Imunsko blot pri diagnozi HIV. Imunski blotting imunski blok mehanizem Praktična uporaba

IMMUNOBLOTING -(Iz angleščine. «Blot je madež) - metoda identifikacije antigenov (ali protiteles) z znanimi serumi (ali antigeni). To je kombinacija gel elektroforeze iz ELISA. Sprva se bakterijske celice ali virione uničijo z ultrazvokom, nato pa metoda elektroforeze ločuje vse antigene virusa ali bakterijskih celic in prejmejo komercialni reagent na posebnem nitroceluloškem filmu. Pri izvajanju imunablota na filmu z znanimi antigeni, se uporablja preučen serum bolnikov. Po inkubaciji in pranju nepovezanih protiteles se je začela v ELISA - antiserum se nanese na imunoglobulin osebe, označena z encimom, in kromogeni substrat, ki spreminja sliko, ko se medsebojno vpliva na encim. V prisotnosti kompleksov antigena protitelesa-anti-SVENS na imunoglobulin-encim na nosilcu, pobarvane madeži. Metoda imunoblotiranja vam omogoča ločeno zaznavanje protiteles na različne antigene patogena (na primer z okužbo z virusom HIV, imunobrotina razkriva protitelesa na GP120, GP24 in druge virusne antigene).

Radioimunska analiza (RIA)

Metoda temelji na reakciji antigena protitelesa z oznako antigena ali radionuklidom protitelesa. Kot nalepka uporablja 125i, 14c, 3H, 51CR in drugih radionuklidov. Nastali imunski kompleksi so izolirani iz sistema in določijo radioaktivnost na števcih (β-sevanje). Intenzivnost sevanja je neposredno sorazmerna s številom priključenih antigenov in protiteles molekul.

Solidna fazna različica RIA z uporabo označenih protiteles ali antigenov, sorbed v luknjah polistirenskih plošč, je zelo razširjena.

RIA se uporablja za identifikacijo mikrobov, virusov, različnih hormonov, encimov, zdravilnih snovi, imunoglobulins, kot tudi druge snovi, ki jih vsebuje gradivo, ki je predmet študija v manjših koncentracijah 10-12-10-15 g / l.

Nadzorna vprašanja

Reakcija imunske bakteriolizacije: Kakšna je ta reakcija; Kaj je antigen, ki - protitelesa, reakcijski mehanizem, metode formulacije, praktična uporaba. Reakcija imunske hemolize: potrebne sestavine, metode formulacije; Nadzor, praktična uporaba. Odziv lokalne hemolize v gel (reakcija zlata): načelo reakcije, metode formulacije, praktične uporabe. Dopolnilo zavezujoča reakcija: Načelo reakcije; ki se oblikuje v interakciji imunskih serumov s posebnim antigenom; Kaj se zgodi z dopolnilom, če je prisoten hkrati? Kakšna je usoda dopolnila v primeru, da med antigenom in protitelesa ni specifične afinitete? S pomočjo, katere reakcije se lahko določi, kaj se je zgodilo z dopolnilom; zakaj se ta reakcija uporablja; Kakšen je viden pozitiven rezultat RSK? Zakaj? Kakšna je lastnina v prvi fazi RSK? V drugi fazi? Če je končni RSK hemoliza, kaj to pomeni - pozitiven ali negativen rezultat? Pojasnite rezultate: RSK + + + +, RSK + + +, RSK + +, RSK +. Poimenujte sestavine prvega sistema RSK in sestavin drugega RSK sistema. Zakaj bi se testni serum inaktiviran? Kako titrirati dopolnilo? Hemolitični serum: Kaj vsebuje, kako dobijo, kaj je titer in kako ga določiti? Katere živali se uporabljajo za pridobitev RSK komponent? Metodologija RSK na mrazu. Pri določanju, iz katerega je potrebno od naštetih reakcij, ki so potrebni za dopolnitev, je treba padavine, flokulacija, aglutinacija, odkrivanje nepopolnih protiteles, imunska bakteriolizacija, imunska hemoliza, raziskava, RSK? Imunofluorescenčna reakcija (greben) - Podajte zaporedje dogodkov z neposredno reakcijo Kuns; Potrebne sestavine. Kaj je antigen, ki - protitelesa kot označena protitelesa, saj se upošteva rezultat reakcije, kakšen je pozitiven rezultat? Praktična aplikacija - Kaj je mogoče določiti s to reakcijo? Posredna imunofluorescenčna reakcija - Podajte zaporedje dogodkov s to reakcijo, potrebne sestavine, ki so antigen, ki se uporabljajo imunski serumi; praktična uporaba; Prednost posrednega grebena v primerjavi z neposredno reakcijo. Analiza imunoenimen (IFA) - načelo reakcije; potrebne sestavine; Podajte zaporedje dogodkov, ko reakcijska formulacija, da se antigen odkrije v materialu v študiji; potrebne sestavine; Kaj se zgodi s pozitivnim rezultatom, kaj izgleda? Navedite zaporedje ukrepanja pri izvajanju ELISA, da se odkrijete protitelesa v preskusnem serumu; potrebne sestavine; Kaj se zgodi s pozitivnim rezultatom? Imunoblotting je načelo reakcije; Glavni koraki; potrebne sestavine; Ker se rezultat upošteva; Prednosti reakcije. Radioimunska analiza (RIA) - iz katere osnovne faze je reakcija reakcija; Kaj je označeno z protitelesa ali antigeni, kako se upošteva rezultat? Načelo metode imunoelektronske mikroskopije; Glavni koraki; potrebne sestavine; kot označena protitelesa; Kot je posledica reakcije. Imobilizacijske reakcije - načelo metode, proizvodnja tehnik, komponente, računovodske rezultate.

