" स्थानांतरण - पश्चिमी धब्बा के रूप में जाना जाने लगा।

इस विधि के पहले चरण में, सोडियम डोडेसिल सल्फेट (एसडीएस) की उपस्थिति में पॉलीएक्रिलामाइड जेल में रोगजनक प्रोटीन के मिश्रण का इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण किया जाता है। एसडीएस, एक सर्फेक्टेंट होने के नाते, समान रूप से प्रोटीन अणुओं को कवर करता है और उन सभी को लगभग समान परिमाण का ऋणात्मक चार्ज प्रदान करता है। इसलिए, अणु एक विद्युत क्षेत्र में एक दिशा में चलते हैं, और गति की गति केवल प्रोटीन के अणु (आणविक भार) के आकार पर निर्भर करती है।

इलेक्ट्रोफोरेटिक प्रक्रिया के परिणामस्वरूप, एक जेल प्लेट प्राप्त की जाती है, जिसकी मोटाई में प्रोटीन अलग-अलग पतले रैखिक क्षेत्रों के रूप में स्थित होते हैं। आंदोलन की दिशा में, उन्हें निम्नलिखित क्रम में अलग किया जाता है: शुरुआत के करीब 120-150 केडीए के क्रम में बड़े आणविक भार वाले प्रोटीन होते हैं, और 5-10 केडीए के द्रव्यमान वाले प्रोटीन खत्म होने के लिए उन्नत होते हैं रेखा। दूसरे चरण में, नाइट्रोसेल्यूलोज की एक शीट पर एक जेल शीट लगाई जाती है और संरचना को डीसी स्रोत के इलेक्ट्रोड के बीच इंटरपोज किया जाता है। एक विद्युत क्षेत्र के प्रभाव में, प्रोटीन झरझरा जेल से एक सघन झिल्ली में प्रवाहित होते हैं, जहां वे मजबूती से तय होते हैं।

परिणामी ब्लॉट को एंटीजेनिक रूप से उदासीन प्रोटीन और / या गैर-आयनिक डिटर्जेंट (ट्वीन 20) युक्त अवरुद्ध समाधान के साथ इलाज किया जाता है, जो झिल्ली पर एंटीजन मुक्त साइटों को अवरुद्ध करता है। झिल्ली शीट को फिर संकीर्ण पट्टियों में काट दिया जाता है ताकि प्रत्येक पट्टी में सभी एंटीजेनिक अंश हों। वर्णित चरण निर्माता द्वारा किए जाते हैं।

प्रतिरक्षा सोख्ता द्वारा एंटीबॉडी के निर्धारण के लिए वाणिज्यिक परीक्षण प्रणालियों में विश्लेषण के लिए तैयार ब्लॉट्स (स्ट्रिप्स, या स्ट्रिप्स) होते हैं। उपयोगकर्ता अप्रत्यक्ष विधि का उपयोग करके रोगज़नक़ के प्रोटीन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के पूरे स्पेक्ट्रम का निर्धारण करता है। एक रंग (एंजाइमी) प्रतिक्रिया करने के लिए क्रोमोजेन के रूप में, एक घुलनशील रंगहीन पदार्थ का उपयोग किया जाता है, जिसका उत्पाद एक रंग प्राप्त करता है, अघुलनशील हो जाता है और नाइट्रोसेल्यूलोज पर बसता है (अवक्षेपित होता है)।

परीक्षण नमूने में रोगज़नक़ के प्रोटीन के प्रति एंटीबॉडी की उपस्थिति में प्रतिरक्षा और एंजाइमेटिक प्रतिक्रियाओं के अनुक्रमिक कार्यान्वयन के परिणामस्वरूप, धब्बा पर गहरे अनुप्रस्थ धारियाँ दिखाई देती हैं, जिसका स्थान कुछ प्रोटीनों के क्षेत्र में स्थित होता है। रोगाणु। ऐसा प्रत्येक बैंड संबंधित प्रतिजन के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी की उपस्थिति को इंगित करता है। प्रतिरक्षा सोख्ता की विधि द्वारा किए गए एक अध्ययन का परिणाम रोगज़नक़ के विशिष्ट प्रोटीन के लिए एंटीबॉडी की एक सूची के रूप में जारी किया जाता है। उदाहरण के लिए: "पी 17 और पी 24 प्रोटीन के एंटीबॉडी की पहचान की गई है।"

