Metode moderne de diagnosticare a infecției cu HIV. Diagnosticul ELISA: care este esența, determinarea anticorpilor, cum se efectuează și pentru ce boli este eficient? Reacția polimerazei în lanț

Diagnosticare la timp Infecția cu HIV devine o măsură extrem de importantă, deoarece inițierea mai devreme a tratamentului poate determina în mare măsură dezvoltare ulterioară boala si prelungesc viata pacientului. ÎN anul trecut S-au înregistrat progrese semnificative în identificarea acestui lucru boală cumplită: Vechile sisteme de testare sunt înlocuite cu altele mai avansate, metodele de examinare devin din ce în ce mai accesibile, iar acuratețea lor crește semnificativ.

În acest articol vom vorbi despre metodele moderne de diagnosticare a infecției cu HIV, a căror cunoaștere este utilă tratament în timp util această problemă și menținerea calității normale a vieții pacientului.

Metode de diagnosticare HIV

În Rusia, se efectuează o procedură standard pentru a diagnostica infecția cu HIV, care include două niveluri:

• ELISA sistem de testare(analiza screening);
• imunoblot (IB).

Pentru diagnosticare pot fi utilizate și alte metode:

• teste rapide.

Sisteme de testare ELISA

În prima etapă a diagnosticului, un test de screening (ELISA) este utilizat pentru a detecta infecția cu HIV, care se bazează pe proteinele HIV create în laboratoare care captează anticorpi specifici produși în organism ca răspuns la infecție. După interacțiunea lor cu reactivii (enzimele) sistemului de testare, culoarea indicatorului se schimbă. În continuare, aceste modificări de culoare sunt procesate cu ajutorul unor echipamente speciale, care determină rezultatul analizei efectuate.

Astfel de teste ELISA pot arăta rezultate în câteva săptămâni de la introducerea infecției cu HIV. Acest test nu determină prezența virusului, ci detectează producția de anticorpi împotriva acestuia. Uneori, în corpul uman, producția de anticorpi împotriva HIV începe după 2 săptămâni de infecție, dar la majoritatea oamenilor aceștia sunt produși pentru mai mult timp. mai tarziu, după 3-6 săptămâni.

Există patru generații de teste ELISA cu sensibilități diferite. În ultimii ani, au fost din ce în ce mai utilizate sisteme de testare de generația a treia și a patra, care se bazează pe peptide sintetice sau proteine ​​recombinate și au o specificitate și o precizie mai mare. Acestea pot fi utilizate pentru a diagnostica infecția cu HIV, pentru a monitoriza prevalența HIV și pentru a asigura siguranța în timpul testării sânge donat. Precizia sistemelor de testare ELISA din generațiile III și IV este de 93-99% (testele produse în Europa de Vest sunt mai sensibile - 99%).

Pentru a efectua un test ELISA, se prelevează 5 ml de sânge din vena pacientului. Între ultima masă și analiză trebuie să treacă cel puțin 8 ore (de obicei se face dimineața pe stomacul gol). Se recomandă efectuarea unui astfel de test nu mai devreme de 3 săptămâni de la infecția suspectată (de exemplu, după un contact sexual neprotejat cu un nou partener sexual).

Rezultatele testului ELISA se obțin în 2-10 zile:

• rezultat negativ: indică absența infecției cu HIV și nu necesită contactarea unui specialist;
• rezultat fals negativ: poate fi observat pe primele etape infecție (până la 3 săptămâni), cu stadii târzii SIDA cu imunosupresie severă și pregătirea necorespunzătoare a sângelui;
• rezultat fals pozitiv: poate fi observat în unele boli și în caz de pregătire necorespunzătoare a sângelui;
• rezultat pozitiv: indică infecția cu HIV, necesită efectuarea unui IB și contactarea pacientului cu un specialist la centrul SIDA.

De ce poate un test ELISA să dea rezultate fals pozitive?

Rezultatele fals pozitive ale testelor HIV ELISA pot apărea din cauza procesării necorespunzătoare a sângelui sau la pacienții cu următoarele afecțiuni și boli:

• mielom multiplu;
• boli infecțioase cauzate de virusul Epstein-Barr;
• stare dupa ;
• boală autoimună;
• pe fundalul sarcinii;
• starea după vaccinare.

Din motivele descrise mai sus, anticorpii nespecifici cu reacție încrucișată pot fi prezenți în sânge, a căror producție nu a fost provocată de infecția cu HIV.

În ultimii ani, frecvența rezultatelor fals pozitive a scăzut semnificativ datorită utilizării sistemelor de testare din generațiile III și IV, care conțin peptide mai sensibile și proteine ​​recombinante (sunt sintetizate folosind Inginerie genetică in vitro). După introducerea unor astfel de teste ELISA, frecvența rezultatelor fals pozitive a scăzut semnificativ și este de aproximativ 0,02-0,5%.

Un rezultat fals pozitiv nu înseamnă că persoana este infectată cu HIV. În astfel de cazuri, OMS recomandă efectuarea unui alt test ELISA (neapărat generația IV).

Sângele pacientului este trimis la un laborator de referință sau de arbitraj cu marcajul „repetare” și testat folosind un sistem de testare ELISA de generația IV. Dacă rezultatul noii analize este negativ, atunci primul rezultat este considerat eronat (fals pozitiv) și IS nu este efectuat. Dacă rezultatul este pozitiv sau discutabil în timpul celui de-al doilea test, pacientul trebuie să fie supus IB după 4-6 săptămâni pentru a confirma sau infirma infecția cu HIV.

Blotting imun

Un diagnostic final al infecției cu HIV poate fi pus doar după obținerea unui rezultat pozitiv. imunoblotting(IB). Pentru a-l realiza, se folosește o bandă de nitroceluloză, pe care se aplică proteine ​​virale.

Prelevarea de sânge pentru IB se efectuează dintr-o venă. În continuare, suferă o prelucrare specială, iar proteinele conținute în serul său sunt separate într-un gel special în funcție de sarcina și greutatea moleculară a acestora (manipularea se realizează folosind echipamente speciale sub influența unui câmp electric). Pe gelul de ser sanguin se aplică o bandă de nitroceluloză și se efectuează blotting („blotting”) într-o cameră specială. Banda este procesată și dacă materialele folosite conțin anticorpi împotriva HIV, aceștia se leagă de benzile antigenice de pe IB și apar ca linii.

IB este considerat pozitiv dacă:

• conform criteriilor americane CDC - există două sau trei linii gp41, p24, gp120/gp160 pe bandă;
• conform criteriilor FDA americane, banda are două linii p24, p31 și o linie gp41 sau gp120/gp160.

În 99,9% din cazuri, un rezultat pozitiv IB indică infecția cu HIV.

Dacă nu există linii, IB este negativ.

La identificarea liniilor cu gr160, gr120 și gr41, IB este îndoielnic. Acest rezultat poate apărea atunci când:

• boli oncologice;
• sarcina;
• transfuzii de sânge frecvente.

În astfel de cazuri, se recomandă repetarea studiului folosind un kit de la o altă companie. Dacă după IB suplimentar rezultatul rămâne îndoielnic, atunci observarea este necesară timp de șase luni (IB se efectuează la fiecare 3 luni).

Reacția polimerazei în lanț

Un test PCR poate detecta ARN-ul virusului. Sensibilitatea sa este destul de mare și permite detectarea infecției cu HIV în 10 zile de la infectare. În unele cazuri, PCR poate da rezultate fals pozitive, deoarece sensibilitatea sa ridicată poate răspunde și la anticorpii la alte infecții.

Această tehnică de diagnosticare este costisitoare și necesită echipamente speciale și specialiști cu înaltă calificare. Aceste motive nu fac posibilă efectuarea de teste în masă a populației.

