Sodobne metode diagnosticiranja okužbe s HIV. IFA Diagnostika: Kaj je bistvo, opredelitev protiteles, kako se izvajajo in na katere bolezni so učinkovite? Reakcija polimeraze

Pravočasna diagnoza okužbe s HIV postane izjemno pomemben ukrep, saj je začetku zdravljenja predhodno v veliki meri vnaprej prevladuje nadaljnji razvoj bolezni in podaljša življenjsko dobo bolnika. V zadnjih letih je bil opažen pomemben napredek na področju prepoznavanja te strašne bolezni: bolj napredne, raziskovalne metode prihajajo, da nadomestijo stare testne sisteme, njihova natančnost pa se znatno poveča.

V tem članku bomo povedali o sodobnih metodah diagnosticiranja okužbe s HIV, ki je koristno za pravočasno zdravljenje tega problema in ohraniti normalno kakovost življenja bolezni.

Tehnike diagnostike HIV

V Rusiji se izvede standardni postopek za diagnozo okužbe s HIV, ki vključuje dve ravni:

• ELISA testni sistem (analiza presejanja);
• imunsko blot (Ib).

Druge tehnike se lahko uporabijo tudi za diagnostiko:

• izrazite teste.

Test sistem IFA.

V prvi fazi diagnostike se preskus presejanja (ELISA) uporablja za zaznavanje okužbe s HIV, ki temelji na proteini HIV, ki so nastale v laboratorijih, ki zajemajo posebna protitelesa, ki nastanejo v telesu kot odgovor na okužbo. Po interakciji z reagenti (encimi) preskusni sistem spremeni barvo kazalnika. Nato se te spremembe obdelujejo na posebni strojni opremi, ki določa rezultat izvedene analize.

Takšni preskusi IFA lahko pokažejo rezultat po nekaj tednih po uvedbi okužbe s HIV. Ta analiza ne določa prisotnosti virusa, temveč razkriva proizvodnjo protiteles. Včasih, v človeškem telesu, proizvodnja protiteles proti HIV se začne po 2 tednih na področju okužbe, vendar večina ljudi se proizvaja v kasnejših rokih, po 3-6 tednih.

Obstajajo štiri generacije testov IFA z različno občutljivostjo. V zadnjih letih se pogosto uporabljajo testne sisteme III in IV generacije, ki temeljijo na sintetičnih peptidih ali rekombinantnih proteini ter imajo večjo specifičnost in točnost. Uporabljajo se lahko za diagnosticiranje okužbe s HIV, spremljanjem razširjenosti HIV in varnosti pri preverjanju darovalne krvi. Natančnost IFA testnih sistemov III in IV generacije je 93-99% (več občutljivih testov, ki se proizvajajo v zahodnih državah - 99%).

Za izvedbo testa IFA se vzame 5 ml krvi iz bolnikovih žil. Med zadnjim obrokom in analizo naj traja vsaj 8 ur (praviloma se izvede zjutraj na prazen želodec). Takšen preskus se priporoča, da ne vzamete prej 3 tedne po domnevni okužbi (na primer po nezaščitenem spolnem odnosu z novim spolnim partnerjem).

Rezultati testov IFA se dobijo v 2-10 dneh:

• negativni rezultat: Označuje pomanjkanje okužbe s HIV in ne zahteva dostopa do specialista;
• lažen negativni rezultat: lahko opazimo v zgodnjih pogojih okužbe (do 3 tedne), na kasnejših fazah aidsa z izrazito zatiranjem imunosti in z nepravilno izvedeno pripravo krvi;
• lažni pozitivni rezultat: lahko opazimo pri nekaterih boleznih in z nepravilno izvedeno pripravo krvi;
• pozitivni rezultat: Označuje okužbo okužbe s HIV, zahteva IB in kroženje bolnika strokovnjaku v centru AIDS.

Zakaj preizkus IFA da napačne pozitivne rezultate?

Fresni pozitivni rezultati preskusov IFA na HIV se lahko opazijo z nepravilno obdelavo krvi ali pri bolnikih s takšnimi pogoji in boleznimi:

• več mieloma;
• nalezljive bolezni, ki jih je povzročilo virus Epstein-Barr;
• stanje po;
• autoimmunske bolezni;
• v ozadju nosečnosti;
• po cepljenju.

Z zgoraj opisanimi vzroki za krvi so lahko prisotne nespecifične premreževalna protitelesa, katere proizvodnja ni bila izzvala okužbe s HIV.

V zadnjih letih se je pogostost lažnih pozitivnih rezultatov bistveno zmanjšala zaradi uporabe generacijskih preskusnih sistemov III in IV, ki vsebujejo bolj občutljive peptidne in rekombinantne proteine \u200b\u200b(sintetizirani so z in vitro genski inženiring). Po začetku uporabe takih testov IFA se je pogostost lažnih pozitivnih rezultatov znatno zmanjšala in je približno 0,02-0,5%.

Identifikacija lažnega pozitivnega rezultata ne pomeni, da je oseba okužena z virusom HIV. V takih primerih, ki priporoča drugim testom IFA (zahtevana generacija IV).

Pacientova kri se pošlje v referenčni ali arbitražni laboratorij z opombo "ponovitev" in se preiskuje na generaciji IFA IV IV. Če je rezultat nove analize negativen, se prvi rezultat pripozna kot napačna (lažna pozitivna) in IB se ne izvaja. S pozitivnim ali dvomljivim rezultatom, med drugim preskusom, je pacient nujno dodeljen za izvajanje IB po 4-6 tednih, da potrdi ali zavrača okužbo s HIV.

Imunsko blotting.

Končna diagnoza okužbe s HIV lahko namestite šele po prejemu pozitivnega rezultata imunskega blotanja (IB). Uporablja nitrocelulozni trak, na katerem se uporabljajo virusne beljakovine.

Krvna ograja za IB se izvede iz žil. Nato je podvržen posebni predelavi in \u200b\u200bbeljakovine, ki jih vsebuje njegov serum, so ločeni v posebnem gelu glede na njihovo polnjenje in molekulsko maso (manipulacija se izvaja na posebni opremi pod vplivom električnega polja). Nitroceluloški trak je naložen na serumskem gelu in blokiranju ("škoda") v posebni komori. Strip se obdeluje in če obstajajo protitelesa na HIV v uporabljenih materialov, so povezane z antigenskimi črtami na IB in se manifestirajo kot linije.

IB se šteje za pozitivno, če:

• po podatkih American CDC - obstajata dve ali tri vrstice GP41, P24, GP120 / GP160;
• v skladu z merili American FDA - na traku sta dve vrstici P24, P31 in linija GR41 ali GR120 / GR160.

V 99,9% primerov pozitivni rezultat IB označuje okužbo s HIV.

V odsotnosti linij - IB je negativen.

Ko identificirajo linije z GR160, GR120 in GR41-IB, dvomljiva. Ta rezultat je mogoče zaznati pri:

• oncološke bolezni;
• nosečnost;
• pogoste transfuzije krvi.

V takih primerih je priporočljivo, da se ponovna študija izvaja z uporabo drugega podjetja. Če po dodatnem IB rezultat ostaja dvomljivo, je treba upoštevati šest mesecev (IB poteka vsake 3 mesece).

Reakcija polimeraze

Preskus na PCR lahko določi RNA virusa. Njegova občutljivost je dovolj visoka in vam omogoča, da prepoznate okužbo s HIV po 10 dneh po okužbi. V nekaterih primerih lahko PCR da napačne pozitivne rezultate, saj se lahko njegova visoka občutljivost odzove na protitelesa do drugih okužb.

Ta diagnostična tehnika je draga, zahteva posebno opremo in visoko usposobljenost strokovnjakov. Ti razlogi tega ne dovoljujejo, da ga izvede z množičnim testiranjem prebivalstva.

PCR se uporablja v takih primerih:

• identificirati HIV v novorojenčkih, ki so bili rojeni iz mater, okuženih z virusom HIV;
• identificirati HIV v "okno" ali z dvomljivim IB;
• za nadzor koncentracije HIV v krvi;
• za raziskave donatorja.