विकास के बाद, नाइट्रोसेल्यूलोज ब्लॉट्स को लंबे समय तक सूखा रखा जा सकता है। हालांकि, रंग की तीव्रता काफी कमजोर है। गीले धब्बों की तस्वीरें खींची जा सकती हैं या, स्कैनर का उपयोग करके, उनकी ग्राफिक छवि को पर्सनल कंप्यूटर की मेमोरी में दर्ज किया जा सकता है। विशेष कंप्यूटर प्रोग्राम आपको प्राप्त परिणामों को संसाधित करने और गतिशील अवलोकन के दौरान एंटीबॉडी स्पेक्ट्रम की गतिशीलता को जल्दी से ट्रैक करने की अनुमति देते हैं

इम्युनोब्लॉटिंग (इम्युनोब्लॉटिंग) एक अत्यधिक विशिष्ट और अत्यधिक संवेदनशील संदर्भ विधि है जो सकारात्मक या अनिश्चित परीक्षण परिणामों वाले रोगियों के लिए निदान की पुष्टि करती है, जिसमें शामिल हैं। आरपीजीए या एलिसा का उपयोग करना .

रोगज़नक़ के अलग-अलग प्रतिजनों के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाने की यह विधि नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली पर एलिसा पर आधारित है, जिस पर जेल वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किए गए अलग-अलग बैंड के रूप में विशिष्ट प्रोटीन लगाए जाते हैं। यदि कुछ एंटीजन के खिलाफ एंटीबॉडी हैं, तो पट्टी के संबंधित स्थान पर एक गहरी रेखा दिखाई देती है। इम्युनोब्लॉट की विशिष्टता इसकी उच्च सूचना सामग्री और प्राप्त परिणामों की विश्वसनीयता में निहित है।

अनुसंधान के लिए सामग्रीमानव सीरम या प्लाज्मा है। एक पट्टी पर शोध के लिए 1.5-2 मिली रक्त या 15-25 μl सीरम की आवश्यकता होती है।

डब्ल्यूएचओ की सिफारिश के अनुसार, एचआईवी संक्रमण के निदान में वेस्टर्न ब्लॉटिंग का उपयोग एक अतिरिक्त विशेषज्ञ विधि के रूप में किया जाता है, जिसे एलिसा परिणामों की पुष्टि करनी चाहिए। आमतौर पर, इस पद्धति का उपयोग एलिसा के साथ सकारात्मक परिणाम को दोबारा जांचने के लिए किया जाता है, क्योंकि इसे अधिक संवेदनशील और विशिष्ट माना जाता है, हालांकि अधिक जटिल और महंगा है।

इम्यून ब्लॉटिंग एक जेल में वायरल प्रोटीन के प्रारंभिक इलेक्ट्रोफोरेटिक पृथक्करण और नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में उनके स्थानांतरण के साथ एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख (एलिसा) को जोड़ती है। इम्युनोब्लॉट प्रक्रिया में कई चरण होते हैं। सबसे पहले, एचआईवी, जिसे पहले शुद्ध किया गया था और इसके घटक घटकों में अवक्रमित किया गया था, वैद्युतकणसंचलन से गुजरता है, जबकि वायरस बनाने वाले सभी एंटीजन आणविक भार से अलग होते हैं। एंटीजन को फिर जेल से नाइट्रोसेल्यूलोज या नायलॉन फिल्टर स्ट्रिप पर दाग दिया जाता है, जिसमें अब आंखों के लिए अदृश्य एचआईवी प्रोटीन का एक स्पेक्ट्रम होता है। अगला, परीक्षण सामग्री को पट्टी (सीरम, रोगी के रक्त प्लाज्मा, आदि) पर लागू किया जाता है, और यदि नमूने में विशिष्ट एंटीबॉडी होते हैं, तो वे एंटीजन प्रोटीन के स्ट्रिप्स से बंधते हैं जो उनके साथ सख्ती से मेल खाते हैं। बाद के जोड़तोड़ (एलिसा की तरह) के परिणामस्वरूप, इस बातचीत के परिणाम की कल्पना की जाती है - यह दृश्यमान हो जाता है। पट्टी के कुछ हिस्सों में बैंड की उपस्थिति अध्ययन किए गए सीरम में सख्ती से परिभाषित एचआईवी एंटीजन के एंटीबॉडी की उपस्थिति की पुष्टि करती है।