PCR este utilizată în următoarele cazuri:

• depistarea HIV la nou-născuții născuți din mame infectate cu HIV;
• pentru a detecta HIV în „perioada fereastră” sau în caz de IB îndoielnic;
• pentru a controla concentrația HIV în sânge;
• pentru studiul sângelui donatorului.

Testul PCR singur nu pune un diagnostic de HIV, ci este efectuat ca a metoda suplimentara diagnosticare pentru a rezolva situații controversate.

Metode exprese

Una dintre inovațiile în diagnosticarea HIV sunt testele rapide, ale căror rezultate pot fi evaluate în 10-15 minute. Cele mai eficiente și precise rezultate se obțin cu ajutorul testelor imunocromatografice bazate pe principiul fluxului capilar. Sunt benzi speciale pe care se aplică sânge sau alte fluide de testare (salivă, urină). Dacă sunt prezenți anticorpi împotriva HIV, după 10-15 minute pe test apare o bandă colorată și de control - un rezultat pozitiv. Dacă rezultatul este negativ, apare doar banda de control.

Ca și în cazul testelor ELISA, rezultatele testelor rapide trebuie confirmate prin analiza IB. Numai după aceasta se poate face un diagnostic de infecție cu HIV.

Există kituri de testare rapidă la domiciliu disponibile. Testul OraSure Technologies1 (SUA) este aprobat de FDA, disponibil la ghișeu și poate fi folosit pentru a detecta HIV. După test, dacă rezultatul este pozitiv, pacientului i se recomandă să fie supus unei examinări la un centru specializat pentru confirmarea diagnosticului.

Alte teste pentru uz casnic nu au fost încă aprobate de FDA și rezultatele lor pot fi foarte discutabile.

În ciuda faptului că testele rapide sunt inferioare ca precizie față de testele ELISA de generația IV, acestea sunt utilizate pe scară largă pentru testarea suplimentară a populației.

Puteți face teste pentru depistarea infecției cu HIV la orice clinică, spital central raional sau centre specializate SIDA. Pe teritoriul Rusiei, acestea se desfășoară în mod absolut confidențial sau anonim. Fiecare pacient poate conta pe primirea medicală sau consultatie psihologicaînainte sau după analiză. Va trebui să plătiți doar pentru testele HIV în reclamă institutii medicale, si in clinici de stat iar spitalele se efectuează gratuit.

Citiți despre modalitățile prin care vă puteți infecta cu HIV și ce mituri există despre posibilitățile de a vă infecta.

Descriere

Pregătirea

Indicatii

Interpretarea rezultatelor

Descriere

Metoda de determinare Testul imunosorbent legat de enzime (ELISA).

Material în studiu Ser de sânge

Vizita la domiciliu disponibila

Detectarea combinată a anticorpilor la HIV tipurile 1 și 2 și a antigenului HIV p24, test calitativ.

Atenţie. În cazul reacțiilor pozitive și discutabile, perioada de eliberare a rezultatelor poate fi prelungită la 10 zile lucrătoare. HIV (virusul imunodeficienței umane), care provoacă SIDA (sindromul imunodeficienței dobândite), aparține familiei retrovirusurilor. Se transmite de la persoană la persoană prin utilizarea de ace și seringi contaminate. administrare intravenoasă droguri sau proceduri terapeutice, la contacte sexuale, atât heterosexuali cât și homosexuali. Transmiterea virusului poate avea loc prin transfuzie sânge infectatși produsele sale, donarea de organe sau material seminal, lucrătorii medicali- atunci când este rănit de ace sau instrumente infectate. Infecția cu HIV poate apărea prin transmiterea de la o mamă infectată la copilul ei ( cale verticală), deși metodele moderne de prevenire care utilizează terapia antiretrovială, dacă toate recomandările sunt respectate, pot reduce acest risc la minimum.

Procesul de interacțiune a unui virus cu o celulă include o serie de etape: legarea virusului de celulă, eliberarea acestuia din plic, pătrunderea în citoplasmă, sinteza ADN-ului folosind ARN viral, integrarea ADN-ului viral în genomul celula gazdă. După aceasta începe stadiu latent infectii. În această stare, ADN-ul proviral poate exista o perioadă de timp fără a prezenta activitate și fără a afecta viața celulei gazdă. Deși nu există o expresie a proteinelor virale, nu există niciun răspuns imun la virus. Anticorpii împotriva HIV, care caracterizează răspunsul imun al organismului, apar după activarea ADN-ului viral și începutul reproducerii active a virusului. Durata perioadei latente depinde de o serie de factori, inclusiv de caracteristicile genetice individuale ale organismului.

Anticorpii împotriva HIV pot apărea începând cu a doua săptămână după infectare; continutul lor creste in 2-4 saptamani si ramane multi ani. La 90-95% dintre persoanele infectate apar în primele trei luni după infectare, la 5-9% - în perioada de la trei până la șase luni, în 0,5-1% - la o dată ulterioară.

În primele săptămâni de infecție, chiar înainte de apariția anticorpilor împotriva virusului (adică înainte de seroconversie), prezența antigenelor HIV, inclusiv a proteinei capsidei p24, poate fi detectată în probele de ser sau plasmă. Mai târziu, după seroconversie, devine de obicei nedetectabil.

Sistemele de testare combinate de generația a 4-a, care includ testul HIV Ag/Ab Combo (Arhitect, Abbott), detectează atât anticorpii la HIV tipurile 1 și 2, cât și antigenul HIV p24, ceea ce permite detectarea precoce a infecției. Caracteristicile speciale ale testului de screening utilizat în laboratorul INVITRO pentru depistarea infecției cu HIV includ specificitatea ridicată a studiului (> 99,5%); Testul este 100% sensibil la anticorpii caracteristici perioadei de seroconversie, iar sensibilitatea testului la antigenul p24 este de aproximativ 18 pg/ml.

Procedura de efectuare a unei examinări de laborator pentru HIV este strict reglementată de ordinele Ministerului Sănătății al Federației Ruse și include etapa unui studiu de screening (selecție) a prezenței anticorpilor la HIV utilizând testul imunosorbent legat de enzime (ELISA). metode aprobate pentru utilizare, și stadiul unui studiu de verificare (confirmare) mai detaliat în laboratorul centrului SIDA al orașului. Trebuie remarcat faptul că nici cele mai bune sisteme ELISA de screening nu garantează o specificitate de 100%, adică există o anumită probabilitate de a obține rezultate nespecifice, fals pozitive, asociate cu caracteristicile serului sanguin al pacientului. Prin urmare, un rezultat pozitiv al unei examinări ELISA de screening poate să nu fie confirmat în testele de confirmare, după care pacientului i se va da un rezultat negativ sau nedeterminat. Dacă rezultatul studiului de confirmare este incert, testarea trebuie repetată în timp după 2-3 săptămâni.

Diagnosticul de laborator infecție cu HIV Copiii născuți din mame infectate cu HIV au propriile lor caracteristici. Anticorpii materni împotriva HIV (clasa IgG) pot circula în sângele lor timp de până la 18 luni din momentul nașterii. Absența anticorpilor împotriva HIV la nou-născuți nu înseamnă că virusul nu a pătruns în bariera placentară. Copiii mamelor infectate cu HIV sunt supuși examinării diagnostice de laborator în termen de 36 de luni de la naștere.

Pregătirea

Antrenament special nu este necesar. Se recomandă extragerea sângelui nu mai devreme de 4 ore după ultima intalnire alimente. Recomandări generale pentru pregătirea pentru cercetare pot fi găsite. Este recomandabil să se efectueze un test pentru a detecta antigenul și anticorpii HIV nu mai devreme de două săptămâni de la o posibilă infecție, cu un test repetat după trei și șase săptămâni în cazul unui rezultat negativ. Cererile de cercetare la INVITRO SRL se completează cu un pașaport sau un document care îl înlocuiește (carte de migrare, înregistrare temporară la locul de reședință, legitimație de personal militar, certificat de la oficiul de pașapoarte în caz de pierdere a pașaportului, carte de înregistrare de la un hotel). Documentul prezentat trebuie să conțină în mod necesar informații despre înregistrarea temporară sau permanentă în Federația Rusă și o fotografie. În lipsa unui pașaport (un document care îl înlocuiește), pacientul are dreptul de a completa o cerere anonimă pentru donarea de biomaterial. În cadrul unei examinări anonime, a unei cereri și a unei mostre de biomaterial primite de la client, i se atribuie un număr care este cunoscut doar de pacient și de personalul medical care a plasat comanda. ! Rezultatele studiilor efectuate anonim nu pot fi depuse pentru internare, examene profesionale si nu fac obiectul inregistrarii in ORUIB.