Samo na PCR testu, HIV ni narejen, vendar se izvede kot dodatna diagnostična metoda za reševanje spornih situacij.

Express metode

Ekspresne preskuse, katerih rezultati se lahko ocenijo po 10-15 minutah, so postale ena od inovacij v diagnozi HIV. Najučinkovitejši in natančni rezultati so pridobljeni z uporabo imunokromatografskih preskusov, ki temeljijo na načelu kapilarskega toka. So posebne trakove, na katerih se krva uporablja ali druge preučevane tekočine (sline, urin). Če obstajajo protitelesa na HIV, 10-15 minut kasneje, se na preskusu pojavita barvni in krmilni trak - pozitiven rezultat. Z negativnim rezultatom se pojavi samo krmilni trak.

Kot po testih IFA, je treba rezultate izrecnih testov potrditi z IB analizo. Šele po tem lahko diagnosticiramo okužbo s HIV.

Obstajajo hitri sklopi za domače testiranje. Testna orasure Technologies1 (USA) je odobrila FDA, ki se prodaja brez recepta in se lahko uporabi za identifikacijo HIV. Po preskušanju, v primeru pozitivnega rezultata, je pacient priporočljivo opraviti raziskavo v specializiranem centru za potrditev diagnoze.

Preostali domači preskusi niso odobrili FDA, njihov rezultat pa je lahko zelo dvomljiv.

Kljub temu, da so hitri preskusi slabše od testov IFA iz generacij IV, se pogosto uporabljajo za dodatno testiranje prebivalstva.

Preskuse lahko prenašate, da prepoznajo okužbo s HIV v poliklinskem, CRH ali v specializiranih centrih za pomoč. V Rusiji se izvedejo popolnoma zaupno ali anonimno. Vsak bolnik lahko računa na pridobivanje medicinskih ali psihičnih nasvetov pred ali po analizi. Boste morali plačati za preskuse HIV samo v komercialnih zdravstvenih ustanovah, in so izpolnjeni v javnih klinikah in bolnišnicah.

O kakšnih načinih okužbe z okužbo s HIV in kateri miti obstajajo o možnostih, da se okužijo, preberite

Opis

Priprava

Indikacije

Razlaga rezultatov

Opis

Metoda definicije. Analiza imuno encim (ELISA).

Gradivo Serumska kri

Na voljo odhod v hišo

Kombinirano odkrivanje protiteles na Vrste HIV 1 in 2 ter antigen R24 HIV, visokokakovostni preskus.

Pozornost. S pozitivnimi in dvomljivimi reakcijami se lahko rok za izdajo rezultatov poveča na 10 delovnih dni. HIV (virus humane imunske pomanjkljivosti), ki povzroča pomoč (pridobljeni sindrom imunske pomanjkljivosti) - spada v družino retrovirusov. Od osebe osebi, ki se uporablja pri uporabi onesnaženih igel in brizg za intravensko zdravila za zdravila ali terapevtske postopke, s spolnimi stiki, kot je hetero in homoseksualen. Prenos virusa se lahko pojavi pri prelivanju okužene krvi in \u200b\u200bnjenih izdelkov, darovanje organov ali semenske tekočine, medicinskih delavcev - kadar se vbrizga z okuženimi iglami ali orodji. Okužba HIV je možna s prenosom iz otrokove okužene matere (navpične poti), čeprav sodobne metode preprečevanja z uporabo protiretrovirusnega zdravljenja, pri izpolnjevanju vseh priporočil, zmanjšajo tako tveganje za minimum.

Postopek interakcije med virusom z celico vključuje številne faze: vezava virusa z celico, spustite ga iz lupine, penetracijo v citoplazmo, sintezo DNK za virusno RNA, ki vgraje virusno DNA v gostiteljski celici genome. Po tem se začne latentna faza okužbe. V takem stanju lahko dokazovalna DNA obstaja nekaj časa, ne da bi pokazala dejavnost in ne vpliva na vitalno dejavnost gostiteljske celice. Ni izražanja virusnih beljakovin, na virus ni imunskega odziva. HIV protitelesa, ki označuje imunski odziv telesa, se pojavijo po aktiviranju virusne DNA in začetku aktivne vzreje virusa. Trajanje latentnega obdobja je odvisno od številnih dejavnikov, vključno s posameznimi genetskimi značilnostmi telesa.

Protitelesa HIV se lahko pojavijo od drugega tedna po okužbi; Njihova vsebina se poveča za 2-4 tedne in se vzdržuje v preteklih letih. V 90-95% okuženih, se pojavljajo v prvih treh mesecih po okužbi, 5-9% - v obdobju od treh do šestih mesecev, v 0,5-1% - pozneje.

V prvih tednih okužbe, še pred pojavom protiteles do virusa (i.e., pred servo-pretvorbo), v vzorcih seruma ali plazme, je mogoče identificirati prisotnost antigenov HIV, vključno s kapsidnim proteinom P24. Kasneje, po serokonverziji, ponavadi postane nedoločen.

Kombinirani 4. generacijski sistemi, ki vključujejo HIV AG / AB COMBO TEST (arhitekt, Abbott), zaznavanje obeh protiteles na HIV 1 in 2 tipa in HIV antigena R24, ki omogoča zgodnje odkrivanje okužbe. Posebne značilnosti preskusa presejalnega preskusa Invitro, ki se uporablja v laboratoriju za odkrivanje okužbe z virusom HIV, je treba pripisati visoki specifičnosti raziskav (\u003e 99,5%); 100% občutljivost na protitelesa, značilnih za obdobje serokonverzije in občutljivost preskusa na antigen P24 okoli 18 pg / ml.

Postopek za izvedbo laboratorijske raziskave o HIV je strogo urejen z ukazi Ministrstva za zdravje Ruske federacije in vključuje korak presejanja (kvalificirana) študija prisotnosti protiteles na HIV imununifer (IFA), dovoljene za uporabo, in Stopnja preverjanja (potrditev) podrobnejše študije v Laboratoriju centra mesta za aids. Opozoriti je treba, da celo najboljši pregledni sistemi IFA ne zagotavljajo 100% specifičnosti, to je nekaj verjetnosti pridobivanja nespecifičnih, lažnih pozitivnih rezultatov, povezanih s posebnosti pacientovega krvnega seruma. Zato je pozitiven rezultat presejalnega pregleda IFA ni mogoče potrditi v potrditvenih preskusih, po katerem bo bolnik dal negativen ali nedoločen rezultat. Z nedoločen rezultat potrditvene študije, je treba testiranje ponoviti v dinamiki v 2-3 tednih.

Laboratorijska diagnoza okužbe s HIV pri otrocih, rojenih iz matere, okuženih z virusom HIV, ima svoje lastne značilnosti. V krvi, do 18 mesecev od trenutka rojstva, lahko krožijo mater protiteles do HIV (razred IgG). Odsotnost protiteles do HIV v novorojenčkih ne pomeni, da virus ne prodre skozi placentno pregrado. Otroci mater, okuženih z HIV, so predmet laboratorijskih in diagnostičnih raziskav 36 mesecev po rojstvu.

Priprava

Posebna priprava ni potrebna. Kri traja prej kot 4 ure po zadnjem obroku. Lahko najdete splošna priporočila za pripravo raziskav. Priporočljivo je izvesti študijo o odkrivanju antigena in protiteles do HIV, ne prej kot dva tedna po morebitni okužbi, pri čemer se ponavlja skozi tri in šest tednov v primeru negativnega rezultata. Registracija vlog za raziskave v LLC "Invitro" se izvaja v potni list ali dokument, ki ga nadomešča (migracijska kartica, začasna registracija na kraju stalnega prebivališča, potrdilo serviserja, potrdilo iz tabele potnih listov s kartico potnega lista, registracijsko kartico računovodstva iz hotela). Predstavljeni dokument mora nujno vsebovati informacije o začasni ali stalni registraciji na ozemlju Ruske federacije in fotografije. V odsotnosti potnega lista (dokument, ki ga je nadomestil), ima bolnik pravico, da izdajo anonimno vlogo za dostavo biomateriala. Z anonimnim pregledom, aplikacijo in stranko, ki jo je prejela od stranke, je število biomaterial dodeljeno število, ki je znano pacientu, in medicinsko osebje, ki je izdal naročilo. ! Rezultati raziskav, ki so bili izvedeni anonimno, ni mogoče predložiti za hospitalizacijo, strokovne preglede in niso predmet registracije v pištoli.