Naloge za izvajanje v procesu samoizvajanja.

Izpolnite tabelo "reakcijo imunitete" glede na reakcije, ki so bile razstavljene v okviru te teme.

Odzive na odpornost

Študentsko delo v praktični lekciji

Delo takoj začnete z nastavitvijo 1 faze RSK, vendar za snemanje prenosnika pozneje (glejte spodaj).

1. Reakcija imunske hemolize. Oglejte si demonstracijsko reakcijo imunske hemolize, skico v obliki sheme, razložite rezultat v izkušenih in kontrolnih cevi.

2. Dopolnitev zavezujočega odziva

a) razstavljanje RSK na tabeli;

b) narišite prenosni računalnik, ki je nastavitev RSK v obliki tabele;

c) postavite drugo fazo RSK (prva faza je nameščena na začetku razreda);

d) razstavljanje diagnostičnih pripravkov, potrebnih za RSK;

e) upošteva rezultat. Oblikovati zaključek o prisotnosti posebnih protiteles v preskusnem serumu.

3. Imunofluorescenčna reakcija. Raziščite tabelo, naredite grafikon reakcijske formulacije v prenosniku; Poglejte diagnostični serum; Določite - ki vsebuje serum, kot je kuhano, za katero reakcijo (neposredni ali posredni greben), ki ga uporablja. Oglejte si demonstracijski rezultat grebena v luminiscenčnem mikroskopu.

4. Analiza Imuno Encim (ELISA). V prenosni računalnik je diagram reakcijske formulacije v dveh različicah: za zaznavanje antigena v materialu v študiju in zaznavanje serumskih protiteles. Oglejte si niz sestavin za diagnosticiranje okužbe s HIV in hepatitisom V. Ugotovite, da vsebuje vsako sestavino in za katero se uporablja.

5. Imunoblotiranje. V prenosni računalnik naredite reakcijsko shemo; Poglejte demonstracijo - rezultat reakcije.

6. Radioimunska analiza (RIA). V prenosni računalnik naredite reakcijsko shemo.

7. Imunska elektronska mikroskopija (IEM). Poglejte demonstracijo - rezultat reakcije, je reakcijska shema v prenosnem računalniku, navedite roke antigen (virus) in označena protitelesa.

Imunoblotting je zelo občutljiva metoda za odkrivanje beljakovin, ki temelji na kombinaciji elektroforeze in ELISA ali RIA. Imunoblotiranje se uporablja kot diagnostična metoda za okužbo s HIV itd.

V splošnem smislu Immunoblotting razume analizo mešanice beljakovin, prenesenih na trdno podlago-membrano, s katero so povezane s kovalentnimi vezi, ki mu sledi imunodekcija.

Zmes beljakovin, ki se neposredno uporabljajo za analizo substrata - ali po njegovi predhodni frakcioniranju z metodami elektro-elektroforeze ali dvodimenzionalne elektroforeze - Western blot analize (Western blotting).