Indicatii de utilizare

• Ganglioni limfatici măriți în mai mult de două zone.
• Leucopenie cu limfopenie.
• Transpirații nocturne.
• Pierdere bruscă în greutate de cauză necunoscută.
• Diaree de mai mult de trei săptămâni de cauză necunoscută.
• Febră de cauză necunoscută.
• Planificarea sarcinii.
• Pregătirea preoperatorie, spitalizare.
• Detectarea următoarelor infecții sau combinații ale acestora: tuberculoză, toxoplasmoză manifestă, infecție frecventă cu herpesvirus, candidoză organe interne, nevralgii repetate herpes zoster cauzate de micoplasme, pneumocystis sau pneumonie cu legionella.
• Sarcomul lui Kaposi la o vârstă fragedă.
• Contacte sexuale ocazionale.

Interpretarea rezultatelor

Interpretarea rezultatelor cercetării conține informații pentru medicul curant și nu reprezintă un diagnostic. Informațiile din această secțiune nu trebuie utilizate pentru auto-diagnosticare sau auto-tratament. Diagnostic precis este determinată de medic, folosind atât rezultatele acestei examinări, cât și informațiile necesare din alte surse: antecedente medicale, rezultatele altor examinări etc.

Unitati de masura in Laboratorul Independent INVITRO: test calitativ. Forma de prezentare a rezultatelor: în absența anticorpilor împotriva antigenului HIV 1 și 2 și p24, răspunsul este „negativ”. Dacă sunt detectați anticorpi la HIV sau un antigen într-un test de screening imunosorbent legat de enzime, o probă de ser este trimisă pentru confirmare prin imunoblot la centrul orașului SIDA, care verifică rezultatele pozitive și nedeterminate.

Rezultat pozitiv:

1. infecție cu HIV;
2. rezultat fals pozitiv care necesită repetare sau cercetări suplimentare*);
3. studiul nu este informativ la copiii sub 18 luni născuți din mame infectate cu HIV.

*Specificitatea sistemului de teste de screening Anticorpi la HIV 1 și 2 și antigen HIV 1 și 2 (HIV Ag/Ab Combo, Abbott), conform estimărilor furnizate de producătorul de reactiv, este de aproximativ 99,6% atât în ​​populația generală, cât și în grupați pacienții cu potențiale interferențe (infecții HBV, HCV, rubeolă, HAV, EBV, HNLV-I, HTLV-II, E.coli, Chl.trach. etc., patologii autoimune (inclusiv artrita reumatoida, prezența anticorpilor antinucleari), sarcină, nivel crescut IgG, IgM, gammapatii monoclonale, hemodializă, transfuzii multiple de sânge).

Infecția cu HIV este clasificată ca o boală necontrolată din cauza lipsei de metode pentru aceasta prevenirea specificăși eficacitatea insuficientă a terapiei. Prin urmare, pentru control situația epidemiologică pentru infecția cu HIV, în prezent sunt utilizate în principal testele de screening studii de diagnostic. Locul de frunte între metodele de diagnosticare a infecției cu HIV este ocupat de testul imunosorbent legat de enzime (ELISA), care face posibilă identificarea markerilor serologici ai agentului patogen la persoanele examinate. a acestei boli.

Acest raport prezintă rezultatele determinării anticorpilor la HIV în serul sanguin a 40.823 de persoane, care au inclus pacienți din clinici prenatale, clinici, spitale din oraș, precum și centre medicale specializata in examinarea si tratamentul pacientilor cu risc (dependenti de droguri, pacienti cu hepatita virala B, C si boli venerice). Studiile au fost efectuate în anul 2005 în laboratorul de imunologie al Institutului de Cercetare de Obstetrică și Ginecologie, care poartă numele. INAINTE DE. Ott RAMS, care are o experiență de peste 15 ani în utilizarea metodelor ELISA pentru diagnosticarea diferitelor boli infecțioase.

Pentru examinarea inițială a probelor de ser de sânge, am folosit sistemul de testare „CombiBest anti-HIV-1+2” (ZAO „Vector-Best”, Novosibirsk), care detectează anticorpii specifici totali la HIV-1 și HIV-1 în probe examinate de ser sau plasmă umană 2 (imunoglobuline clasele A, G și M). În acest kit de diagnostic, proteinele recombinate HIV sunt utilizate atât pentru imobilizarea în godeurile plăcilor, cât și sub formă de conjugat cu peroxidază de hrean. Rezultatele analizei serului au fost evaluate în conformitate cu recomandările instrucțiunilor pentru sistemul de testare: probele testate au fost considerate negative (fără anticorpi pentru HIV-1 și HIV-2), a căror densitate optică (OD) în ELISA nu a depășit valoarea OPcrit.

La screening-ul în laborator, a fost obținut un rezultat ELISA negativ pentru 40.222 (98,5%) din 40.823 probe de ser și 601 (1,5%) dintre probele testate au fost considerate inițial pozitive. Ca rezultat al analizei repetate a fiecăruia dintre cele 601 seruri în duplicat (două godeuri ale plăcii) în ziua următoare, 440 (73,2%) probe au fost determinate a fi pozitive și 161 (26,8%) au fost determinate a fi negative. În conformitate cu recomandările Ministerului Sănătății și Dezvoltării Sociale, 440 de seruri screening-pozitive au fost congelate și transferate pentru studii de confirmare suplimentare la biroul de consultanță și diagnostic al laboratorului de referință al spitalului nr. 30 denumit după. S.P. Botkina. Aceste studii au fost efectuate folosind sisteme de testare imunoenzimatică „EKOlab-Vironostika HIV 1.2 Ag/Ab” („EKOlab”, Elektrogorsk), „Genscreen Plus” HIV Ag-Ab” („BioRad”, SUA), precum și truse pentru imunoblot. Rezultatele analizei a 440 de seruri în teste de confirmare au condus la concluzia că 323 (73,4%) probe au fost pozitive, iar 102 (23,2%) au fost negative. Pentru 15 probe testate (3,4%) s-a obținut un rezultat analitic nedeterminat.

Trebuie menționat că valorile DO obținute în laboratorul nostru în timpul testării lor inițiale folosind sistemul de testare CombiBest anti-HIV-1+2 pentru 314 (97,2%) dintre aceste 323 de seruri pozitive au variat între 0,900 și 1,780 și pentru 9. (2,8%) probe – 0,500–0,900. Valorile DO obținute din screeningul a 102 seruri negative pentru 52 de probe (51%) au variat între 0,195 și 0,400; pentru 40 (39,2%) probe – 0,401–0,800; 10 (9,8%) mostre – mai mult de 0.800.

Astfel, în urma lucrărilor efectuate, s-a demonstrat că examinarea inițială a serului sanguin pentru prezența markerilor serologici ai infecției cu HIV folosind sistemul de testare CombiBest anti-HIV-1+2 este foarte eficientă. Rezultatele pozitive ale screeningului au fost confirmate prin teste suplimentare în laboratorul de referință în 73% din cazuri, iar rezultate fals pozitive au fost înregistrate doar pentru 0,25% din 40.823 seruri analizate.