एचआईवी संक्रमण के निदान की पुष्टि करने के लिए इम्यून ब्लॉटिंग का सबसे अधिक उपयोग किया जाता है। डब्ल्यूएचओ सकारात्मक सीरा मानता है जिसमें किन्हीं दो एचआईवी लिफाफा प्रोटीनों के प्रति एंटीबॉडी का पता प्रतिरक्षा सोख्ता द्वारा लगाया जाता है। इन सिफारिशों के अनुसार, यदि केवल एक लिफाफा प्रोटीन (gp160, gp120, gp41) के साथ संयोजन में या अन्य प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया के बिना प्रतिक्रिया होती है, तो परिणाम को संदिग्ध माना जाता है और दूसरे की किट का उपयोग करके पुन: परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है श्रृंखला या कोई अन्य कंपनी। यदि इसके बाद भी परिणाम संदिग्ध रहता है तो हर 3 महीने में शोध जारी रखा जाता है।

peculiarities

इम्युनोब्लॉट विश्लेषण एक विश्वसनीय तरीका है जो आपको पहले और दूसरे प्रकार के एचआईवी एंटीजन के लिए एंटीबॉडी की उपस्थिति निर्धारित करने की अनुमति देता है। यदि कोई व्यक्ति संक्रमित होता है, तो दो सप्ताह के भीतर एंटीबॉडी दिखाई देती है, जिसका पता बहुत बाद में लगाया जा सकता है। एचआईवी की ख़ासियत यह है कि एंटीबॉडी की संख्या तेजी से बढ़ती है और रोगी के रक्त में बनी रहती है। यदि वे मौजूद हैं, तो भी रोग दो या अधिक वर्षों तक प्रकट नहीं हो सकता है। एलिसा विधि हमेशा रोग की उपस्थिति को सटीक रूप से निर्धारित नहीं करती है, इसलिए, इम्युनोब्लॉटिंग और पीसीआर का उपयोग करके परिणामों की पुष्टि की आवश्यकता होती है यदि एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख ने सकारात्मक परिणाम दिखाया है।

नियुक्ति के लिए संकेत

यह "इम्युनोब्लॉट" क्या है, यह पहले ही पता लगाया जा चुका है, लेकिन यह अध्ययन किसे सौंपा गया है? इम्युनोब्लॉटिंग द्वारा मानव इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी) के लिए परीक्षण पास करने का कारण एक सकारात्मक एलिसा परिणाम है। जिन रोगियों का ऑपरेशन किया जाएगा, उनके लिए एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख से गुजरना आवश्यक है। इसके अलावा, गर्भावस्था की योजना बनाने वाली महिलाओं के साथ-साथ उन सभी के लिए एक विश्लेषण किया जाना चाहिए जो एक कामुक यौन जीवन जीते हैं। यदि एलिसा के परिणाम संदेह में हैं, तो एचआईवी के रोगियों को इम्युनोब्लॉटिंग असाइन करें।

निम्नलिखित खतरनाक लक्षण डॉक्टर से संपर्क करने का कारण बन सकते हैं:

• भारी वजन घटाने;
• कमजोरी, प्रदर्शन की हानि;
• एक परेशान मल त्याग (दस्त) जो तीन सप्ताह तक रहता है;
• शरीर का निर्जलीकरण;
• बुखार;
• शरीर पर बढ़े हुए लिम्फ नोड्स;
• कैंडिडिआसिस, तपेदिक, निमोनिया, टोक्सोप्लाज्मोसिस, दाद का तेज होना।

रोगी को शिरापरक रक्त दान करने से पहले तैयारी करने की आवश्यकता नहीं होती है। अध्ययन से 8-10 घंटे पहले भोजन नहीं करना चाहिए। रक्तदान करने से एक दिन पहले शराब और कॉफी पीने की सलाह नहीं दी जाती है, भारी शारीरिक व्यायाम करने के लिए, चिंता का अनुभव करने के लिए।

शोध कैसे किया जाता है?

रोगी के दृष्टिकोण से, इम्युनोब्लॉट किसी भी अन्य विश्लेषण से अलग नहीं है: शिरापरक रक्त लिया जाता है, जांच की जाती है और परिणाम प्राप्त होता है। लेकिन अगर आप तकनीक में थोड़ा और विस्तार से जाते हैं, तो यह बहुत आसान नहीं है, लेकिन फिर भी इसे समझने की कोशिश करते हैं।

सबसे पहले, "संदर्भ" मानव इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस को अभिकर्मक निर्माण संयंत्र में लिया जाता है। फिर, एक जेल माध्यम में एक विशेष प्रक्रिया (वैद्युतकणसंचलन) का उपयोग करके, वायरस अपने सबसे छोटे घटकों: प्रोटीन (वायरस एंटीजन) को नष्ट कर देता है। फिर, स्वयं ब्लॉटिंग (अंग्रेजी ब्लॉटिंग से) का उपयोग करके, कणों को एक विशेष सामग्री - नाइट्रोसेल्यूलोज या नायलॉन फ़िल्टर पर रखा जाता है, जिसके परिणामस्वरूप उपयोग के लिए तैयार संकेतक, तथाकथित पट्टी होती है। एक पट्टी एक पट्टी है जिसमें एंटीजन को उनके आणविक भार के आधार पर एक स्पष्ट क्रम में वितरित किया जाता है, अर्थात, एक निश्चित प्रोटीन कागज के प्रत्येक मिलीमीटर से मेल खाती है।