Indikacija za imenovanje.

• Povečanje bezgavk več kot dveh področij.
• Leukopenija z limfopenijo.
• Nočno znojenje.
• Ostro izguba teže nejasnega razloga.
• Driska več kot tri tedne nejasne razloge.
• Zvišana telesna temperatura.
• Nosečnostno načrtovanje.
• Predoperativna priprava, hospitalizacija.
• Odkrivanje naslednjih okužb ali njihovih kombinacij: tuberkuloza, malifonični toksoplazmoza, pogosto ponavljajoče se okužbe herpesvirus, notranje organe kandidiaza, re-nevralgia herpes-zoster, ki jo povzročajo mikoplazme, pnevmatske ali legionells Pneumonia.
• Sarcoma caposhi v mladosti.
• Naključni spolni stiki.

Razlaga rezultatov

Razlaga rezultatov raziskav vsebuje informacije za zdravnika in ni diagnoza. Informacije iz tega oddelka ni mogoče uporabiti za samo-diagnozo in samozdravljenje. Natančno diagnozo opravi zdravnik, ki uporablja rezultate te raziskave in potrebne informacije iz drugih virov: anamneza, rezultati drugih raziskav itd.

Enote merskih enot v neodvisnem laboratoriju Invitro: Test kakovosti. Obrazec za predstavitev obrazca: V odsotnosti protiteles do HIV 1 in 2 in antigena P24 je odgovor "negativen". V primeru odkrivanja protiteles do HIV ali antigena pri presejalnih encimov se vzorec seruma pošlje potrditvi metode imunoblota v centru AIDS-a, ki preveri pozitivne in negotove rezultate.

Pozitivni rezultat:

1. Okužba s HIV;
2. lažni pozitivni rezultat, ki zahteva večkratno ali dodatno raziskavo *);
3. Študija je neformativna pri otrocih, mlajših od 18 let, rojena iz matere, okuženih z virusom HIV.

* Posebnost preskusnega sistema preskusnega sistema protitelesa do HIV 1 in 2 ter HIV AG / COMBO, ABBOTT (HIV AG / AB COMBO, ABBOTT), po proizvajalcu reagentov, je približno 99,6% tako v splošni populaciji in v skupini bolniki s potencialnimi motnjami (HBV, HCV, RUBELLA, HAV, EBV, HNLV-I, HTLV-II, E. coli, chl.Trach, itd, avtoimunske patologije (vključno revmatoidni artritis, prisotnost antinuklearnih protiteles), Nosečnost, nosečnost, nosečnost, povišana IgG, IgM, monoklonska gamabapatija, hemodializa, več hemotransphusa).

Okužba HIV se nanaša na kategorijo nenadzorovanih bolezni zaradi pomanjkanja metod za posebno preprečevanje in nezadostno učinkovitost zdravljenja. Zato za nadzor epidemioloških razmer na okužbo s HIV se trenutno uporabljajo presejalne diagnostične študije, ki se večinoma uporabljajo. Vodilno mesto med metodami diagnostike okužbe z virusom HIV zaseda Immunoassay analiza (ELISA), ki omogoča identifikacijo seroloških označevalcev vzročnega dejavnika te bolezni v anketiranih osebah.

To poročilo predstavlja rezultate določitve protiteles do HIV v serumu 40.823 ljudi, med katerimi so vključevali paciente žensk posvetovanja, klinike, bolnišnice mesta, pa tudi zdravstvene centre, specializirane za raziskave in zdravljenje bolnikov s skupinami tveganja (odvisniki od drog, bolniki z virusnim hepatitisom, z in zvezdnimi boleznimi). Študije so potekale v letu 2005 v laboratoriju imunologije porodništva in ginekologije. Prej. OT, Ramna, ki ima več kot 15 let, izkušnje z uporabo metod ELISA za diagnozo različnih nalezljivih bolezni.

Za primarni pregled vzorcev seruma, kombinestnega preskusnega sistema anti-HIV-1 + 2 (CJSC "Vector-Best", Novosibirsk), ki je zaznaven v anketiranih vzorcih seruma ali krvnega plazme, skupna specifična protitelesa do HIV-1 in HIV 2 (imunoglobulini razredov A, G in M). V tem diagnostičnem nizu se rekombinantni HIV beljakovine uporabljajo tako za imobilizacijo v vodnjakih tablet in v obliki konjugata Krena peroksidaze. Ocena rezultatov analize preskusov je bila izvedena v skladu s priporočili navodil za preskusni sistem: negativna (ne vsebujejo protiteles proti HIV-1 in HIV-2), ki so bile preskusne vzorce, optična gostota (OP) ki v ELISA ni presegala vrednosti videza.

Med pregledom v laboratoriju za 40222 (98,5%) iz vzorcev 40823 serumskih vzorcev, je bil dosežen negativen rezultat IFA, in 601 (1,5%) preučevan vzorec je bil obravnavan kot primarno pozitivno. Zaradi ponovne analize, ki se izvajajo naslednji dan, je bil vsak od 601 serumov v hrastovih (dve vrtini tablet) 440 (73,2%) vzorcev opredeljen kot pozitiven, in 161 (26,8%) - kot negativno. V skladu s priporočili Ministrstva za zdravje in družbeni razvoj je bilo 440 pozitivno pri pregledu serumov zamrznjeno in preneseno na napredne referenčne raziskave o svetovalnem in diagnostičnem kabinetu referenčnega laboratorija v bolnišnici št. 30. S.p. Bot-kina. Te študije so bile izvedene z uporabo sistema ECOLAB Vinostic Test sistema HIV 1.2 AG / AT "(" Eclab ", Electrozorsk," Genscreen Plus HIV. AG-AB "(" Biorad ", USA), kot tudi sklope za imunoblot. Rezultati analize 440 serumov v potrditvenih preskusih je omogočil sklepanje, da je 323 (73,4%) vzorec pozitiven, in 102 (23,2%) je negativnih. Za 15 študijskih vzorcev (3,4%) je bil dosežen rezultat nedoločenega analize.

Opozoriti je treba, da vrednosti OP, pridobljenega v našem laboratoriju, s svojim primarnim testiranjem z uporabo sistema izgorevanja izgorevanja anti-HIV-1 + 2, za 314 (97,2%) iz teh 323 pozitivnih serumov od 0,900 do 1.780, \\ t In za 9 (2,8%) vzorcev - 0,500-0.900. Vrednosti OP, pridobljene s pregledom 102 negativnih serumov, za 52 vzorcev (51%), so bile v območju od 0,195 do 0,400; za 40 (39,2%) vzorcev - 0,401-0,800; 10 (9,8%) Vzorci - več kot 0,800.

Tako je zaradi opravljenega dela dokazano, da je primarni preskus krvnega seruma za prisotnost seroloških oznak HIV, ki uporablja preskusni sistem anti-HIV-1 + 2, zelo učinkovit. Pozitivni rezultati presejanja so bili potrjeni med dodatnimi študijami v referenčnem laboratoriju v 73% primerov in lažno pozitivno - so bili zabeleženi le za 0,25% 40.823 analiziranih serumov.

Lastniki patentov RU 2283497:

Izum se nanaša na področje biotehnologije in zdravila. Imunoafatorski testni sistem za identifikacijo spektra protiteles do virusa človeške imunske pomanjkljivosti (HIV) prve in druge vrste, prva vrsta skupine o in odkrivanje antigena na virus človeške imunske pomanjkljivosti prvega tipa P24 vključuje imunosorbent na osnovi o antigeni virusa človeške imunske pomanjkljivosti, ki predstavlja GP41 (ENV HIV-1 in HIV-2 skupine O), GP120 (ENV), P24 (GAG), P31 (POL), GP36 (ENV HIV-2), protitelesa proti antigenu HIV 1 P24, in odkrivanje reagentov, medtem ko so zgoraj omenjeni antigeni HIV in HIV protitelesa, ki so sposobni v različnih vrtinah tablet za encimsko imunovanje, in 96-dobro polistirena, zlonamerno ali neintelularne plošče, ki se uporabljajo za sorpcijo. Izum zagotavlja povečanje občutljivosti, poenostavitve, odpravo subjektivnosti vrednotenja rezultatov. 1 Z.P. F-leži, 10 tab., 1 IL.