Deținătorii brevetului RU 2283497:

Invenția se referă la domeniul biotehnologiei și medicinei. Sistemul de testare imunoabsorbant legat de enzime pentru identificarea spectrului de anticorpi la virusul imunodeficienței umane (HIV) de primul și al doilea tip, primul tip de grup O și identificarea antigenului la virusul imunodeficienței umane de primul tip p24 include un imunosorbent bazat pe antigene ale virusului imunodeficienței umane reprezentând gp41 (env HIV-1 și HIV-2 grupa O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV-2), anticorpi la antigenul HIV 1 p24 și reactivii de detecție, antigenii HIV de mai sus și anticorpii HIV absorbiți în diferite godeuri ale plăcilor pentru testul imunosorbant legat de enzime și plăci cu 96 de godeuri din polistiren pliabile sau neseparabile sunt utilizate pentru sorbție. Invenția asigură o sensibilitate crescută, simplificare și eliminarea subiectivității în evaluarea rezultatelor. 1 salariu dosare, 10 tabele, 1 ill.

Invenția se referă la domeniul biotehnologiei și medicinei. Utilizare: detectarea diferențiată a tuturor claselor de anticorpi specifici la proteinele 1 și 2 ale virusului imunodeficienței umane, HIV 1 grup O și antigen HIV 1 p24.

Esență: obținerea unui sistem de testare imunosorbantă legată de enzime pentru identificarea spectrului de anticorpi de toate clasele împotriva proteinelor individuale și HIV 1 și 2, HIV 1 grup O și HIV 1 p24 antigen în serul sanguin (plasmă), imunoglobulinele și produsele din sânge uman în pentru a identifica spectrul de anticorpi la HIV 1 și 2, HIV 1 grup O, detectarea antigenului HIV 1 p24 și confirmarea rezultatelor de screening pozitive sau discutabile pentru anticorpii HIV 1 și 2, HIV 1 grup O și antigen HIV 1 p24.

DESCRIEREA INVENŢIEI

Diagnosticul de laborator al infecției cu HIV se bazează pe trei domenii: a) indicarea HIV și a componentelor acestuia; b) detectarea anticorpilor la HIV; c) determinarea modificărilor sistemului imunitar. Printre metode existente diagnostic de laborator cele mai frecvente sunt serologice – detectarea anticorpilor la antigeni virali.

Pentru a detecta anticorpii în infecția cu HIV, testul imunosorbent legat de enzime (ELISA) și imunoblotting (IB) sunt utilizate în principal. ELISA se bazează pe imobilizarea antigenelor virale pe plăci de care se leagă anticorpii pacientului, iar complexul antigen-anticorp este detectat folosind anticorpi monoclonali de șoarece conjugați cu peroxidază de hrean la imunoglobulinele umane G și M. Metoda este destul de specifică și sensibilă și permite detectarea anticorpilor specifici virusului la 95% dintre pacienți. Restul de 5% din cazuri apar în stadiile incipiente ale infecției, când sunt încă puțini anticorpi în serul sanguin, sau în fazele terminale ale bolii, când organismul nu mai este capabil să sintetizeze anticorpi din cauza epuizării severe. sistem imunitar. Rezultatele ELISA fals pozitive sunt, de asemenea, posibile, în principal la pacienții cu autoimune și boli oncologice, precum și pentru infecția cauzată de virusul Ashtein-Barr. În acest caz, o reacție încrucișată a anticorpilor la factor reumatoid, Virusul Epstein-Barr sau la determinanții antigenici care sunt similari cu proteinele complexului major de histocompatibilitate clasa 1 și 2 (HLA-4 și DQW3) și au capacitatea de a se lega de antigenele HIV. Rezultatele fals pozitive sunt frecvente la femeile însărcinate și la vârstnici. Hemoliza, lipemia și contaminarea bacteriană a serului pot provoca, de asemenea, rezultate nesigure.

În acest sens, au fost propuse și utilizate o serie de metode pentru a testa specificitatea rezultatelor detectării anticorpilor. Dintre aceste metode, cea mai frecvent utilizată reacție este „blotting imun” în modificarea „Western Blot”. Esența metodei este următoarea: în prima etapă, proteinele HIV sunt separate în funcție de greutatea moleculară folosind electroforeza pe gel de poliacrilamidă. Transferul electroforetic este apoi efectuat de la gelul de poliacrilamidă la suprafața membranei de nitroceluloză. Antigenele transferate în acest mod sunt detectate pe membrană folosind analiza indirectă: membrana este incubată cu materialul de testat; anticorpii conținuti se leagă la antigenele HIV transferate pe o membrană de nitroceluloză, apoi benzile de membrană sunt incubate cu conjugatul; Când se formează un complex antigen-anticorp, conjugatul se atașează de acesta; după spălarea din conjugat și incubarea cu substratul, are loc colorarea în acele zone de nitroceluloză în care a avut loc formarea complexului antigen-anticorp-conjugat. Desenul prezintă exemple de rezultate pozitive, slab pozitive și negative ale imunoblot.

Anticorpii la următoarele proteine ​​(p) și glicoproteine ​​(gp) sunt detectați în serul persoanelor infectate cu HIV-1 și HIV-2: Tabelul A.

Tabelul B prezintă criteriile de evaluare a rezultatelor imunoblotării recomandate de OMS și centru rusesc privind prevenirea și combaterea SIDA.

Pe baza criteriilor OMS, serurile în care sunt detectați anticorpi la oricare două proteine ​​ale anvelopei HIV-1 prin metoda IB sunt considerate pozitive. Dacă există o reacție doar cu una dintre proteinele învelișului (gp160, gp120, gp41) în combinație cu sau fără o reacție cu alte proteine, rezultatul este considerat îndoielnic. Potrivit Centrului Federal Științific și Metodologic al Ministerului Sănătății al Federației Ruse pentru Prevenirea și Controlul SIDA, este posibil să se interpreteze serurile ca pozitive chiar și în prezența anticorpilor la o singură proteină membranară.

Detectarea anticorpilor la antigenul p24 poate indica perioada de debut a seroconversiei, deoarece anticorpii la această proteină apar primii. Reacțiile pozitive cu proteinele gag și pol fără prezența unei reacții cu proteinele env pot reflecta stadiul de seroconversie timpurie și, de asemenea, pot indica prezența infecției HIV-2 sau o reacție nespecifică.

Utilizarea reacției de imunoblotare ca metodă expertă pentru diagnosticarea HIV are o serie de dezavantaje semnificative:

1. Imposibilitatea confirmării depistarii antigenului HIV p24 1 în cazul utilizării testelor care detectează simultan antigenul și anticorpii HIV, ceea ce face inadecvată (fără sens) utilizarea testelor de screening pentru depistarea simultană a antigenului și a anticorpilor HIV ( Ordinul Ministerului Sănătății al Federației Ruse nr. 292 din 30 iulie 2001: „pentru a examina donatorii în stațiile de transfuzie de sânge, este necesar să se utilizeze sisteme de testare care detectează simultan antigenul și anticorpii HIV”).

2. Detectarea numai a anticorpilor din clasa IgG. Este imposibil să se confirme pe deplin rezultatele pozitive obținute folosind teste de generația a 3-a și a 4-a (detectarea anticorpi IgGși IgM).

3. Subiectivitatea în interpretarea scorurilor testelor, în special în cazurile de rezultate „dubioase” și „incerte” și în etapele inițiale seroconversie (benzile detectate pe membranele de nitroceluloză în aceste cazuri sunt neclare, abia vizibile cu ochiul liber și atunci când se evaluează de persoane diferite sunt adesea dezacorduri).

4. Imposibilitatea evaluării cantitative automatizate a rezultatelor analizei.

5. Sensibilitate mai mică comparativ cu ELISA.

6. Perioada de valabilitate scurtă (în timpul depozitării, benzile de membrană de nitroceluloză se estompează și nu pot fi o confirmare obiectivă a detectării sau nedetecției HIV în cazuri controversate).