Antigeni patogena so ločeni z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu, nato jih prenesejo iz gela na aktiviran papir ali nitrocelulozno membrano in se manifestirajo z uporabo ELISA.

Podjetja proizvajajo takšne trakove z "bloti" antigenov. Za te trakove se uporablja bolni serum. . Potem, po inkubaciji, se ukradejo iz nereaktivnih protiteles bolnika in seruma proti humanim imunoglobulinom, označeno z encimom . Kompleks (antigen + protitelo + protitelo + protitelesa + antigen + antigena + protitelo) je zaznana z dodatkom kromogenega substrata, ki spreminja barvo pod delovanjem encima.

Takšna metodologija se uporablja tudi za izbiro bakterij, fagel ali virusov, ki izražajo ciljne klonirane genske izdelke.

Prenos beljakovin na membrano se izvede pasivno ali z uporabo opreme za elektriko. Na učinkovitost prenosa beljakovin na membrano vplivajo številni dejavniki, kot so molekulska masa beljakovin, gelsko poroznost, čas prenosa in sestava uporabljene puferske raztopine (transfer).

Glede na naloge in pogoje eksperimenta so izbrani prenosni pogoji, ki zagotavljajo najboljše rezultate. Nitrocelulozna, polivinildendyluorid (PVDF) ali pozitivno napolnjene najlonske membrane se običajno uporabljajo kot substrati. Nitroceluloza se lahko veže na 80 - 100 μg beljakovin na 1 cm2.

Beljakovine nizke molekulske mase (z molekulsko maso manj kot 20 kDa) se lahko izgubijo zaradi umivanja sposobnosti, da pre-raziskovanje polimorfizma nekaterih genetskih lokus na dolžine ustreznih fragmentov omejitve DNA.

Poleg tega, uporaba hibridizacije po SAREW, je enostavno ugotoviti, ali ima ciljni gen del hidrolize določene omejitve v svojem notranjem delu, ki vam omogoča, da izberete optimalno strategijo za kloniranje preučenega genoma območja.

S podobno shemo agaroza gela na nitroceluloškem filtru se lahko prenesejo molekule RNA. Ta metoda je imenovala severno blotting (severno blotting), v nasprotju z južnim blottingom, saj priimek južnega južnega jezika pomeni "južno".

Prenos na filtre iz beljakovinskega gela je bil imenovan zahodni blotting (zahodni blotting). Velike beljakovine (več kot 100 kDa), denaturirano v raztopini natrijevega dodecil sulfata (SDS), se lahko šibko prenesejo na membrano, če je etanol prisoten v transferju Trans. Alkohol bistveno izboljša prenos beljakovin s SDS poliakrilamidnim gelu, vendar zože pore v gelu, kar vodi do zamude velikih beljakovin.

Membrana PVDF je optimizirana za imunodezijo in je sposobna obdržati posebej povezane beljakovine do 160 μg / cm2 na zelo nizki ravni nespecifične vezave.

Imunobloting.

Pomembna lastnost te membrane je možnost ponavljajoče se uporabe. Zeta-sonda najlonske membrane učinkovito povezujejo beljakovine SDS v odsotnosti alkohola, ta vezava pa je odporna na nadaljnje zdravljenje. Prav tako se učinkovito odkrijejo beljakovine z nizko molekulsko maso. Zaradi visoke zmogljivosti vezave - približno 480 μg beljakovin za 1 CM2 - Zeta-sonde membrane omogočajo odkrivanje sledenih količin proteina v analiziranih mešanicah.

Ko se antigen izkaže, da je na membrana imobilizirana, preostali vezivni centri blokirajo želatinske raztopine ali goveje serumski albumin ali posneto mleko.

Membrana je nato inkubirana v raztopini poliklonskih ali monoklonskih protiteles do anti-gena v študiji. Po pranju nevezanih protiteles, membrana inkubiramo v raztopini sekundarnih protiteles, ki so alkalni fosfataze encimski konjugat (alkalna fosfataza, AR) ali horseradish peroksidaza (horseradish peroksidaza, HRP) z anti-ljubezenskimi protitelesi (kozje protitelesa na imunoglobulinu zajec, miško ali ljudstvo) ali beljakovin (Staphylococcus aureus protein) ali g (protein streptococcus sp.), ki imajo visoko afiniteto na FC regije imunoglobulinov.