Izum se nanaša na področje biotehnologije in zdravila. Uporaba: Diferencirana odkritost vseh razredov specifičnih protiteles na virusne beljakovine virusa človeške imunske pomanjkljivosti 1 in 2, HIV 1 Group O in Antigen R24 HIV 1.

Essence: pridobitev imunofirmalnega preskusnega sistema za identifikacijo spektra protiteles vseh razredov na posamezne beljakovine in HIV 1 in 2, HIV 1 skupino O in antigena R24 HIV 1 v serumu (plazma) krvi, imunoglobulinov in pripravkov za človeške krvi, da bi Opredelite spekter protiteles na HIV 1 in 2, HIV 1 skupino O, odkrivanje antigena P24 HIV 1 in potrditev pozitivnih ali dvomljivih rezultatov presejanja na protitelesa do HIV 1 in 2, HIV 1 Group O in antigena P24 HIV 1.

Opis izuma

Laboratorijska diagnostika okužbe s HIV temelji v treh smereh: a) navedbo HIV in njegovih sestavnih delov; b) Odkrivanje protiteles proti HIV; c) Določanje sprememb v imunski sistem. Med obstoječimi metodami laboratorijske diagnostike so najpogostejša serološka - identifikacija protiteles do virusnih antigenov.

Imununimenska analiza (IFA) in imunoblotiranje (IB) se uporablja predvsem za identifikacijo protiteles v okužbi s HIV. V središču ELISA leži imobilizacijo virusnih antigenov na tabletah, s katerimi so bolnikova protitelesa povezana, in kompleks antigena antigena je zaznan z miško protitelo, konjugiramo s peroksidazo do imunoglobulinov g in človeka. Metoda je precej specifična in občutljiva in vam omogoča, da pri 95% bolnikov identificirate virusovne protitelesa. Preostalih 5% primerov pade na zgodnje faze okužbe, ko so serumska protitelesa še vedno majhna ali terminalne faze bolezni, ko telo ne more več sintetizirati protiteles zaradi ostrega izčrpavanja imunskega sistema. Možni so tudi lažni pozitivni rezultati ELISA, predvsem pri bolnikih z avtoimunskimi in onkološkimi boleznimi, pa tudi v okužbi, ki ga povzročajo virus Ashpektina Barr. Hkrati pa obstaja navzkrižna reakcija protiteles do revmatoidnega faktorja, virusa Epstein-Barr ali antigenske determinante, podobne beljakovin glavne kompleksa histokompatibilnosti 1 in 2 razreda (HLA-4 in DQW3) in z Sposobnost komuniciranja z antigeni HIV. Lažni pozitivni rezultati se pogosto opazijo pri nosečnicah in starejših. Hemoliza, lipemija, onesnaževanje bakterijskega seruma lahko povzroči tudi nezanesljive rezultate.

V zvezi s tem se predlagajo številne metode in se uporabljajo za preverjanje specifičnosti rezultatov zaznavanja protiteles. Od teh metod se "imunska blotting" reakcija najpogosteje uporablja v modifikaciji "Western Blot". Bistvo metode je naslednje: Na prvi fazi se izdela ločitev HIV beljakovin za molekulsko maso z uporabo elektroforeze v poliakrilamidnem gelu. Nato se izvede elektroforetski prenos iz poliakrilamidnega gela na površino nitrocelulozne membrane. Na ta način so se antigeni, ki so bili na ta način zaznani na membrani z uporabo posredne analize: membrana je inkubirana z materialom v študiji; Protitelesa so povezana z antigeni HIV, prenesenimi na nitrocelulozno membrano, nato pa so membranski trakovi inkubirali s konjugatom; Ko se oblikuje kompleks antigena protitelesa, se konjugat pridruži, po pranju iz konjugata in inkubacije s substrat, obarvanje teh območij nitroceluloze, kjer je nastala nastajanja antigenskega kompleksa - protitelesa - konjugat. Risba predstavlja primere pozitivnih, šibkoposteljnih in negativnih rezultatov imunoblota.

V serumu oseb, okuženih z HIV-1 in HIV-2, zaznavanje protiteles do naslednjih proteinov (P) in glikoproteinov (GP): Tabela A.

Tabela v predstavi merila za ocenjevanje rezultatov imunskega blotanja, ki jo priporočajo, kdo in ruski center za preprečevanje in nadzor aidsa.

Na podlagi meril WHO se serumi štejejo za pozitivne, pri katerih protitelesa na vsakih dveh beljakovin Shell iztekanja HIV-1. Če obstaja reakcija z le eno od beljakovin lupine (GP160, GP120, GP41), v kombinaciji z reakcijo z drugimi beljakovinami, ali brez njega, se rezultat šteje za dvomljivo. Po mnenju zveznega znanstvenega in metodološkega centra Ministrstva za zdravje Ruske federacije za preprečevanje in nadzor aidsa, je mogoče razlagati serume kot pozitivne in v prisotnosti protiteles le na eno lupinsko beljakovino.

Odkrivanje protiteles proti antigenu P24 lahko v obdobju začetka serokonverzije kaže, saj so protitelesa natančno prva do tega proteina. Pozitivne reakcije z gagovi in \u200b\u200bpoli beljakovin brez reakcije z an jesti beljakovine lahko odražajo zgodnji serokonverzijski fazi, kot tudi kažejo prisotnost okužbe s HIV-2 ali nespecifičnim odzivom.

Uporaba pri diagnozi HIV kot strokovne metode reakcije imunoblotiranja ima številne pomembne pomanjkljivosti:

1. Nezmožnost potrditve detekcije antigena P24 HIV 1 pri uporabi preskusov, ki določajo antigen in HIV antigen in protitelesa, zaradi česar je neizvedljiva (brez pomena), ki se uporablja kot presejalni preskusi, da hkrati odkrijejo antigen in protitelesa do HIV ( Vrstni red Ministrstva za zdravje Ruske federacije št. 292 z dne 30.07. 2001: "Preučiti darovalce v transfuzijskih postajah krvi, je treba uporabiti preskusne sisteme, ki razkrivajo antigen in protitelesa HIV hkrati).

2. Odkrivanje protiteles je samo razred IgG. Nemogoče je v celoti potrditi pozitivne rezultate, pridobljene z uporabo testov 3 in 4 generacij (zaznavanje IGG in IGM protiteles).

3. subjektivnost razlage preskusne ocene, zlasti v primerih "dvomljivih" in "negotovih" rezultatov in v začetnih fazah serokonverzije (zaznane trakove na nitroceluloznih membranih v teh primerih so mehke, komaj vidni na gola oko in nesoglasja se pogosto opazujejo pri ocenjevanju različnih oseb).

4. Nezmožnost avtomatizirane kvantitativne ocene rezultatov analize.

5. Nižja občutljivost v primerjavi z IFA.

6. Porazdelitev skladiščenja (pri shranjevanju traku nitroceluloze membrane zbledi in ne more biti objektivna potrditev identifikacije ali odkrivanja HIV v spornih primerih).

7. Težavnost reakcije in skladiščenja (trakovi nitrocelulozne membrane so zelo krhki in pogosto zlomljeni).

8. Visok strošek kompletov IB.

Reagent je znan po sočasni opredelitvi antigenov in protiteles na isti patogen, vključno s HIV (DE 4236189 F1, 04/28/1994). Vendar pa se preskusni sistem ne razkrije, ki omogoča diagnosticiranje okužbe s HIV na različnih fazah.