7. Dificultate în configurarea reacției și depozitare (benzile de membrană de nitroceluloză sunt foarte fragile și se sparg adesea).

8. Costul ridicat al truselor de securitate a informațiilor.

Un reactiv cunoscut este un kit pentru determinarea simultană a antigenelor și anticorpilor la același agent patogen, inclusiv HIV (DE 4236189 F1, 28.04.1994). Cu toate acestea, nu este dezvăluit un sistem de testare care permite diagnosticarea infecției cu HIV în diferite stadii.

Obiectivul prezentei invenții este de a obține un sistem de testare cu care să fie posibilă confirmarea rezultatelor pozitive sau discutabile ale testelor de screening pentru anticorpi la HIV 1 și 2, HIV 1 grup O și HIV 1 p24 antigen atunci când se utilizează teste pentru detecția simultană. de antigene și anticorpi.

Soluția tehnică propusă este realizată printr-un sistem de testare imunosorbantă legată de enzime pentru identificarea spectrului de anticorpi împotriva virusului imunodeficienței umane (HIV) de primul și al doilea tip, primul tip de grup O și identificarea antigenului p24 la imunodeficiența umană. virus de primul tip p24, caracterizat prin aceea că include un imunosorbant pe bază de antigene virusul imunodeficienței umane, reprezentând gp41 (env HIV-1 și HIV-2 grupa O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol) , gp36 (env HIV-2), anticorpi la antigenul HIV 1 p24 și reactivii de detecție, în timp ce antigenele HIV și anticorpii HIV menționați mai sus sunt adsorbiți în diferite godeuri ale plăcilor de test imunosorbant legat de enzime.

În plus, pentru sorbție sunt utilizate plăci de polistiren pliabile sau nedemontabile cu 96 de godeuri pentru imunotestul enzimatic.

Rezultatul tehnic obținut prin prezenta invenție este posibilitatea confirmării rezultatelor pozitive pentru anticorpii HIV 1 și 2, HIV 1 grup O și HIV 1 p24 antigen, sensibilitate ridicată, posibilitatea interpretării automate a rezultatelor, ceea ce elimină subiectivitatea evaluare, ușurința efectuării testului, mai puțin decât cu seturile existente de securitate a informațiilor de cost.

Această soluție tehnică diferă de cele cunoscute:

1. Utilizarea unei plăci pentru reacții imunologice ca purtător în fază solidă.

2. Utilizare simultană ca sorbent de anticorpi la HIV p 24 și un set de antigeni HIV.

Invenţia este ilustrată prin următorul exemplu.

Principiile active ale sistemului de testare dezvoltat „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AG p24 HIV 1” sunt:

Imunosorbent - antigeni recombinanți similari cu proteinele structurale ale HIV-1: gp41 (env HIV-1 și HIV 1 grupa O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), HIV-2: gp36 (env) și anticorpi monoclonali de șoarece la antigenul HIV 1(p24), adsorbiți separat pe benzi dintr-o placă pliabilă din polistiren.

Pentru a pregăti utilizarea imunosorbanților:

1. HIV-1 gp41 este o proteină produsă de tulpina E. Coli nr. AHIV 103.

2. HIV-1 gp120 este o proteină produsă de tulpina E. Coli nr. AHIV 109.

3. HIV-1 p24 este o proteină produsă de tulpina E. Coli nr. AHIV 105.

4. HIV-1 p31 este o proteină produsă de tulpina E. Coli nr. AHIV 108.

5. HIV-2 p36 este o proteină produsă de tulpina E. Coli nr. AHIV 106.

Conjugatul 1, liofilizat sau lichid, este un anticorp monoclonal de șoarece la antigenul HIV1 p24 conjugat cu biotină.

1. Conjugatul 2, liofilizat sau lichid, este un amestec de antigene recombinante similare cu proteinele structurale ale HIV-1: gp41 (env HIV-1 si HIV 1 grupa O), gp120 (env), p24 (gag), p31( po1); HIV-2: gp36 (env), conjugat cu biotină;

2. Conjugatele 3, 4 - liofilizate sau lichide - streptavidină, marcate cu peroxidază de hrean;

În timpul studiilor preliminare, a fost selectat proiectarea sistemului de testare, a fost dezvoltată tehnologia de preparare a componentelor acestuia și au fost optimizate condițiile de desfășurare a reacției imunoenzimatice.

La efectuarea ELISA în sistemul de testare „DS - ELISA - ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + Ag p24 HIV 1”, se adaugă 25 μl de conjugat-1 în godeurile plăcii cu anticorpi absorbiți la p24 și 25 μl. de conjugat-1 se adaugă în godeurile cu antigene sorbite.25 µl de conjugat-2. Schema de reacție este prezentată mai jos. Apoi, în fiecare godeu se adaugă 25 μl de probă de testat. În același timp, în godeurile cu antigeni culoarea se schimbă de la portocaliu la roz, iar în godeul cu anticorpi - de la verde la gri. Amestecul este incubat timp de 45 de minute la 37°C pe un agitator (sau 1 oră la 37°C într-un termostat). Apoi, fără spălare, adăugați 50 μl de conjugat-3 în godeurile plăcii pentru determinarea antigenului p24 și 50 μl de conjugat-4 în godeurile pentru determinarea anticorpilor. După incubare timp de 20 de minute la 37°C pe un agitator (sau 30 de minute la 37°C într-un termostat), placa este spălată și dezvoltată cu un amestec de substrat. Timpul total reacții 1 oră 25 minute (sau 1 oră 50 minute). Antigenul p24 prezent în proba de testat se leagă de anticorpi monoclonali la p24, iar anticorpii specifici formează un complex cu antigeni recombinanți de pe placă. Complexul imun rezultat al anti-p24 cu p24 este detectat cu conjugați anti-p24-biotină, apoi cu streptavidin-peroxidază, iar complexele imune Ag-HIV cu At-HIV sunt detectate cu un conjugat Ag-biotină, apoi cu streptavidin- peroxidaza.

Schema de stabilire a reacției.

Rezultatele sunt luate în considerare spectrofotometric la două lungimi de undă: 450/620-680 nm cu dispozitivul configurat „pe aer”. Să luăm în considerare rezultatele la o lungime de undă de 450 nm.

Rezultatele analizei sunt luate în considerare dacă valorile medii ale densității optice (OD) în godeurile cu K- nu sunt mai mari de 0,2, în godeurile cu K+ - nu mai puțin de 1,0. OP crit. calculat prin formula:

OP crit. gp41 = mediu sens OP K-(gp41)+0,15

OP crit. gp120 = mediu sens OP K-(gp120)+0,15

OP crit. p24 = mediu sens OP K-(р24)+0,15

OP crit. p31 = mediu sens OP K-(р31)+0,15

OP crit. gp36 = mediu sens OP K-(gp36)+0,15

OP crit. Ag p24 = medie. sens OP k- (Ag p24)+0,04

unde 0,15 și 0,04 sunt coeficienți stabiliți prin prelucrare statistică la producător. În timpul dezvoltării sistemului de testare au fost utilizate următoarele:

1. Probe de ser de sânge de la donatori sănătoși (n=610).

2. Probe de ser de sânge de la pacienți cu diverse boli infecțioase fără legătură cu HIV (infecții respiratorii acute, pneumonie, amigdalita, herpetică și infecție cu citomegalovirus, sifilis, chlamydia, hepatita virala A, B și C (n=224)).

3. Probe de ser de sânge de la pacienți cu diverse boli neinfecțioase - traumatisme, boli ale sistemului cardiovascular, oncologie (n=35).

4. Probele de ser sanguin de la gravide (n=40).

5. Probele de ser de sânge seropozitive în ELISA și confirmate în imunoblot (n=428).

6. Probe de ser cu rezultat pozitiv obținut în sisteme de testare imunoenzimatică pentru determinarea simultană a anticorpilor HIV 1.2 și a antigenului p24 și rezultat nedeterminat prin imunoblot (n=123).