Odkrivanje izobraženih imunskih kompleksov se izvaja s kemičnim ali kemikalnim načinom. Substrati za kemično reakcijo z alkalnim fosfatazo konjugates so 5-broma-4-klor-3-indolilfosfat (BCIP) ali tetrazolium modra (NBT), in pri uporabi Krena peroksidaze konjugatov - 4-klor-1-naftola in vodikovega peroksida.

Kot posledica encimskih reakcij na membrani, je pobarvan trak ali mesto tvorijo na lokalizacijskem mestu kompleksa antigena protitelesa.

Občutljivost te metode je 100 GHG protein pri uporabi AR in 100-500 GH konjugatov pri uporabi HRP konjugatov. Kemiluminescenčni zaznavanje imunskih kompleksov vam omogoča, da določite manj kot 5 Pg antigena. Načelo te metode je v tem, da se pri reakciji HRP z vodikovim peroksidom in cikličnim diasilhilhidrazinluminom, emisija svetlobe valovne dolžine 428 Nm, ki se lahko pritrdi na fotosenzitivni film.

Imunoblotirna reakcija (RI) se razvija na podlagi ELISA. To je najbolj specifična in občutljiva metoda imunokemične analize. Imunoblotting (iz angleškega blota - sijaj, madež) združuje IFA z elektroforezo. Uporablja se za prepoznavanje nedeflekska protitelesa na HIV, in protitelesa na svoje ločene strukturne beljakovine (proteins-p24, glikoprotein-GR120, GR 41 itd.). Glejte strokovne (podporne) reakcije diagnostike okužbe s HIV.

Reakcijo izvedemo v več fazah:

Virus uničujejo komponente - antigeni (P24, GR120, GR 41 itd.), Ki so podvrženi elektroforezi v poliakrilamidnem gelu, to je ločitev antigenov na frakcijah molekulske mase.

2. Gel je prekrit z membrano nitroceluloze in frakcije antigenov se prenesejo na uporabo elektroforeze. Nitroceluloza se obnaša kot zalivanje papir. Membrana je narezana na trakove (trakovi). Podjetja proizvajajo takšne trakove z "bloti" antigenov.

Imunoblotiranje - dodatna posredna metoda

Streaps s HIV antigeni, ki se uporabljajo na njem, so potopljeni v serum pregledanega in nato izperite od nepristranskega materiala.

4. STREAP-ji inkubiramo z antihilobulinski serumom, označeno peroksidazo, oprati.

Opozan je substrat in številu poslikanih frakcij (točk), ki ustrezajo lokalizacijski coni AG-AG-AG kompleksa.

Prisotnost trakov na določenih delih traku potrjuje prisotnost protiteles v preučevanem serumu, da strogo definirajo antigene HIV. Rezultat imunobrotiranja se šteje za pozitivno, če membrana prikazuje pasove, ki ustrezajo kateri koli dvema od treh HIV antigenov - P24, GP41 in GP 120 (Sl. 37).

Slike.

Seznam rabljenih literatura

Glavna literatura.

Medicinska mikrobiologija, virologija in imunologija: učbenik za študente medu. Univerze 2. Ed., Univerza. in dodajte. - 702 str. Ed. A.A. Sparrow. M.: MIA, 2012.

2. Mikrobiologija, virologija in imunologija: priročnik za laboratorijske razrede: študije. Žrtve / (V.B.subacov itd.); Ed. VB Subachakova, M.M. Karapatsa. M .: Gootar Media, 2014.- 3202.: IL.

3. Medicinska mikrobiologija, imunologija in virologija [Elektronski vir]: Vadnica za medu.

univerze - 760 str. - Način dostopa: http://www.studmedlib.ru/book/isbn9785299004250.html Kijiyev a.i., Badichev S.A. St. Petersburg: speclit, 2010.

4. Medicinska mikrobiologija, virologija in imunologija [Elektronski vir]: Vadnica: v 2 t. / T. 1. - 448 str. - Dostop do načina dostopa: http://www.studmedlib.ru/book/isbn97859704142241.html ZverEV V.V., Boychenko M.N.

M.: Gootar Media, 2010.

5. Medicinska mikrobiologija, virologija in imunologija [Elektronski vir]: Vadnica: 2 ton. T. 2. - 480 str. Način dostopa: http://www.studmedlib.ru/book/isbn97859704142242.html ZverEV V.V., Boychenko M.N. M.: Gootar Media, 2010.

Dodatna literatura.