Cilj predloženega izuma je pridobiti preskusni sistem, s pomočjo katere možnosti potrjuje pozitivne ali dvomljive rezultate presejalnih študij na protitelesa do HIV 1 in 2, HIV 1 in antigena HIV 1, pri uporabi preskusov za Dosežemo sočasno odkrivanje antigenov in protiteles.

Predlagana tehnična rešitev se doseže z imunoopimenskim testnim sistemom za identifikacijo spektra protiteles do virusa človeške imunske pomanjkljivosti (HIV) prve in druge vrste, prvi tip skupine O in odkrivanje antigena P24 do virusa človeške imunske pomanjkljivosti prvega tip P24, označen s tem, da vključuje antigenov na osnovi antigenov imunosorbent virus humane imunske pomanjkljivosti, ki predstavlja GP41 (ENV HIV-1 in HIV-2 skupinah O), GP120 (ENV), P24 (GAG), P31 (POL), GP36 (ENV HIV- 2), protitelesa do antigena HIV 1 P24 in odkrivanje reagentov, medtem ko so zgoraj omenjeni antigeni HIV in protiteles HIV sorbeni v različnih vrtinah za encimsko imunovanje.

Poleg tega se za sorpcijo uporabljajo 96-dobro polistirena, zložljive ali neintelularne plošče za imununimalno analizo.

Tehnični rezultat, dosežen s predloženim izumom, je sestavljen iz možnosti potrditve pozitivnih rezultatov na protitelesa do HIV 1 in 2, HIV 1 skupine O in antigena P24 HIV 1, visoka občutljivost, možnost avtomatizirane interpretacije rezultatov, ki odpravlja subjektivnost ocenjevanja, preprostost preskušanja manj kot v primerjavi z obstoječimi skupinami IB stroškov.

Ta tehnična rešitev je drugačna od znanih:

1. Uporabite kot tableto nosilca trdne faze za imunološke reakcije.

2. Istočasna uporaba kot protitelesa Sorbenta R 24 HIV in niz antigenov HIV.

Izum je ponazorjen z naslednjim primerom.

Trenutni začetek razvitega preskusnega sistema "DS-IFA-anti-HIV 1,2-spekter + AG P24 HIV 1" so:

Imunosorbent - rekombinantni antigeni, podobni strukturnim beljakovinam HIV-1: GP41 (ENV HIV-1 in HIV 1 in HIV 1), GP120 (ENV), P24 (GAG), P31 (POL), HIV-2: GP36 (ENV) ) in monoklonska protitelesa miške na HIV 1 (P24), ločeno, ločeno na trakovih polistirena zložljive tablete.

Pripraviti imunosorbentno uporabo:

1. HIV-1 GP41 - Protein, ki ga proizvaja sev E. coli Ne. Yaiv 103.

2. HIV-1 GP120 - Protein, ki ga proizvaja sev E. coli št. Yaiv 109.

3. HIV-1 P24 - Protein, proizveden s sevom E. coli Ne. Yaiv 105.

4. HIV-1 P31 - Protein, ki ga proizvaja sev E. coli Ne. Yaiv 108.

5. HIV-2 P36 - Protein, ki ga proizvaja sev E. coli Ne. Yaiv 106.

Konjugat 1, liofilizirano ali tekoče-monoklonska miška protitelesa do antigena R24 HIV1, konjugiramo z biotinom.

1. Konjugat 2, liofiliziran ali tekoči, je mešanica rekombinantnih antigenov, podobnih strukturnih beljakovin HIV-1: GP41 (ENV HIV-1 in HIV 1 skupine O), GP120 (ENV), P24 (GAG), P31 (PO1); HIV-2: GP36 (ENV), konjugiran z biotinom;

2. konjugate 3, 4 - liofiliziran ali tekoči - streptavidin, označen Chren Peroksidaze;

Med predhodnimi študijami je bila izbrana zasnova preskusnega sistema, je bila optimizirana tehnologija priprave njegovih komponent, optimizirane so bile pogoje za izvedbo reakcije imunfekrementa.

Pri namestitvi ELISA v preskusni sistem "DS - IFA - anti-HIV 1,2-spekter + AG P24 HIV 1" V vodnjakih tablete s sorbed protitelesa do P24, 25 μl konjugata-1 pripeljemo na vodnjake in v vodnjakih s sorbed antigeni - za 25 μl konjugata-2. Shema reakcijske formulacije je prikazana spodaj. Nato se doda 25 μl vzorca v okviru študije. Hkrati, v vodnjakih z antigeni, se barva spreminja iz pomaranče na roza, in v vodnjak s protitelesi - z zeleno na sivi barvi. Zmes inkubiramo 45 minut pri 37 ° C na stresalniku (ali 1 uro pri 37 ° C v termostatu). Potem, brez pranja, se 50 μl konjugata-3 pripelje v luknje tablete, da se določi antigen P24, in v vodnjakih, da določijo protitelesa 50 μl konjugata-4. Po inkubaciji 20 minut pri 37 ° C na stresalniku (ali 30 minut pri 37 ° C v termostatu) tableta speremo in razkrivamo mešanico substrata. Skupni reakcijski čas 1 h 25 min (ali 1 H 50 min). Antigen P24, ki je prisoten v preučevanem vzorcu, je povezan z monoklonskimi protitelesi na P24, specifična protitelesa pa tvorijo kompleks z rekombinantnimi antigeni na tablici. Nastalo imunsko kompleks Anti-P24 s P24 se zazna s konjugatov proti P24-biotinu, nato streptavidin peroksidazo in imunski kompleksi HIV z AT-HIV-AG-Biotin konjugatom, nato streptavidin peroksidazo.

Shemo reakcijske formulacije.

Računovodstvo za rezultate se izvaja spektrofotometrično pri dveh valovnih dolžinah: 450 / 620-680 nm z nastavitvijo instrumenta "po zraku". Recimo, da rezultati rezultatov na eni valovni dolžini 450 nm.

Rezultati analize se upoštevajo, če povprečne vrednosti optične gostote (OP) v vodnjakih s K - ne več kot 0,2, v vodnjakih s K + - ni nižje od 1,0. OP CRIT. Izračunajte s formulo:

OP CRIT. GP41 \u003d CF. Znak OP K- (GP41) +0.15

OP CRIT. GP120 \u003d Wed. Znak OP K- (GP120) +0.15

OP CRIT. P24 \u003d Sre. Znak OP K- (P24) +0.15

OP CRIT. P31 \u003d CF. Znak OP K- (P31) +0.15

OP CRIT. GP36 \u003d CF. Znak OP K- (GP36) +0.15

OP CRIT. AG P24 \u003d Sre. Znak OP K- (AG P24) +0.04

kjer sta 0,15 in 0,04 koeficienta, določena z metodo statistične obdelave pri proizvajalcu. V procesu razvoja preskusnega sistema je bil uporabljen:

1. Vzorci zdravih donatorjev krvnih serumov (n \u003d 610).

2. Vzorci bolnikov s krvnimi serumom z različnimi nalezljivimi boleznimi, ki niso povezane s HIV (ORZ, pljučnico, angino, herpeti in citomegalovirusnimi okužbami, sifilisom, klamidijo, virusnim hepatitisom A, B in C (n \u003d 224)).

3. Vzorci sera krvi bolnikov z različnimi neugodnimi boleznimi - poškodbe, bolezni kardiovaskularnega sistema, onkologija (n \u003d 35).

4. Vzorci serumske krvi nosečnic (n \u003d 40).

5. Vzorci serumske krvi seropozitivne v ELISA in potrjeni v imunoblotu (n \u003d 428).

6. Vzorci seruma s pozitivnim rezultatom, pridobljenim v imunofirmalnih testnih sistemih za istočasno določanje protiteles HIV 1,2 in antigena P24 ter negotovega rezultata imunoblota (n \u003d 123).

7. Notranja serum, ki vsebuje in ne-protitelesa na HIV 1.2, ki jo je registriral Ministrstvo za zdravje Ruske federacije Imunoferment testnih sistemov in imunoblota (N \u003d 21).