7. Panoul intern de seruri care conțin și nu conțin anticorpi la HIV 1,2, testate pe sisteme de testare imunoenzimatică și imunoblot înregistrate de Ministerul Sănătății al Federației Ruse (n=21).

8. Standard „STANDARD ANTIGEN HIV 1”, „BIO RAD”, Franța, cat. Nr. 72217, care este un antigen obţinut din lizat viral.

9. Standardul intern al întreprinderii. O probă care conține antigen p 24 la o concentrație de 200 pg/ml, obținută din lizat viral și titrată conform „HIV 1 ANTIGEN STANDARD” companie „BIO RAD”, Franța, cat. nr. 72217.

10. Panou standard de seruri care conțin anticorpi împotriva virusului imunodeficienței umane tip 1 (HIV 1) - OSO 42-28-212-93-02P, „Medical and Biological Union”, Novosibirsk.

11. Panoul standard de seruri care conțin anticorpi împotriva virusului imunodeficienței umane de tip 2 (HIV 2) - OSO-42-28-216-02P, „Medical and Biological Union”, Novosibirsk.

12. Panoul standard de seruri care nu conțin anticorpi împotriva virusului imunodeficienței umane de tip 1 și 2 (HIV 1, 2) - OSO-42-28-214-94-02P, „Medical and Biological Union”, Novosibirsk.

Sensibilitatea sistemului de testare pentru detectarea antigenului p24 a fost evaluată folosind „STANDARDUL ANTIGEN HIV I”, „BIO RAD” și standardul intern al întreprinderii. Folosind standardul intern, s-au preparat 4 diluții în serie de 2 ori de la 40 pg/ml la 5 pg/ml cu normal plasma donatorului, care nu conține anticorpi împotriva HIV 1, 2, ca diluant. Cea mai mică cantitate de antigen detectabil a fost luată ca criteriu de sensibilitate. Datele obținute sunt prezentate în Tabelul 1.

Pentru a evalua sensibilitatea sistemului de testare în detectarea anticorpilor specifici, s-au folosit panouri standard de probe care conțin anticorpi împotriva virusului imunodeficienței umane (HIV 1, 2) (OSO 42-28-212-93-02P p.012, OSO 42-). 28-216- 02P (HIV 2) p.003).

Datele obținute sunt prezentate în tabelele 3, 4.

Eficiența de diagnosticare a sistemului de testare „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1” a fost comparată cu sistemele de testare „Jenskrin-HIV-Ag/At” (Bio-Rad), „DIA-HIV 1/2" (Diaprof-Med), "Vironostika HIV Uni-form II Ag/At" (Biomerioux), "Recombinant-HIV1,2 DSM" (MBS), "Amercard Anti-HIV-1,2 K" (Amercard ), „HIV-1, HIV-2-ELISA-Avicenna” (Avicenna). În acest scop, probele de ser din panoul intern au fost testate în toate testele specificate. Rezultatele prezentate în Tabelul 5 indică eficiența diagnostică ridicată a „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1”.

Studiile de sensibilitate ale sistemului de testare „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1” au fost efectuate și cu seruri de sânge de la pacienți confirmați prin imunoblotting ca HIV pozitivi. Au fost testate un total de 428 de probe din astfel de seruri. Au fost obținute mai multe opțiuni pentru detectarea anticorpilor la diferite proteine ​​HIV și antigenul p24. Rezultatele sunt prezentate în Tabelul 6.

Tabelul 6. Rezultatele detectării anticorpilor la diferite proteine ​​HIV 1 și antigen p24 la testarea serurilor HIV 1 pozitive (n=428)
% detecție	Profilul proteic
	anti-gp41	anti-gr120	anti-p24	anti-p31	p24
51,1%	+	+	+	+	-
35,3%	+	-	+	+	-
4%	+	-	+	-	-
3,3%	+	-	-	+	-
1,4%	+	-	-	+	+
1,2%	+	+	+	+	+
1,2%	+	+	-	+	+
0,9%	+	-	+	+	+
0,7%	+	-	+	-	+
0,5%	+	-	-	-	+
0,2%	+	+	-	-	+
0,2%	+	+	-	-	-
% detectarea anticorpilor la proteine ​​individuale sau Ag p24	100%	53,9%	93,2%	94,4%	6,1%

La testarea probelor HIV 1 pozitive, 3% din seruri au demonstrat reacție pozitivă cu gp36 (HIV env 2). OP/OPcrit. în aceste probe nu a depăşit 2,0. Datele noastre privind reactivitatea încrucișată a proteinelor exterioare ale HIV 1 (gp41) și HIV 2 (gp36) coincid cu datele din literatură.

Interpretarea rezultatelor

Analiza testării serurilor HIV pozitive și a probelor din panourile standard și interne în „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1” ne-a permis să dezvoltăm criterii de interpretare a rezultatelor acestui test. Criteriile recomandate sunt prezentate în Tabelul 7.

Pe baza acestor criterii, toate probele de ser HIV pozitive (n=428) au fost determinate a fi pozitive în „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV1”. Din cele 16 probe din panoul standard care conține anticorpi la HIV 1, 14 au fost determinate a fi pozitive și 2 au fost determinate a fi nedeterminate. Toate cele 8 probe din panoul standard care conţin anticorpi la HIV 2 au fost determinate a fi pozitive. Din cele 10 probe din panoul interior care conține anticorpi la HIV 1, 7 au fost determinate a fi pozitive și 3 au fost determinate a fi nedeterminate.

De asemenea, au fost efectuate studii de sensibilitate ale sistemului de testare „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1” cu seruri de sânge de la pacienți care au avut un rezultat pozitiv la sistemele de testare imunosorbente legate de enzime care detectează simultan anticorpi și antigenul p24 și nedeterminat în imunoblot. Au fost testate un total de 123 de astfel de probe. Datele sunt prezentate în Tabelul 8.

La testarea serurilor cu un rezultat imunoblot nedeterminat (n=123) în „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM+AGr24 HIV 1”, 72 de probe (58,5%) au arătat un rezultat pozitiv. Dintre acestea, 26 de seruri (21,1%) au fost pozitive numai pentru p24, 20 (16,3%) - numai pentru anticorpi, 16 (13%) - pentru p24 cu anticorpi la una dintre proteine, 10 (8,1%) - pe p24 cu anticorpi la două sau mai multe dintre proteine. Astfel, testarea numai pentru anticorpi (fără detectarea p24) ar identifica 30 de probe (24,4%) ca fiind pozitive. Detectarea antigenului p24 în test a permis ca încă 42 de probe (34,1%) să fie identificate ca pozitive.

Pentru a evalua specificitatea sistemului de testare, a fost utilizat un panou standard de seruri care nu conțineau anticorpi la HIV 1, 2 (n=20); probe de ser de sânge de la donatori sănătoși (n=610), probe de ser de sânge de la pacienți cu diverse boli infecțioase (n=224) fără legătură cu HIV; probe de ser de sânge de la pacienți cu diverse boli neinfecțioase - traumatisme, boli ale sistemului cardiovascular, oncologie (n=35); probe de ser sanguin de la femei gravide (n=40). Au fost testate un total de 929 de probe. O probă din serurile de sânge ale donatorilor sănătoși a arătat un rezultat fals pozitiv - au fost detectați anticorpi la gp41 și p24. 7 probe de ser de sânge de la donatori sănătoși și 2 probe de ser de sânge de la pacienți cu boli infecțioase care nu au legătură cu HIV au arătat un rezultat fals pozitiv pentru p24.

Pentru a evalua specificitatea sistemului de testare, a fost utilizat un panou standard de probe negative (OSO 42-28-214-94-02p, p. 009). Specificitatea a fost de 100%.

Astfel, studiile au arătat că specificitatea sistemului de testare „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1” este de 99% la examinarea probelor de ser sanguin de la donatori normali și de la pacienți cu diferite boli infecțioase și somatice. .