1. Imunodiagnostične reakcije: Vadnica / Stroški: G. K. DAGLETSHINA, Z.G. GAGABIDULLIN, A.A. AAHTARIEVA, M.M.TUIGUNOV, A.K. BULGAKOV, T.A. SAVCHENKO, R.F.

Hunarizanova, Yu.z. Gabidullin, M.M. Elsynbaev - UFA: Založba GBOU VPO BGMU na Ministrstvu za zdravje Rusije, 2016. - 86c.

2. Značilnosti nekaterih lastnosti, ki določajo patogeni potencial Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E. coli, Proteus, Serracija, E. coli, Proteus: Znanstvena izdaja / Yu. Z. Gabidullin, Rs Sufiyarov, II Dolgushin - UFA, 2015. - 250 s.

Domov »Imunoblot - kaj je to? Imunoblot pri diagnozi nalezljivih bolezni

Imunoblot - kaj je to? Imunoblot pri diagnozi nalezljivih bolezni

Kaj je imunoblot? To je skupna metoda laboratorijske diagnostike človeških virusnih okužb. To je eden najbolj natančnih in zanesljivih načinov za odkrivanje HIV.

Za zanesljivost, je še več kot encimsko povezan test imunosorbent (ELISA). Rezultati imunoblota se štejejo za neizpodbitno in končno.

Imunoblot - kaj je to? Da bi prepoznali osebo HIV, morate opraviti laboratorijsko preskusno metodo krvnih serumov za protitelesa.

Oddelki zahodnega blota se imenujejo tudi zahodni blot (zahodni blot). Uporablja se za odkrivanje človeških virusnih okužb kot dodatno strokovno metodo. To je potrebno potrditi študijo ELISA - laboratorij, ki omogoča, da se določi prisotnost protiteles do HIV v krvi. Imunoblot se je odpovedal pozitivne ELISA.

Šteje se, da je najbolj občutljiva, kompleksna in draga.

Namen

Kaj je imunoblot? Ta metoda laboratorijskih testnih serumskih testov za prisotnost protiteles na virus.

Med posebnimi raziskavami so skupne virusne beljakovine v gelu in nitroceluloznih membranih.

Imunoblotiranje (odkrivanje protiteles v serumskih bolnikih do nekaterih antigenov patogena)

Oblikovani postopek za odseke zahodnih blotov za določitev okužbe s HIV na različnih fazah. V prvi fazi je prečiščeni virus iz sestavnih delov izpostavljen elektroforezi in antigenom, ki so vključeni v njegovo razdeljeno na molekulsko maso.

Virus humane imunske pomanjkljivosti v živih celicah, ki se izvajajo v njegovih genetskih informacijah. Na tej stopnji, oseba postane nosilec virusa HIV, če ste bili okuženi.

Posebnosti te bolezni je v tem, da se dolgo ne manifestira dolgo časa. Virus uničuje limfocite, zato oseba zmanjšuje imuniteto in telo ne more obravnavati okužb.

Če je HIV pravilen in pravočasen zdravljen, bo bolnik živel v globoki starosti. Pomanjkanje zdravljenja neizogibno vodi do smrti. Od okužbe, vendar brez zdravljenja, največje obdobje največ deset let.

Lastnosti

Analiza imunoblota je zanesljiva metoda, ki vam omogoča, da določite prisotnost protiteles do antigenov HIV prve in druge vrste.

Če je oseba okužena, po dveh tednih protitelesa, ki jih je mogoče ponovno odkriti pozneje. Značilnost HIV je, da se količina protiteles hitro poveča in ostane v pacientovi krvi. Tudi če so prisotni, se bolezen morda ne manifestira za dve ali več let. Metoda ELISA ne natančno označuje bolezni, ki zahteva potrditev rezultatov iz razdelkov PCR in zahodnih blotov, če je imuno-improstinalna analiza pokazala pozitiven rezultat.

Indikacije K.

Kakšno "imunoblot" je že izvedel, vendar se uvedejo v študijo?

Razlog za pregled virusa humane imunske pomanjkljivosti (HIV) Immunoblot bo postal pozitiven rezultat ELISA. Pri bolnikih, ki morajo imeti operacijo, je treba iti skozi analno analizo trdne faze. Poleg tega morate analizirati nosečnost žensk, kot tudi tiste, ki dvigujejo grdo življenje. Oddelki zahodnega blota so predpisani bolnikom z okužbo s HIV, če so rezultati ELISA dvomljivi.