8. Standard "HIV 1 Standard antigena", "BIO RAD", Francija, CAT. 72217, ki je antigen, ki izhaja iz virusnega lizata.

9. Notranji standard podjetja. Vzorec, ki vsebuje P 24 antigena pri koncentraciji 200 pg / ml, pridobljen iz virusnega lizata in rafinirano v skladu s standardom "HIV 1 antigena" standard podjetja "BIO RAD", Francija, mačka. №72217.

10. Standardna serumska plošča, ki vsebuje protitelesa proti virusu človeške imunske pomanjkljivosti v prvem tipu (HIV 1) - OSO 42-28-212-93-02P, "Medicinska in biološka zveza", Novosibirsk.

11. Standardna serumska plošča, ki vsebuje protitelesa na virus virusa človeške imunske pomanjkljivosti v drugem tipu (HIV 2) - OSO-42-28-216-02P, "Medico-Biološka zveza", Novosibirsk.

12. Standardna serumska plošča, ki ne vsebuje protiteles proti virusu humane imunske pomanjkljivosti prvega tipa in drugega (HIV 1, 2) - OSO-42-28-214-94-02P, "Medicinska in biološka zveza", Novosibirsk.

Ocena občutljivosti preskusnega sistema med odkrivanjem antigena P24 je bila izvedena z uporabo standarda HIV I antigena, BIOD, notranjega standarda podjetja. Pri uporabi notranjega standarda, 4 zaporedna 2-kratna razredčila iz 40 pg / ml do 5 pg / ml, pripravljena z običajnim donatorjem plazmo, ki ne vsebuje protiteles proti HIV 1, 2, kot fazi. Najmanjša količina zaznanega antigena je bila vzeta za merilo občutljivosti. Dobljeni podatki so predstavljeni v tabeli 1.

Za oceno občutljivosti preskusnega sistema med odkrivanjem specifičnih protiteles, so bile uporabljene standardne plošče vzorcev, ki vsebujejo protitelesa do virusa imunske pomanjkljivosti (HIV 1, 2) (OSO 42-28-212-93-02P S.012, OSO 42-28 -216- 02P (HIV 2) od.003).

Pridobljeni podatki so predstavljeni v tabelah 3, 4.

Primerjava je bila narejena iz diagnostične učinkovitosti preskusnega sistema "DS-IFA-anti-HIV 1,2-spekter + AGR24 HIV 1" s testnimi sistemi "Jenskrin-HIV-AG / AT" (Bio-Rad), "Dia -Hiv 1/2 "(DIAprof-medu)," Viro-Vio-Form II AG / AM "(biomeriouks)," rekombinantni HIV1.2 DSM "(MBS)," Amercard Anti HIV-1,2 K "(Amercard ), "HIV-1, HIV-2-IFA Avicenna" (Avicenna). Za to smo serumski vzorci iz notranje plošče preskušeni v vseh določenih preskusih. Rezultati, predstavljeni v tabeli 5, navedite visoko diagnostično učinkovitost "DS-IFA-anti-HIV 1.2-spekter + AG24 HIV 1".

Študije občutljivosti preskusnega sistema "DS-IFA-anti-HIV 1,2-spekter + AG24 HIV 1" so bile izvedene tudi s serumi bolnikov, ki so bili potrjeni v imunoblotu kot HIV pozitivno. Testirano 428 vzorcev takih serumov. Dobili smo več možnosti za odkrivanje protiteles na različne proteine \u200b\u200bHIV in antigena P24. Rezultati so predstavljeni v tabeli 6.

Tabela 6. Rezultati odkrivanja protiteles na različne beljakovine HIV 1 in antigena P24 pri preskušanju HIV 1 Pozitivne serume (n \u003d 428)
% Odkrivanje	Profil beljakovin
	anti-GR41.	anti-GR120.	anti-P24.	anti-P31.	p24.
51,1%	+	+	+	+	-
35,3%	+	-	+	+	-
4%	+	-	+	-	-
3,3%	+	-	-	+	-
1,4%	+	-	-	+	+
1,2%	+	+	+	+	+
1,2%	+	+	-	+	+
0,9%	+	-	+	+	+
0,7%	+	-	+	-	+
0,5%	+	-	-	-	+
0,2%	+	+	-	-	+
0,2%	+	+	-	-	-
Odkrivanje protiteles na posamezne beljakovine ali AG P24	100%	53,9%	93,2%	94,4%	6,1%

Pri testiranju HIV 1 Pozitivni vzorci je 3% serumov pokazalo pozitivno reakcijo z GP36 (ENV HIV 2). OP / OPKRIT. V teh vzorcih ni presegalo 2,0. Naši podatki o navzkrižni reaktivnosti zunanje lupine HIV 1 (GP41) in HIV 2 (GP36) sovpadajo z literarnimi podatki.

Razlaga rezultatov

Analiza preskušanja HIV pozitivnih serumov in vzorcev iz standardnih in notranjih plošč v "DS-IFA-Anti-HIV 1,2-spektru + AG24 HIV 1" je dovoljeno razvijati merila za razlago rezultatov tega preskusa. Priporočena merila so prikazana v tabeli 7.

Na podlagi teh meril so vsi vzorci HIV pozitivne serume (N \u003d 428) opredeljeni kot pozitivni in v "DS-IFA-Anti-HIV 1.2-spektru + AG24 HIV1". Od 16 vzorcev standardne plošče, ki vsebuje protitelesa na HIV 1, 14, so opredeljeni kot pozitivni in 2 kot nejasni. Vsi 8 vzorcev iz standardne plošče, ki vsebujejo protitelesa do HIV 2, so opredeljeni kot pozitivni. Od 10 vzorcev notranje plošče, ki vsebuje protitelesa do HIV 1, 7, so opredeljeni kot pozitivni in 3 kot nejasni.

Preskusi občutljivosti preskusnega sistema "DS-IFA-anti-HIV 1,2-spekter + AGRA24 HIV 1" so bili izvedeni tudi s serumi bolnikov s pozitivnim rezultatom v imuno-impunmimenskih testnih sistemih, hkrati pa so odkrili protitelesa in antigena P224, in negotov v imunoblu. Testirali 123 takih vzorcev. Podatki so predstavljeni v tabeli 8.

Pri preskušanju serumov z nedoločenim imunofonom (n \u003d 123) v "DS-IFA-anti-HIV 1,2-spektru + AG24 HIV 1" 72 vzorca (58,5%), je bil dokazan pozitiven rezultat. Od teh, 26 serumov (21,1%) pozitivno le s P24, 20 (16,3%) - samo v protitelesa, 16 (13%) - po P24 s protitelesi na eni od beljakovin, 10 (8,1%) - v skladu z P24 s protitelesi na dve ali več proteinov. Tako bi testiranje le na protitelesa (brez odkrivanja P24) določilo kot pozitivne 30 vzorcev (24,4%). Odkrivanje v testu Antigena P24 je omogočilo, da se kot pozitivni dodatno 42 vzorec (34,1%).

Za oceno specifičnosti preskusnega sistema je bil uporabljen standardni sera plošča, ki ne vsebuje protiteles na HIV 1, 2 (n \u003d 20); Vzorci zdravih donatorjev (N \u003d 610), vzorci bolnikov s krvnimi serumom z različnimi nalezljivimi boleznimi (n \u003d 224), ki niso povezani z virusom HIV; Vzorci bolnikov s krvnimi serumom z različnimi neugodnimi boleznimi - poškodbami, boleznimi kardiovaskularnega sistema, onkologija (n \u003d 35); Vzorci krvnega seruma nosečnic (n \u003d 40). Testirane 929 vzorcev. En vzorec iz zdravih donatorjev krvnih serumu je pokazal napačen pozitivni rezultat - protitelesa GP41 in P24. 7 Vzorci zdravih donatorjev krvnih serumu in 2 vzorec bolnikov s krvnimi serumom z nalezljivimi boleznimi, ki niso povezani z HIV, sta pokazala lažni pozitivni rezultat P24.

Za oceno specifičnosti preskusnega sistema je bila uporabljena standardna plošča negativnih vzorcev (OSO 42-28-214-94-02P, od.009). Posebnost je bila 100%.