जैसा कि आप जानते हैं, यदि किसी व्यक्ति के रक्त में वायरस मौजूद होते हैं, तो शरीर उनकी झिल्ली (कुछ प्रोटीन) के खिलाफ एंटीबॉडी का उत्पादन करना शुरू कर देता है, और प्रत्येक वायरस का एंटीजन प्रोटीन का अपना अलग सेट होता है। रक्त में एंटीजेनिक प्रोटीन के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाना इम्युनोब्लॉट विधि का आधार है। आखिरकार, यदि एक एंटीबॉडी एक एंटीजन से टकराती है, तो वे निश्चित रूप से एक दूसरे के साथ बातचीत करेंगे - "छड़ी"।

तो, एंटीजन स्ट्रिप स्ट्रिप पर हैं और यदि जांच किए गए व्यक्ति के रक्त में उपयुक्त एंटीजन हैं, तो वे आवश्यक रूप से एक दूसरे के साथ बातचीत करेंगे और इस जगह पर स्ट्रिप स्ट्रिप पर एक संकेतक दिखाई देगा - यह सपाट दिखाई देगा ( गर्भावस्था परीक्षण की तरह)। इसके अलावा, पट्टी पर एक विशिष्ट स्थान पर, इसलिए डॉक्टर समझेंगे कि क्या रक्त में प्रोटीन का एक सेट है जो किसी विशेष वायरस की विशेषता है।

इसलिए, उदाहरण के लिए, यदि प्रोटीन के स्थानीयकरण के स्थानों में पट्टी पर कालापन होता है जीपी160, जीपी120, जीपी41एचआईवी का निदान किया जाता है, अन्य वायरस के लिए यह प्रोटीन का एक पूरी तरह से अलग सेट होगा।

यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इम्युनोब्लॉट आपको केवल वायरस की उपस्थिति को सटीक रूप से स्थापित करने की अनुमति देता है यदि रक्त में एंटीबॉडी का सेट पूरा हो गया है, अर्थात, यदि प्रोटीन gp160, gp120, gp41 एक साथ मौजूद हैं, तो यह 100% एचआईवी है। संक्रमण। लेकिन अगर कम से कम एक गायब है, उदाहरण के लिए: gp41 अनुपस्थित है, लेकिन केवल gp160, gp120 है, तो परीक्षण को संदिग्ध माना जाता है और पुनरावृत्ति की आवश्यकता होती है।

सामान्य प्रश्न

इम्युनोब्लॉट में कौन से चरण शामिल हैं?

1. पट्टी की तैयारी।इम्युनोडेफिशिएंसी वायरस (एचआईवी), जो पहले शुद्ध किया गया था और इसके घटक घटकों को नष्ट कर दिया गया था, वैद्युतकणसंचलन से गुजरता है, जबकि एंटीजन जो एचआईवी का हिस्सा हैं, आणविक भार से अलग होते हैं। फिर, ब्लॉटिंग (ब्लॉटर पर अतिरिक्त स्याही को निचोड़ने के समान) द्वारा, एंटीजन को नाइट्रोसेल्यूलोज की एक पट्टी में स्थानांतरित कर दिया जाता है, जिसमें अब एंटीजेनिक बैंड का एक स्पेक्ट्रम होता है जो आंखों के लिए अदृश्य होता है, एचआईवी की विशेषता।
2. नमूना अनुसंधान।परीक्षण सामग्री (सीरम, रोगी के रक्त का प्लाज्मा, आदि) को नाइट्रोसेल्यूलोज पट्टी पर लगाया जाता है, और यदि नमूने में विशिष्ट एंटीबॉडी हैं, तो वे सख्ती से संबंधित (पूरक) एंटीजेनिक बैंड से बंधते हैं। बाद के जोड़तोड़ के परिणामस्वरूप, इस बातचीत के परिणाम की कल्पना की जाती है - दृश्यमान बनाया जाता है।
3. परिणाम की व्याख्या।नाइट्रोसेल्यूलोज प्लेट के कुछ क्षेत्रों में बैंड की उपस्थिति अध्ययन किए गए सीरम में सख्ती से परिभाषित एचआईवी एंटीजन के लिए एंटीबॉडी की उपस्थिति की पुष्टि करती है।

• लेन ए - सकारात्मक नियंत्रण
• बार बी - कमजोर सकारात्मक नियंत्रण
• लेन सी - नकारात्मक नियंत्रण
• लेन डी - सकारात्मक नमूना (एचआईवी -1 एंटीबॉडी का पता चला)

विश्लेषण को कैसे समझें?