Naslednji moteči simptomi so lahko razlog za dostop do zdravnika: hitra hujšanje; šibkost, izguba funkcij; črevesne motnje (driska), ki traja tri tedne; dehidracija; zvišana telesna temperatura; povečanje kandidatov v telesu; razvoj kandidatov , tuberkuloza, pljučnica, toksoplazmoza, poslabšanje herpes.

Pacienta ni treba pripraviti pred predajo venske krvi.

Za 8-10 ur pred preskusom ne jejte. Ne priporočamo dan pred krvi pitja alkohola in kavnih pijač, težka vaja, obupanost.

Kje narediti analizo?

Kje lahko prenašam testiranje HIV?

ELISA, Analiza Imunoblota, ki se izvajajo v mestnih zasebnih klinikah, so rezultati dani čez dan. Nujna diagnostika je možna. V javnih ustanovah, ELISA medicinskih testih in zahodni blot razdelek brezplačno, v skladu z zakonodajo Ruske federacije.

Obvezen pregled na infekcijskih boleznih nosečnic in bolnikov, ki potrebujejo hospitalizacijo ali operacijo. Kako se ta študija odvija?

Kako držati ELISA? Imunoblot pozitiven / negativno potrjuje ali zavrača rezultate ELISA. Postopek je precej preprost. Specialist vzame ograjo venske krvi, traja manj kot pet minut s časom.

Po vzorčenju je treba mesto injiciranja razkužiti in obtičati z ometom. Ograja se izvede na prazen želodec, tako da po postopku ne bo bolelo, da bi jedli grenko čokoladno ploščico ali sladko toplo pijačo.

Da bi dobili napotitev za brezplačno analizo v državni medicinski ustanovi, morate obiskati terapevt.

Na splošno se imunoblot ne razlikuje od drugih študij krvi z ograjo. Metodologija študije je preprosta. Če je virus prisoten v krvi osebe, se telo za njegovo uničenje začne proizvajati protitelesa. Za vsak virus je veliko antigenov beljakovin. Odkrivanje teh protiteles je osnova oddelkov zahodnega blota. Stane

Koliko analize? IMMUNOBLOT HIV se nanaša na poceni raziskave.

V povprečju so metode presejanja imunOasay od 500 do 900 rubljev. Western blots oddelkov je preučiti pregled, katere stroške se gibljejo od tri do pet tisoč rubljev. Bolj zapletene metode so veliko dražje. Na primer, za analizo verižne reakcije polimeraze (PCR), bo treba plačati približno 12.000 rubljev.

Razlaga rezultatov

Najpogostejše metode diagnosticiranja okužbe z virusom HIV je imuno-immonalna analiza in imunoblot.

Za določanje protiteles do virusa človeške imunske pomanjkljivosti. Okužbe običajno potrjujejo dva preskusa: pregledovanje in potrjevanje. Razlaga rezultatov je treba opraviti zdravnik, diagnosticira in predpisuje zdravljenje. Če je imunoblot pozitiven, to pomeni, da je v človeškem telesu virus.

Pozitivni rezultat ne bi smel biti razlog za samozdravljenje, saj lahko vsak bolnik ima svoje bolezni bolezni.

Kvalitativna analiza vključuje pregledovanje in certificiranje. Če bolnik ne zazna virusa, rezultat kaže "negativno". Ko je bilo to potrdilo zaznano, se pregledovanje izvaja dodatne raziskave. Analiza imunoblota, ki potrjuje ali zavrača pregled. Če se preskusni trakovi pojavijo v zatemnitvi nekaterih območij (lokalizacija beljakovin), se diagnoza HIV diagnosticira.

Če so rezultati dvomljivi, se preskusi izvedejo v treh mesecih.

Da bi preprečili okužbo virusa humane imunske pomanjkljivosti, je mogoče izpolniti določena pravila: Izogibajte se naključnim spolnim stikom, uporabite kondome pri stiku, ne uporabljajte zdravil.

Če je bolezen zaznana v nosečnicah, je pomembno, da sledite priporočili zdravnika, ne pozabite na preskuse za prisotnost virusa.

Kaj je zahodno blotting?

Identifikacija beljakovin srčnih mešanic ali izvlečkov različnih tkiv je ena najpogostejših nalog. Z uporabo takšnega orodja kot specifičnih protiteles lahko definirate preučevano protein z minimalnimi začasnimi in finančnimi stroški.