Datele obținute arată eficiența diagnostică ridicată a sistemului de testare dezvoltat „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTR+AGr24 HIV 1”. Sistemul de testare poate fi utilizat pentru a detecta anticorpi la proteinele individuale ale HIV tip 1 și 2 și antigenul HIV1 p24 pentru a confirma un rezultat pozitiv al screening-ului cu sisteme de testare care detectează anticorpi sau sisteme de testare care detectează simultan anticorpii și antigenul HIV1 p24. Sistemul de testare poate fi utilizat ca un test alternativ de imunoblot pentru a confirma rezultatele pozitive, precum și pentru a studia dinamica anticorpilor HIV și a antigenului p24 pe diferite etape infectii.

AVANTAJELE TESTULUI

1. Confirmator test imunoenzimatic format tabletă

2. Test de confirmare care combină determinarea spectrului de anticorpi HIV 1, 2 și antigenul HIV 1 p24

3. Detectarea anticorpilor din toate clasele de Ig

4. Sensibilitatea pentru detectarea p24 este de cel puțin 5 pg/ml

5. Reduce rezultatele nedeterminate comparativ cu imunoblot

6. Timp de analiză - 1 oră 25 de minute (imunoblot - de la 3 la 20 de ore)

7. Evaluarea vizuală a adăugării tuturor componentelor și probelor.

1. Un sistem de testare imunoabsorbant legat de enzime pentru identificarea spectrului de anticorpi la virusul imunodeficienței umane (HIV) de primul și al doilea tip, primul tip de grup O și identificarea antigenului p24 la virusul imunodeficienței umane de primul tip p24, caracterizat prin aceea că include un imunosorbant pe bază de antigene ale virusului imunodeficienței umane, reprezentând gp41 (env HIV-1 și HIV-2 grupa O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (env HIV-1 și HIV-2 grupa O), -2), anticorpi la antigenul HIV 1 p24 și reactivii de detectare, în timp ce antigenele HIV și anticorpii HIV menționați mai sus sunt absorbiți în diferite godeuri ale plăcilor pentru testul imunosorbant legat de enzime.

2. Sistem de testare imunoenzimatică conform revendicării 1, caracterizat prin aceea că pentru sorbţie se utilizează plăci de polistiren pliabile sau neseparabile cu 96 de godeuri pentru imunotestul enzimatic.

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) a intrat în viața medicinei practice undeva în anii 60 ai secolului trecut. Sarcina sa inițială a fost cercetarea histologică în scopuri științifice, care sa rezumat la căutarea și identificarea structurii antigenice a celulelor unui organism viu.

Metoda ELISA se bazează pe interacțiunea antigenelor specifice (AT) și înrudite (AG) cu formarea unui complex „antigen-anticorp”, care este detectat folosind o enzimă. Acest fapt i-a determinat pe oamenii de stiinta sa creada ca metoda poate fi folosita in scopuri de diagnostic pentru a identifica imunoglobuline specifice din diferite clase implicate in raspunsul imun la o anumita infectie. Și a fost o descoperire în diagnosticul clinic de laborator!

Metoda a început să fie utilizată în mod activ abia la începutul anilor 80, iar apoi în principal în instituții specializate. Primele analizoare de imunoenzime au fost dotate cu centre și stații de transfuzie de sânge, spitale de boli infecțioase și de venerologie, din moment ce formidabilul SIDA, născut pe continentul african, a apărut la orizontul nostru și s-a alăturat imediat infecțiilor „vechi”, a necesitat măsuri imediate de diagnostic și căutare. medicamentele medicinale, afectându-l.

Domeniul de aplicare al metodei ELISA

Posibilitățile imunotestelor enzimatice sunt cu adevărat extinse. Acum este greu de imaginat cum se poate face fără o astfel de cercetare, care este folosită literalmente în toate ramurile medicinei. Se pare, ce poate face ELISA în oncologie? Se dovedește că se poate. Și multe. Capacitatea analizei de a găsi markeri caracteristici anumitor tipuri de neoplasme maligne stă la baza depistarii precoce a unei tumori, atunci când aceasta nu este încă determinată prin nicio altă metodă din cauza dimensiunilor reduse.

Diagnosticarea clinică modernă de laborator (CDL), pe lângă markerii tumorali, are un arsenal semnificativ de panouri ELISA și le utilizează pentru a diagnostica diferite afecțiuni patologice (procese infecțioase, tulburări hormonale) și pentru a monitoriza medicamentele farmaceutice pentru a identifica efectul acestora asupra organismului pacientului. și, de altfel, nu numai uman. În prezent, imunotestul enzimatic este utilizat pe scară largă în serviciile veterinare, deoarece „frații noștri mai mici” sunt, de asemenea, susceptibili la multe boli, de care suferă uneori foarte mult.

Prin urmare, ELISA, datorită sensibilității și specificității sale, poate determina dintr-o probă de sânge prelevată dintr-o venă:

• Starea hormonală (hormoni glanda tiroidași glandele suprarenale, hormoni sexuali);
• Prezența infecțiilor virale și bacteriene (HIV, B și C, chlamydia, sifilis și, precum și multe alte boli cauzate de microorganisme patogene);
• Urme de activitate vitală a microorganismelor care au provocat proces infecțios, care s-a încheiat cu succes și a trecut în stadiul formării unui răspuns imun la acest agent patogen. Astfel de urme, adică anticorpii, în multe cazuri rămân în circulație în sânge pentru viață, protejând astfel o persoană de reinfectare.

Care este esența ELISA?

Metoda imunoenzimatică permite determinarea nu numai a prezenței agentului patogen în sine (analiza calitativă), ci și a conținutului său cantitativ în serul sanguin al pacientului.

Doza virală sau bacteriană influențează semnificativ cursul procesului infecțios și rezultatul acestuia, prin urmare analiza cantitativă joacă un rol important în diagnosticarea și tratamentul bolilor în diferite forme si etapele.

Cu toate acestea, cunoscând studiile imunologice enzimatice ca metodă ELISA, nici nu ne gândim cum reușește să acopere o gamă atât de largă de microorganisme care locuiesc pe planeta noastră, dintre care multe reprezintă o amenințare directă pentru sănătatea și viața oamenilor și animalelor. Dar adevărul este că ELISA are multe opțiuni (necompetitive și competitive - directe și indirecte), fiecare dintre ele își rezolvă propria problemă și, astfel, permite o căutare țintită.

Pentru a identifica imunoglobulinele dintr-o clasă sau alta, se utilizează un panou (placă) tradițional de polistiren cu 96 de godeuri, în godeurile cărora proteinele recombinante sorbite sunt concentrate în fază solidă. Anticorpii sau antigenii care intră în godeul cu ser de sânge găsesc un obiect „familiar” și formează un complex cu acesta (AG - AT), care, fixat de un conjugat enzimatic, se va manifesta printr-o schimbare a culorii sondei atunci când citind rezultatele.

Imunotestul enzimatic se realizează folosind sisteme de testare cu o anumită specificitate, fabricate în laboratoare speciale și echipate cu toate componentele de reacție necesare. Cercetările se pot desfășura folosind mașini de spălat („săitori”) și spectrofotometre de citire, care implică în mare parte muncă manuală. Pe mașinile complet automate, care eliberează asistentul de laborator de instilarea monotonă, spălare și alte sarcini de rutină, desigur, este mai rapid și mai convenabil să lucrezi, dar nu toate laboratoarele își pot permite un astfel de lux și continuă să lucreze în mod veche - pe mașini semiautomate.

Interpretarea rezultatelor ELISA este de competența medicului diagnosticator de laborator și, de asemenea, trebuie luată în considerare proprietatea inerentă a aproape tuturor reacțiilor imunochimice de a da răspunsuri fals-pozitive sau fals-negative.