यदि एलिसा ने इस परीक्षण प्रणाली के अनुसार एंटीजन के लिए सभी या लगभग सभी एंटीबॉडी की उपस्थिति को दिखाया, तो यह एचआईवी के लिए एक सकारात्मक परीक्षण का संकेत देता है। यदि दूसरे सीरोलॉजिकल एंजाइम-लिंक्ड इम्युनोसॉरबेंट परख के बाद प्रतिक्रिया सकारात्मक है, तो एक इम्युनोब्लॉट किया जाना चाहिए। इसके परिणामों को समझना अधिक सही होगा। यदि एंजाइम इम्युनोसे ने सकारात्मक परिणाम दिया, तो अगले इम्युनोब्लॉट विश्लेषण ने भी एचआईवी की उपस्थिति को दिखाया, फिर अंतिम परिणाम डाला जाता है।

जब परीक्षणों की व्याख्या की जाती है, तो आपको यह जानना होगा कि एक सकारात्मक एचआईवी परीक्षण द्वारा निर्धारित किया जाता है:

• संक्रमण के 28 दिन बाद 60% से 65%;
• 80% - 42 दिनों के बाद;
• 90% में - 56 दिनों के बाद;
• 95% - 84 दिनों के बाद।

यदि एचआईवी के प्रति प्रतिक्रिया सकारात्मक है, तो इसका मतलब यह होगा कि वायरस के प्रति एंटीबॉडी का पता चला है। झूठे सकारात्मक उत्तर से बचने के लिए, दोबारा परीक्षण करना आवश्यक है, अधिमानतः दो बार। यदि दो में से दो परीक्षण पास करते समय या उनमें से 2 में 3 परीक्षण पास करते समय इम्युनोडेफिशिएंसी के प्रति एंटीबॉडी का पता लगाया जाता है, तो परिणाम सकारात्मक माना जाता है।

संक्रमण के दिन से 14 दिनों के भीतर रक्त में p24 एंटीजन का पता लगाया जा सकता है। एंजाइम इम्यूनोएसे की विधि का उपयोग करके 14 से 56 दिनों तक इस एंटीजन का पता लगाया जाता है। 60 दिनों के बाद, यह अब खून में नहीं है। जब शरीर में एड्स बनता है तभी यह p24 प्रोटीन रक्त में फिर से बढ़ता है। इसलिए, संक्रमण के शुरुआती दिनों में एचआईवी का पता लगाने के लिए, या यह निर्धारित करने के लिए कि रोग कैसे आगे बढ़ रहा है और उपचार प्रक्रिया की निगरानी के लिए एंजाइम इम्यूनोएसे परीक्षण प्रणाली का उपयोग किया जाता है। एंजाइम इम्युनोसे की उच्च विश्लेषणात्मक संवेदनशीलता 5 से 10 पीकेजी / एमएल की एकाग्रता पर पहले उपप्रकार के एचआईवी के साथ जैविक सामग्री में पी 24 एंटीजन का पता लगाती है, दूसरे उप प्रकार के एचआईवी 0.5 एनजी / एमएल या उससे कम से।

अंतर्गत संदिग्धएक एंजाइम से जुड़े इम्युनोसॉरबेंट परख के परिणाम का अर्थ है कि निदान में कहीं गलती की गई थी, एक नियम के रूप में, चिकित्सा कर्मचारियों द्वारा कुछ भ्रमित किया गया था, या किसी व्यक्ति में संक्रमण के लक्षण हैं, और परिणाम नकारात्मक है, जो संदेह पैदा करता है, व्यक्ति को दूसरे परीक्षण के लिए भेजा जाता है।

अंतर्गत सकारात्मक झूठीपरिणाम को परिणाम के रूप में समझा जाता है जब रोगी की निम्नलिखित स्थितियों के तहत रक्त परीक्षण किया गया था:

• गर्भावस्था;
• अगर किसी व्यक्ति को हार्मोनल विकार है;
• लंबे समय तक इम्युनोसुप्रेशन के साथ।

इस मामले में विश्लेषण को कैसे समझें? कम से कम एक प्रोटीन का पता चलने पर एक गलत सकारात्मक परिणाम दिया जाता है। इस तथ्य के कारण कि पी 24 एंटीजन व्यक्तिगत विविधताओं पर अत्यधिक निर्भर है, इस पद्धति का उपयोग करके, संक्रमण की पहली अवधि में, 20% से 30% रोगियों का पता लगाया जाता है।

एक सकारात्मक परीक्षा परिणाम कितना विश्वसनीय है?