V zahodni metodi za blotting (Western Blotting) v prvi fazi je mešanica beljakovin ločena z elektroforezo v prisotnosti natrijevega dodecil sulfata (DSN), nato prenese na nitrocelulozno membrano z metodo elektropterja.

Bistvo te metode je, da se gel po elektroforezi postavljen na nitrocelulozno membrano med plastmi filtrirnega papirja. Na ta način se "sendvič" sestavlja na električni polju, tako da se kompleksi proteina-DSN gibljejo po ploščni plošči ploščo in so imobilizirani (kot posledica nespecifične sorpcije) na površini nitrocelulozne membrane.

V vezavi kompleksa protein-DSN z membrano nitroceluloze, so sodelujejo v glavni sili električne narave, in ta interakcija je večtočja in vodi do "oblikovanje" beljakovin na površini membrane. Tako, po električnem sodu, smo dobili repliko gel na nitrocelulozo z beljakovine, ki se nahajajo na enak način kot v poliakrilamidni gel.

Po izvedbi DSN - elektroforeza, električne poti in sorpcijo beljakovin iz gela na nitrocelulozno membrano, se terciarna konformacija proteina močno spreminja, če na splošno pravilno govori o obstoju terciarne strukture za protein po taki togi predelavi. Zato se za imunokemično odkrivanje proteina v študiju, samo mono- ali poliklonska protitelesa, specifičnost beljakovinske molekule, običajno uporabljajo.

51. Imuno-imunimalna analiza, imunoblotiranje. Krzno, komponente, uporaba.

Protitelesa, specifična za konformacijske epitope (ali območja, vključno s stiki v Interpreshing), običajno niso primerna za uporabo v metodi Western Blot.

Po prenosu beljakovin je membrana zaporedno inkubirana s protitelesi, specifičnimi za protein, in nato s sekundarnimi protitelesi, specifičnimi za FC fragmente primarnih protiteles, konjugiramo z encimsko (ali drugo) nalepko (sl.

1 a). V primeru, ko je oznaka konjugirana neposredno primarni, specifični antigen protitelesa, sekundarna protitelesa niso potrebna (sl. 1 b). Imunski kompleksi "se manifestirajo", ki so nastali v lokalizaciji preučevanega proteina z uporabo kromogenega substrata (odvisno od vrste oznake).

Občutljivost in specifičnost metode je zelo odvisna od tega, katera protitelesa se uporabljajo med raziskavami.

Uporabljena protitelesa mora biti specifična za edinstveno, značilnost preučevanega proteina aminokislinske sekvence. V nasprotnem primeru je možno interakcijo (zlasti v primeru grobih izvlečkov beljakovin) protiteles z več beljakovinskimi molekulami, kar bo povzročilo videz več barvnih trakov na membrani.

Identifikacija proteina v tem primeru v tem primeru je pogosto težko ali nemogoča.

Drugi pomemben dejavnik, ki ga je treba spomniti pri izbiri protiteles, je afiniteta. Višja je afiniteta uporabljenih protiteles, svetlejši in bolj jasno, da so beljakovinski trakovi doseženi, višja je občutljivost metode. Pri uporabi zdravila Enafiet protitelesa je mogoče doseči občutljivost 1 ng in še višje.

Da bi vizualizirali rezultat interakcije membrane antigena in protiteles, se uporabljajo sekundarna protitelesa, konjugirana s sredstvi, ki omogočajo določen signal pod določenimi pogoji.

Običajno se encim (peroksidaza ali fosfataza) uporablja kot tak sredstvo, produkt reakcije pa je pobarvan in pade na membrano kot netopno oborino.

Tudi v tej metodi je mogoče uporabiti fluorescentne oznake.

Sl. 1. Shema imunokemičnega obarvanja beljakovin v študiji: a - uporaba sekundarnih protiteles, konjugiranih z encimsko oznako; B - Primarno protitelo neposredno konjugiramo z encimsko oznako.

Protokol:

I. Priprava gela in membrane in beljakovin Elektrika

Poliakrilamidni gel po elektroforezi, ki se nahaja v puferski kopeli za blottiranje (25 mm tris, pH 8,3, 192 mm glicin, 10% etanola).