Video: imunotestul enzimatic modern

Rezultatele ELISA folosind exemplul sifilisului

Imunotestul enzimatic este potrivit pentru detectarea tuturor formelor, și, în plus, este utilizat în studiile de screening. Pentru efectuarea analizei se utilizează sânge venos pacient luat pe stomacul gol. Lucrarea folosește tablete cu o anumită specificitate (clasele AB A, M, G) sau anticorpi totali.

Având în vedere că anticorpii din sifilis sunt produși într-o anumită secvență, ELISA poate răspunde cu ușurință la întrebarea când a apărut infecția și în ce stadiu se află procesul, iar interpretarea rezultatelor obținute poate fi prezentată în următoarea formă:

• IgM indică durata procesului infecțios (poate apărea în timpul exacerbarii bolilor inflamatorii cronice);
• IgA afirmă că infecția a apărut cu mai bine de o lună în urmă;
• IgG indică faptul că infecția este în plină desfășurare sau că a fost efectuat recent un tratament, care este ușor de determinat prin anamneză.

La testarea pentru sifilis, godeurile negative (și controlul negativ) vor rămâne incolore, în timp ce godeurile pozitive (și controlul pozitiv) vor prezenta o culoare galben strălucitor din cauza schimbării de culoare a cromogenului adăugat în timpul testului. Cu toate acestea, intensitatea culorii nu coincide întotdeauna cu controlul, adică poate fi puțin mai palid sau ușor gălbui. Acestea sunt rezultate dubioase, care, de regulă, sunt supuse reexaminării cu luarea în considerare obligatorie a indicatorilor cantitativi obținuți pe spectrofotometru, dar, în general, culoarea este direct proporțională cu numărul de complexe imune (Ag și AT asociate) .

Cel mai interesant dintre imunotestele enzimatice este HIV ELISA

Analiza este poate mai interesantă decât altele pentru o gamă largă de populație, deoarece este încă imposibil de spus cu certitudine că mulți au dispărut. probleme sociale(prostituție, dependență de droguri etc.). Din nefericire, HIV afectează nu numai aceste straturi ale societății umane; te poți infecta în diferite circumstanțe care nu au legătură cu imoralitatea sexuală sau consumul de droguri. Dar dacă este nevoie de un test HIV, nu trebuie să vă fie teamă că toată lumea din jurul vostru va ști despre vizita dumneavoastră la un astfel de laborator. Acum persoane infectate cu HIV sunt protejați de lege, iar cei care au dubii pot apela la birouri anonime unde pot rezolva problema fără teama de publicitate și condamnare.

Metoda imunosorbantă legată de enzime utilizată pentru diagnosticarea infecției cu HIV este unul dintre cele mai importante teste standard, care, totuși, necesită conditii speciale, deoarece subiectul este foarte sensibil.

Este logic să se efectueze ELISA HIV după contact sexual, transfuzie de sânge, alte proceduri medicale care sugerează infecție și la sfârșitul perioadei de incubație („fereastră seronegativă”), dar trebuie reținut că această perioadă de timp nu este permanent. Se poate termina în 14-30 de zile, sau poate dura până la șase luni, astfel încât valoarea medie este considerată a fi un interval de la 45 la 90 de zile. Pe Sânge HIV Se administrează în același mod ca și pentru alte infecții - dintr-o venă pe stomacul gol. Rezultatele vor fi gata în funcție de acumularea de material în laborator și volumul de lucru al acestuia (de la 2 la 10 zile), deși cel mai adesea laboratoarele oferă un răspuns în aceeași zi sau în următoarea.

La ce te poți aștepta de la rezultatele tale HIV?

ELISA pentru infecția cu HIV detectează anticorpi la două tipuri de virus: HIV-1 (mai frecvent în Rusia și alte țări din Europa și Asia) și HIV-2 (mai frecvent în Africa de Vest).

Sarcina ELISA HIV este de a căuta anticorpi de clasa G, care sunt detectați pe toate sistemele de testare, dar într-o perioadă ulterioară, și anticorpi de clasa A și M, detectați pe truse de testare recombinate de nouă generație, care fac posibilă găsirea de anticorpi. pe cel mai mult primele etape (perioadă incubație– „fereastră seronegativă”). Vă puteți aștepta la următoarele răspunsuri de la ELISA:

1. Rezultat primar pozitiv: sângele trebuie retestat folosind un sistem de testare de același tip, dar dacă este posibil de altă serie și de către o altă persoană (asistent de laborator);
2. Repetarea (+) implică o nouă prelevare de sânge de la pacient cu examinarea acestuia similară analizei primare;
3. Un alt rezultat pozitiv este supus analizei de referință, care utilizează truse de testare foarte specifice (2-3 buc.);
4. Un rezultat pozitiv în ambele (sau trei) sisteme este trimis pentru imunoblotting (același ELISA, dar efectuat individual folosind truse de testare cu specificitate deosebit de ridicată).

Concluzie despre infecție cu HIV determinată numai pe baza imunoblotării. O conversație se poartă cu persoana infectată în deplină confidențialitate. Dezvăluirea secretelor medicale în Rusia, precum și în alte țări, este supusă pedepsei penale.

Teste pentru chlamydia și citomegalovirus metoda imunologică enzimatică au câștigat, de asemenea, o popularitate deosebită datorită faptului că fac posibilă determinarea timpului infecției, a stadiului bolii și a eficacității măsurilor de tratament.

În timpul implementării, se poate observa și apariția anticorpilor de diferite clase.în diferite faze stare patologică cauzate de un agent infecțios:

• IgM poate fi detectată încă de la șapte zile după infecție;
• IgA indică faptul că infecția trăiește în organism de mai mult de o lună;
• IgG confirmă diagnosticul de chlamydia și ajută la monitorizarea tratamentului și la determinarea eficacității acestuia. Trebuie remarcat faptul că anticorpii de clasa G rămân și circulă în organism indiferent de durata bolii, deci pentru decodare corectă analiză, este necesar să se țină seama de valorile de referință (norme), care, apropo, sunt diferite pentru fiecare CDL: ținând cont de marca sistemului de testare și de specificul reactivilor incluși în kit. Valorile normale sunt introduse în formularul de lângă rezultatul ELISA.

În ceea ce privește, aici este puțin diferit: Anticorpii de clasa M apar după aproximativ o lună și jumătate, adică rezultatul (IgM+) devine pozitiv în faza infecției primare sau în timpul reactivării infecție ascunsăși rămâne așa de la 4 luni la șase luni.

Prezența clasei G AT este caracteristică debutului primar infecție acută sau reinfectare. Analiza afirmă că virusul este prezent, dar nu oferă informații despre stadiul în care se află procesul infecțios. Între timp, determinarea titrului normal de IgG cauzează, de asemenea, dificultăți, deoarece depinde în întregime de starea imunitară o persoană specifică, care, totuși, se stabilește prin identificarea imunoglobulinelor de clasa G. Având în vedere acest comportament al anticorpilor, la diagnosticarea CMV, este nevoie să se evalueze capacitatea anticorpilor de clasa G de a interacționa cu CMV pentru a-l „neutraliza” apoi. (AT aviditate). Pe stadiul inițial Bolile IgG se leagă foarte slab la antigenele virale (aviditate scăzută) și abia apoi încep să manifeste activitate, prin urmare, putem vorbi despre o creștere a avidității anticorpilor.

Putem vorbi mult despre avantajele imunotestului enzimatic, deoarece această metodă a reușit să rezolve multe probleme de diagnostic folosind doar sânge venos. Nu este nevoie de lungi așteptări, griji și probleme cu colectarea materialului pentru cercetare. În plus, sistemele de testare pentru ELISA continuă să fie îmbunătățite și nu este departe ziua în care testul va da un rezultat 100% fiabil.

Video: film educațional al Universității Medicale de Stat din Moscova numit după. Sechenov despre elementele de bază ale ELISA