कभी-कभी एलिसा के परिणाम गलत-सकारात्मक होते हैं (लगभग 1% मामलों में), इस तरह के परिणाम का कारण गर्भावस्था, विभिन्न वायरल संक्रमण या एक साधारण दुर्घटना हो सकती है। एक सकारात्मक परिणाम प्राप्त करने के बाद, एक अधिक सटीक परीक्षण की आवश्यकता होती है - एक इम्युनोब्लॉट, जिसके परिणामों के अनुसार निदान किया जाता है। सकारात्मक एलिसा के बाद एक सकारात्मक इम्युनोब्लॉट परिणाम 99.9% विश्वसनीय है - यह किसी भी चिकित्सा परीक्षण के लिए अधिकतम सटीकता है। यदि इम्युनोब्लॉट नकारात्मक है, तो पहला परीक्षण झूठा सकारात्मक था, और वास्तव में, व्यक्ति को एचआईवी नहीं है।

अनिश्चित (संदिग्ध) परिणाम क्या है?

यदि एलिसा सकारात्मक या नकारात्मक है, तो इम्युनोब्लॉट सकारात्मक, नकारात्मक या अनिश्चित हो सकता है। अनिश्चित इम्युनोब्लॉट परिणाम, यानी। वायरस के प्रति कम से कम एक प्रोटीन के इम्युनोब्लॉट में उपस्थिति देखी जा सकती है यदि संक्रमण हाल ही में हुआ है और रक्त में एचआईवी के लिए अभी भी कुछ एंटीबॉडी हैं, इस स्थिति में इम्युनोब्लॉट थोड़ी देर बाद सकारात्मक हो जाएगा। इसके अलावा, हेपेटाइटिस के साथ एचआईवी संक्रमण की अनुपस्थिति, कुछ पुरानी चयापचय संबंधी बीमारियों या गर्भावस्था के दौरान एक अनिश्चित परिणाम दिखाई दे सकता है। इस मामले में, या तो इम्युनोब्लॉट नकारात्मक हो जाएगा, या अपरिभाषित परिणाम का कारण मिल जाएगा।

विश्लेषण की लागत कितनी है?

एचआईवी के लिए इम्युनोब्लॉट एक सस्ता परीक्षण नहीं है। औसतन, प्रतिरक्षण विधियों द्वारा एक स्क्रीनिंग परीक्षा की लागत 500 से 900 रूबल तक होती है। इम्युनोब्लॉटिंग एक सत्यापन अध्ययन है, जिसकी लागत तीन से पांच हजार रूबल तक होती है। अधिक जटिल तरीके बहुत अधिक महंगे हैं। उदाहरण के लिए, पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) विश्लेषण के लिए, आपको लगभग 12,000 रूबल का भुगतान करना होगा।

विश्लेषण कहां करना है?

मैं एचआईवी के लिए कहां जांच करवा सकता हूं? एलिसा, इम्युनोब्लॉट अध्ययन शहरी निजी क्लीनिकों में किए जाते हैं, परिणाम एक दिन के भीतर जारी किए जाते हैं। तत्काल निदान भी संभव है। राज्य के चिकित्सा संस्थानों में, रूसी संघ के कानून के अनुसार, एलिसा परीक्षण और इम्युनोब्लॉटिंग नि: शुल्क किए जाते हैं। गर्भवती महिलाओं के साथ-साथ अस्पताल में भर्ती होने वाले या सर्जरी कराने वाले मरीजों को संक्रामक रोगों के लिए अनिवार्य परीक्षण से गुजरना पड़ता है।

ठोस चरण एलिसा - परीक्षण का एक प्रकार, जब प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया (एंटीजन या एंटीबॉडी) के घटकों में से एक को ठोस वाहक पर डाला जाता है, उदाहरण के लिए, पॉलीस्टाइनिन प्लेटों के कुओं में। लेबल किए गए एंटीबॉडी या एंटीजन को जोड़कर घटकों का पता लगाया जाता है। यदि परिणाम सकारात्मक है, तो क्रोमोजेन का रंग बदल जाता है। हर बार अगले घटक को जोड़ने के बाद, अनबाउंड अभिकर्मकों को कुओं से धोकर हटा दिया जाता है,

एंटीबॉडी (बाएं आंकड़ा) का निर्धारण करते समय, रोगी के रक्त सीरम, एक एंजाइम के साथ लेबल किए गए एंटीग्लोबुलिन सीरम, और एंजाइम के लिए एक सब्सट्रेट / क्रोमोजेन क्रमिक रूप से सॉर्बेड एंटीजन के साथ प्लेटों के कुओं में जोड़े जाते हैं।