Tako so študije pokazale, da je specifičnost preskusnega sistema "DS-IFA-anti-HIV 1,2-spekter + AGR24 HIV 1" 99% v študiji vzorcev krvnega seruma normalnih darovalcev in bolnikov z različnimi nalezljivimi in somatske bolezni.

Pridobljeni podatki kažejo visoko diagnostično učinkovitost razvitih preskusnega sistema "DS-IFA-anti-HIV 1.2 spektra + AG24 HIV 1". Preskusni sistem se lahko uporabi za odkrivanje protiteles za ločene beljakovine iz HIV 1 in 2 tipov in antigena R24 HIV1, da se potrdi pozitivni rezultat preskusnih sistemov, ki zaznavajo protitelesa ali preskusne sisteme, ki so hkrati odkrivanje protiteles in antigena P24 HIV1. Preskusni sistem se lahko uporablja kot alternativni Immunoblot test za potrditev pozitivnih rezultatov, kot tudi za študije dinamike protiteles do HIV in antigena P24 na različnih fazah okužbe.

Prednosti testa

1. Potrditev imunofinančnega testa formata tabličnega računalnika

2. Potrditev preskusa, ki združuje določitev spektra protitelesnih HIV 1, 2 in antigena P24 HIV 1

3. Odkrivanje protiteles vseh razredov IG

4. Občutljivost med odkrivanjem P24 vsaj 5 pg / ml

5. Omogoča, da zmanjšate število negotovih rezultatov v primerjavi z imunoblotom

6. Čas analize - 1 H 25 MIN (IMMUNOBLOT - od 3 do 20 ur)

7. Vizualna ocena uvedbe vseh komponent in vzorcev.

1. Imuno-imunimalni testni sistem za identifikacijo protiteles do virusa človeške imunske pomanjkljivosti (HIV) prve in druge vrste, prve vrste skupine O in odkrivanje antigena P24 do virusa človeške imunske pomanjkljivosti prvega tipa P24, označen s da vključuje imunosorbent, ki temelji na virusu virusa imunske pomanjkljivosti, oseba, ki predstavlja GP41 (ENV HIV-1 in HIV-2 skupina O), GP120 (ENV), P24 (GAG), P31 (POL), GP36 (ENV HIV-2), Protitelesa proti HIV antigenu 1 P24 in odkrivanje reagentov, medtem ko so zgoraj omenjeni antigeni HIV in protiteles HIV sorbeni v različnih vrtinah za encimsko imunovanje.

2. Imunofinančni preskusni sistem po zahtevku 1, označen s tem, da jerpcija uporaba 96-vodnih polistirena zložljive ali neintelularne plošče za encimsko imunovanje.

ELISA (Imuno-imunimalna analiza, ELISA - Angleščina) je nekje v 60. letih prejšnjega stoletja vstopila v življenje praktične medicine. Začetna naloga je bila histološka študija za znanstvene namene, ki so se zmanjšale na iskanje in identifikacijo antigenske strukture celic živih organizmov.

Metoda IFA temelji na interakciji specifičnih (AT) in s tem povezanih antigenov (AG) z tvorbo kompleksa antigena - protitelesa, ki je zaznana z encimom. To dejstvo je prišlo do znanstvenikov za idejo, da se metoda lahko uporabimo za diagnosticiranje posebnih imunoglobulin različnih razredov različnih razredov, ki so vključeni v imunski odziv na eno ali drugo okužbo. In to je bil preboj v klinični laboratorijski diagnostiki!

Metoda se je začela aktivno uporabljati samo na začetku osemdesetih in to je predvsem v specializiranih agencijah. Prvi imunofinančni analizatorji so bili opremljeni s centri in postajami transfuzijo krvi, nalezljivih in venereoloških bolnišnic, saj se je rodil na afriški celini, ki se je pojavil na obzorju, in se takoj pridružil "starim" okužbam mogočnih pripomočkov, zahteval takojšnje diagnostične ukrepe in iskanje terapevtskih zdravil, ki vplivajo na njegovo.

Obseg metode ELISA

Možnosti imuno-imunimalne analize so resnično obsežne. Zdaj je težko predstavljati, kako lahko storite brez takšnih študij, ki se uporabljajo dobesedno v vseh sektorjih medicine. Zdi se, da lahko IFA opravi v onkologiji? Izkazalo se je. In veliko. Sposobnost analize označevalcev, značilnih za nekatere vrste malignih neoplazmov, ki temeljijo na zgodnji odkrivanje tumorja, ko še ni določena z drugim zaradi majhnosti.

Sodobna klinična laboratorijska diagnostika (CDL), razen ONCOMormarkers, ima pomembne arzenalne plošče za ELISA in jih uporablja za diagnozo različnih patoloških pogojev (infekcijski procesi, hormonske motnje) in spremljanje farmacevtskih medicinskih pripravkov, da bi ugotovili njihov vpliv na bolnika in, mimogrede, ne le oseba. Trenutno se imunskoasimenzionalna analiza pogosto uporablja v veterinarski službi, saj "naše manjše brate" veljajo tudi številne bolezni, ki včasih zelo trpijo.

V to smer, ELISA, zaradi svoje občutljivosti in specifičnosti, v skladu z vzorcem krvi, vzete iz vene, lahko določi:

• Hormonski status (ščitnični hormoni in nadledvične žleze, spolni hormoni);
• Prisotnost virusne in bakterijske okužbe (HIV, B in C, klamidije, sifilis, in in pa tudi številne druge bolezni, ki jih povzročajo patogeni mikroorganizmi);
• Sledi pomembne dejavnosti mikroorganizmov, ki so vzbudili infekcijski proces, ki je bil varno končal in prešel na stopnjo nastanka imunskega odziva na ta patogen. Takšne sledi, to je protitelesa, v mnogih primerih ostanejo krožijo v krvi za življenje, kot zaščita osebe iz ponovne okužbe.

Kaj je bistvo IFA?

Imununimalna metoda vam omogoča, da določite ne le prisotnost samega patogena (visokokakovostna analiza), temveč tudi njegovo kvantitativno vsebino v serumu bolnika.

Virus ali bakterijski odmerek bistveno vpliva na potek infekcijskega procesa in njegovega izida, zato je kvantitativna analiza dodeljena ne zadnja vloga pri diagnosticiranju in zdravljenju bolezni v različnih oblikah in stopnjah.

Vendar pa poznavanje imunsko-immimenzionalnih študij, kot metoda IFA, ne razmišljamo o tem, kako uspe pokrivati \u200b\u200btakšno široko paleto mikroorganizmov, ki naseljujejo naš planet, od katerih mnogi nosijo neposredno grožnjo za zdravje in življenje človeka in živali . Dejstvo je, da ima ELISA številne možnosti (nekonkurenčne in konkurenčne - neposredne in posredne), od katerih vsaka rešuje svojo nalogo in tako omogoča ciljno iskanje.

Če želite identificirati imunoglobuline enega ali drugega razreda, se uporablja tradicionalna 96-volan polistirenska plošča (tableta), v vodnjakih, katerih sorbed rekombinantne beljakovine koncentriramo v trdni fazi. Protitelo ali antigenov serum ali antigen, ki je padel v dobro prijazno protitelo, poiščite "znanega" predmeta in tvorijo kompleks z njim (AG-AT), ki je, ki je zaupana encimskemu konjugatu, ko berete rezultate, ki se manifestira sprememba barve vodnjaka.

Imunoasimenzionalna analiza se izvaja na preskusnih sistemih določene specifičnosti, izdelane v posebnih laboratorijih in opremljena z vsemi potrebnimi reakcijami. Študije se lahko izvedejo s pomočjo pralnih strojev ("Voshor") in branje spektrofotometrov, kjer je vpletena v ročno delo. Na polnih avtomatskih strojih, ki nosijo laboratorijski način od monotonske vzdolženja, pranje in druge rutinske primere, seveda, delo hitreje in bolj priročno, vendar ne vsi laboratoriji si lahko privoščite takšno razkošje in še naprej delajo na stari način - na pol- Samodejno.