द्वितीय. एंटीजन (सही आंकड़ा) का निर्धारण करते समय, एंटीजन को सोखने वाले एंटीबॉडी (उदाहरण के लिए, वांछित एंटीजन के साथ रक्त सीरम) के साथ कुओं में पेश किया जाता है, इसके खिलाफ डायग्नोस्टिक सीरम और द्वितीयक एंटीबॉडी (डायग्नोस्टिक सीरम के खिलाफ) के साथ लेबल किया जाता है एंजाइम जोड़े जाते हैं, और फिर एंजाइम के लिए सब्सट्रेट / क्रोमोजेन।

प्रतिस्पर्धी एलिसा प्रतिजनों का निर्धारण करने के लिए: लक्ष्य प्रतिजन और एंजाइम-लेबल प्रतिजन प्रतिरक्षा सीरम की सीमित मात्रा में प्रतिरक्षी को बाध्य करने के लिए एक दूसरे के साथ प्रतिस्पर्धा करते हैं।

एंटीबॉडी के निर्धारण के लिए एक अन्य परीक्षण एक प्रतिस्पर्धी एलिसा है: लक्ष्य एंटीबॉडी और एंजाइम-लेबल एंटीबॉडी एक दूसरे के साथ ठोस चरण पर adsorbed एंटीजन के लिए प्रतिस्पर्धा करते हैं।

immunoblotting- वैद्युतकणसंचलन और एलिसा या आरआईए के संयोजन के आधार पर प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक अत्यधिक संवेदनशील विधि। इम्यूनोब्लॉटिंग का उपयोग एचआईवी संक्रमण आदि के निदान के लिए किया जाता है।

रोगज़नक़ प्रतिजनों को पॉलीएक्रिलामाइड जेल में वैद्युतकणसंचलन द्वारा अलग किया जाता है, फिर जेल से सक्रिय कागज या नाइट्रोसेल्यूलोज झिल्ली में स्थानांतरित किया जाता है और एलिसा का उपयोग करके विकसित किया जाता है। फर्म ऐसे एंटीजन ब्लॉटेड स्ट्रिप्स का उत्पादन करती हैं। इन पट्टियों पर रोगी का सीरम लगाया जाता है। . फिर, ऊष्मायन के बाद, रोगी के अनबाउंड एंटीबॉडी को धोया जाता है और एंजाइम के साथ लेबल किए गए मानव इम्युनोग्लोबुलिन के खिलाफ सीरम लगाया जाता है। . पट्टी पर बने कॉम्प्लेक्स [एंटीजन + रोगी की एंटीबॉडी + मानव आईजी के खिलाफ एंटीबॉडी] का पता एक क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट जोड़कर लगाया जाता है जो एक एंजाइम की क्रिया के तहत रंग बदलता है।

52. इंटरफेरॉन, प्रकृति। प्राप्त करने और उपयोग करने के तरीके।

इंटरफेरॉनप्रतिरक्षा प्रणाली के महत्वपूर्ण सुरक्षात्मक प्रोटीन के अंतर्गत आता है। यह वायरस के हस्तक्षेप के अध्ययन में खोजा गया था, यानी वह घटना जब एक वायरस से संक्रमित जानवर या सेल कल्चर दूसरे वायरस के संक्रमण के प्रति असंवेदनशील हो गए। यह पता चला कि हस्तक्षेप परिणामी प्रोटीन के कारण होता है, जिसमें एक सुरक्षात्मक एंटीवायरल गुण होता है। इस प्रोटीन को इंटरफेरॉन कहा जाता था।

इंटरफेरॉन ग्लाइकोप्रोटीन प्रोटीन का एक परिवार है जो प्रतिरक्षा प्रणाली और संयोजी ऊतक की कोशिकाओं द्वारा संश्लेषित होता है। इंटरफेरॉन को संश्लेषित करने वाली कोशिकाओं के आधार पर, तीन प्रकारों को प्रतिष्ठित किया जाता है: α, β और γ-इंटरफेरॉन।

अल्फा इंटरफेरॉनल्यूकोसाइट्स द्वारा निर्मित, और इसे ल्यूकोसाइट कहा जाता है; बीटा इंटरफेरॉनफाइब्रोब्लास्टिक कहा जाता है, क्योंकि यह फाइब्रोब्लास्ट्स - संयोजी ऊतक कोशिकाओं द्वारा संश्लेषित होता है, और गामा इंटरफेरॉन- प्रतिरक्षा, क्योंकि यह सक्रिय टी-लिम्फोसाइट्स, मैक्रोफेज, प्राकृतिक हत्यारे कोशिकाओं, यानी प्रतिरक्षा कोशिकाओं द्वारा निर्मित होता है।

इंटरफेरॉन को लगातार शरीर में संश्लेषित किया जाता है, और रक्त में इसकी एकाग्रता लगभग 2 आईयू / एमएल (1 अंतरराष्ट्रीय इकाई - एमई इंटरफेरॉन की मात्रा है जो सेल संस्कृति को 1 सीपीई 50 वायरस से बचाता है) पर रखा जाता है। इंटरफेरॉन का उत्पादन वायरस से संक्रमित होने के साथ-साथ इंटरफेरॉन इंड्यूसर के संपर्क में आने पर तेजी से बढ़ता है, उदाहरण के लिए, आरएनए, डीएनए, जटिल पॉलिमर। ऐसे इंटरफेरॉन इंड्यूसर कहलाते हैं इंटरफेरोनोजेन्स

एंटीवायरल प्रभाव के अलावा, इंटरफेरॉन में एंटीट्यूमर सुरक्षा होती है, क्योंकि यह ट्यूमर कोशिकाओं के प्रसार (गुणा) में देरी करता है, साथ ही इम्यूनोमॉड्यूलेटरी गतिविधि, फागोसाइटोसिस, प्राकृतिक हत्यारे कोशिकाओं को उत्तेजित करता है, बी कोशिकाओं द्वारा एंटीबॉडी उत्पादन को नियंत्रित करता है, मुख्य की अभिव्यक्ति को सक्रिय करता है। हिस्टोकम्पैटिबिलिटी कॉम्प्लेक्स।

कारवाई की व्यवस्थाइंटरफेरॉन जटिल है। इंटरफेरॉन सीधे कोशिका के बाहर वायरस को प्रभावित नहीं करता है, लेकिन कोशिकाओं के विशेष रिसेप्टर्स से बांधता है और प्रोटीन संश्लेषण के चरण में कोशिका के अंदर वायरस प्रजनन की प्रक्रिया को प्रभावित करता है।

इंटरफेरॉन उपयोग... इंटरफेरॉन की क्रिया जितनी अधिक प्रभावी होती है, उतनी ही जल्दी यह संश्लेषित होने लगती है या बाहर से शरीर में प्रवेश करती है। इसलिए, इसका उपयोग कई वायरल संक्रमणों में रोगनिरोधी उद्देश्यों के लिए किया जाता है, जैसे कि इन्फ्लूएंजा, साथ ही पुराने वायरल संक्रमणों में चिकित्सीय उद्देश्यों के लिए, जैसे कि पैरेंटेरल हेपेटाइटिस (बी, सी, डी), दाद, मल्टीपल स्केलेरोसिस, आदि। इंटरफेरॉन सकारात्मक देता है घातक ट्यूमर और इम्युनोडेफिशिएंसी से जुड़े रोगों के उपचार में परिणाम।

इंटरफेरॉन प्रजाति-विशिष्ट हैं, यानी मानव इंटरफेरॉन जानवरों के लिए कम प्रभावी है और इसके विपरीत। हालाँकि, यह प्रजाति-विशिष्टता सापेक्ष है।

इंटरफेरॉन प्राप्त करना... इंटरफेरॉन दो तरीकों से प्राप्त किया जाता है: ए) मानव ल्यूकोसाइट्स या लिम्फोसाइट्स को एक सुरक्षित वायरस से संक्रमित करके, जिसके परिणामस्वरूप संक्रमित कोशिकाएं इंटरफेरॉन को संश्लेषित करती हैं, जिसे तब अलग किया जाता है और इससे इंटरफेरॉन की तैयारी का निर्माण किया जाता है; बी) आनुवंशिक रूप से इंजीनियर - इंटरफेरॉन का उत्पादन करने में सक्षम बैक्टीरिया के पुनः संयोजक उपभेदों की औद्योगिक परिस्थितियों में बढ़ रहा है। आमतौर पर, स्यूडोमोनास, एस्चेरिचिया कोलाई के पुनः संयोजक उपभेदों का उपयोग उनके डीएनए में एम्बेडेड इंटरफेरॉन जीन के साथ किया जाता है। आनुवंशिक रूप से इंजीनियर इंटरफेरॉन को पुनः संयोजक कहा जाता है। हमारे देश में, पुनः संयोजक इंटरफेरॉन को आधिकारिक नाम "रीफेरॉन" प्राप्त हुआ है। इस दवा का उत्पादन ल्यूकोसाइट की तुलना में कई मायनों में अधिक कुशल और सस्ता है।

पुनः संयोजक इंटरफेरॉन ने वायरल संक्रमण, नियोप्लाज्म और इम्युनोडेफिशिएंसी के लिए रोगनिरोधी और चिकित्सीय एजेंट के रूप में दवा में व्यापक आवेदन पाया है।