Razlaga rezultatov IFA je v pristojnosti zdravnika laboratorijske diagnostike, in nujno je upoštevati in neločljivo povezana s skoraj vsemi imunokemičnimi reakcijami, da bi dali lažne pozitivne ali lažne negativne odgovore.

Video: Sodobna imunimalna analiza

Rezultati IFA na primer sifilisa

Analiza Imuno Encim je primerna za identifikacijo vseh oblik, Poleg tega se uporablja pri pregledu raziskav. Za analizo se uporablja venska kri pacienta, ki vzame prazen želodec. Papir uporablja tablete s posebno specifičnostjo (v razredih A, M, G) ali skupnih protiteles.

Glede na dejstvo, da se v sifilisu proizvaja v določenem zaporedju, ELFA zlahka odgovori na vprašanje, ko je prišlo do okužbe in v kateri fazi je proces, in dekodiranje dobljenih rezultatov se lahko predstavi v naslednji obliki:

• IGM kaže na trajanje infekcijskega procesa (lahko se pojavi pri oteževanju kroničnih vnetnih bolezni);
• Iga stanja, da se je okužba zgodila pred več kot pred mesecem;
• IgG predlaga, da je okužba v polnem zamahu ali na nedavno zdravljenje, ki se zlahka izvede pri zbiranju anamneza.

Pri analizi sifilisa bodo vrtine z negativnim odzivom (in negativnim nadzorom) ostale brezbarvne, pozitiven rezultat (kot tudi pozitiven nadzor) pa bo zaradi sprememb v barvi kromogena, ki je bila dodana med študijo. Vendar pa intenzivnost barve ne spada vedno s krmiljenjem, to je, da je lahko malo palega ali rahlo rumenkasto. To so dvomljivi rezultati, ki se praviloma ponovno preučijo z obveznimi ob upoštevanju kvantitativnih kazalnikov, pridobljenih na spektrofotometru, vendar je barva v neposredni sorazmerni odvisnosti od števila imunskih kompleksov (\\ t pridruženo AG in AT).

Najbolj razburljivo analize imunoasay - IFA na HIV

Analiza, morda, več kot drugi, je zanimivo v številnih ljudeh, ker še ni samozavestno uveljavljati, da so številni socialni problemi izginili (prostitucija, zasvojenost z drogami itd.). Na žalost HIV vpliva na ne le te plasti človeške družbe, je mogoče okužiti v različnih okoliščinah, ki niso povezane s spolnosti ali vnosom drog. Če pa se je pojavila potreba po HIV raziskavah, se ne smejo bati, da se vsi naučijo o obisku takega laboratorija. Zdaj so ljudje, okuženi z virusom HIV, zaščiteni z zakonom, in lahko dvomijo proti anonimnim pisarnam, kjer lahko rešite problem brez strahu pred javnostjo in obsodbo.

Imununimalna metoda, ki se uporablja za diagnosticiranje okužbe s HIV se nanaša na primarne standardne študije, ki pa zahtevajo posebne pogoje, saj je tema zelo občutljiva.

IFA na HIV smiselno po spolnem stiku, transfuziji krvi, druge medicinske manipulacije, ki vključujejo okužbo, in na koncu inkubacijskega obdobja ("seronetivno okno"), vendar je treba upoštevati, da to obdobje ni konstantno. Lahko se konča 14-30 dni in se lahko nadaljuje do šestih mesecev, zato se interval od 45 do 90 dni sprejme s povprečno vrednostjo. Za HIV je kri predana na enak način kot druge okužbe - od Dunaja na prazen želodec. Rezultati bodo pripravljeni glede na kopičenje materiala v laboratoriju in njeni obremenitvi (od 2 do 10 dni), čeprav najpogosteje laboratorij zagotavlja odgovor na isti dan ali naslednjo.

Kaj je mogoče pričakovati od rezultatov HIV?

IFA na okužbi s HIV opredeljuje protitelesa na dve sorti virusa: HIV-1 (bolj pogostega v Rusiji in drugih državah Evrope in Azije) in HIV-2 (bolj pogosto na ozemlju Zahodne Afrike).

Naloga IFA HIV je iskanje v razredu G, ki se odkrijejo na vseh preskusnih sistemih, vendar v poznejšem obdobju, in v razredih A in M, zaznan na rekombinantnih preskusih nove generacije, kar vam omogoča, da najdete protitelesa v Najzgodnejše faze (inkubacijsko obdobje - "seronegacijsko okno"). Od IFA lahko pričakujete naslednje možnosti odgovora:

1. Primarni pozitivni rezultat: Krv je predmet ponavljanja na preskusnem sistemu iste vrste, vendar, če je mogoče, še ena serija in druga oseba (laboratorijski pomočnik);
2. Ponavljajoče (+) pomeni nov vnos krvi pri bolniku s študijo, kot je primarna analiza;
3. Drug pozitivni rezultat je odvisen od referenčne analize, ki uporablja zelo specifične testne komplete (2-3 kos.);
4. Pozitiven rezultat v obeh (ali v treh) sistemih se pošlje v imunoblotting (isto ELISA, vendar se posamično opravi za teste posebnih sklopov specifičnosti).

Zaključek okužbe z virusom HIV se izvede samo na podlagi imunoblota. Izvaja se pogovor z okuženo v popolni zaupnosti. Razkritje zdravstvene tajnosti v Rusiji, kot tudi v drugih državah, je predmet kazenskega kaznovanja.

Analize na klamidijskem in citomegalovirusu z imununimalno metodo so pridobili tudi določeno priljubljenost, zaradi dejstva, da omogoča določitev časa okužbe, faze bolezni in učinkovitosti terapevtskih ukrepov.

Pri uvajanju, lahko opazujete tudi videz protiteles različnih razredov. V različnih fazah patološkega stanja, ki ga povzroča infekcijsko sredstvo:

• IGM se lahko odkrije več dni po sedmih po okužbi;
• Iga pravi, da okužba v telesu živi več kot mesec dni;
• IgG Potrdi diagnozo klamidije, pomaga slediti zdravljenju in določiti njeno učinkovitost. Opozoriti je treba, da protitelesa razreda G ostanejo in krožijo v telesu, ne glede na predpisovanje bolezni, zato, da pravilno dešifrira analizo, referenčne vrednosti (norme), ki se na poti za vsak KDL Njihove lastne so: ob upoštevanju blagovne znamke preskusnega sistema in specifičnosti reagentov, vključenih v set. Vrednosti norma se prilegajo v prazno zraven rezultata ELISA.

Kar se tiče, je nekoliko drugačen: Protitelesa razreda M se pojavijo približno po mesecu in pol, to je pozitiven rezultat (IGM +), postane v fazi primarne okužbe ali pri odzivanju skrite okužbe in ostane eden od 4 mesecev do šestih mesecev.

Prisotnost na razred G je značilna za začetek primarne akutne okužbe ali ponovne okužbe. Analiza navaja, da je virus, vendar so informacije, v katerih je infekcijski proces - ne daje. Medtem pa opredelitev IgG titra povzroči tudi težave, saj je v celoti odvisna od imunskega statusa določene osebe, ki pa je vzpostavljena z identifikacijo imunoglobulinov razreda G. Glede na vedenje protiteles, pri diagnosticiranju CMWI , Potrebno je oceniti sposobnosti protiteles razreda G za interakcijo s CMV, nato pa »nevtralizirati« (avidnost). V začetni fazi je bolezen IGG zelo slabo povezana z virusnimi antigeni (nizka avidnost) in šele nato začnejo prikazati dejavnost, je mogoče govoriti o povečanju avidnosti protiteles.

Govorite lahko o prednostih imunofirmalne analize že dolgo in veliko, ker je ta metoda uspela rešiti številne diagnostične naloge, ki uporabljajo samo vensko kri. Ni več potrebujejo dolga pričakovanja, razburjenje in težave z ograjo materiala za študijo. Poleg tega se je sistem IFA še naprej izboljšen in dan ni daleč od vogala, ko bo test dal 100% točnost rezultata.

Video: MGMU učni film. Sechenov o osnovah IFA