Dva lista filtrirnega papirja, narezana na obliki kasete za blotting in navlažena s smuči za blot, so nameščena na tisti del kasete, ki bo naslovljena na anodo. Potem je nitrocelulozna membrana nameščena na filtrirni papir, ki sledi zračnim mehurčkom med membrano in papirjem.

Po tem je treba gel skrbno postaviti na membrano, ki posebno pozornost nameni odsotnosti zračnih mehurčkov med gelom in membrano. Nastanek sendviča je zaključen dva sloja navlaženega filtrirnega papirja, ki se namesti na gelno površino (sl. 2). Nastali sendvič je vpeljan v kaseti in je nameščen med elektrodami, tako da se membrana sooča s anodo.

Sl. 2. Shema električnih beljakovin na membrani.

II. Elektrika

Proteini električne energije na nitrocelulozni membrani se izvajajo v pufru, ki vsebuje 25 mm Tris, pH 8,3, 192 mm glicin, 10% etanola za 30-50 minut pri konstantni napetosti 100 V.

Čas električnega soda je odvisen od velikosti prenosnih beljakovin, več beljakovin, daljši je električni sod. Ocenjena je kakovost električne energije in lokacija beljakovinskih pasov, obarvamo nitrocelulozno membrano z 0,3% raztopino Ponceau s v 1% ocetne kisline. Pred vodenjem imunokemičnega obarvanja je treba membrano večkrat splakniti šibko alkalno vodno raztopino Trisovo raztopino, da odstranite barvanje z beljakovinami.

III. Imunokemično obarvanje beljakovin imobilizirano na nitrocelulozni membrani

Če želite blokirati nonspecifične vezavne kraje protiteles, se membrana inkubira s konstantnim mešanjem pri sobni temperaturi 30 minut do PBST (za boljšo ključavnico, raztopino PBST, ki vsebuje 10% suho posneto mleko).

Po blokiranju je membrana inkubirana za eno uro pri sobni temperaturi in konstantni mešanje v PBST, ki vsebuje 1-10 μg / ml specifičnih protiteles.

Optimalna koncentracija protiteles je izbran empirično in je odvisna od afinitete interakcije protiteles z antigenom.

Na koncu inkubacije je membrana oprana 5-krat PBST in prenos na raztopino sekundarnih protiteles, konjugiramo s hrenom peroksidazo. Konjugata vzreje običajno označuje proizvajalec na embalaži, ali ga izbere raziskovalec empirično. V raztopini sekundarnih protiteles se membrana inkubira 1 uro s stalnim mešanjem.

Po temeljiti pranju (najmanj 5 - 6-krat, se PBST membrana prenese na raztopino kromogenega substrata, ki vsebuje 3 mg diaminobenzidina (dB) in 10 μl 30% vodikovega peroksida v 10 ml 0,1 M TRIS-HCl , pH 7.6.

Inkubacija se izvaja z mešanjem 5 - 10 minut. Membrana po koncu inkubacije s substratom je treba speremo s PBST, suho, žarečim s filtrirnim papirjem in takoj naredite elektronsko kopijo, skeniranje v barvi. Če je membrana popolnoma posušena, so opraskani beljakovinski trakovi bledi, slika pa je manj svetla in kontrast.

Opomba: Dub je strupena snov in potencialni rakotvorni. Delo samo v gumijastih rokavicah!

Imunoblotting - diagnostični dogodek, izveden v laboratorijskih pogojih, kar ima za posledico protitelesa na patogene različnih bolezni. Eden od teh je virus človeške imunske pomanjkljivosti. Takoj je treba omeniti, da je taka študija kot HIV imunoblotting dodaten dogodek, ki je predpisan za potrditev pozitivnih rezultatov ELISA.

Virus humane imunske pomanjkljivosti - počasi progresivna okužba. S času penetracije v telo patogenov in pred manifestacijo prvih simptomov pogosto prehaja dovolj dolgo časa, kar lahko doseže več let.

V začetni fazi razvoja so lahko klinične manifestacije odsotne. Izboljšajte skupno temperaturo, slabost, bolečino v grlu, značilne simptome okužb s HIV, oseba zmede z banalnim mrazom, okužba pa še naprej napreduje. Zato se priporočajo strokovnjaki centrov HIV, da se v takih primerih opravijo celovito diagnozo:

• Če se neobdelani spolni odnos se je zgodil z novim partnerjem;
• Če je bila uporabna brizga za enkratno uporabo ali igla, je bila ponovno uporabljena;
• Če je bila pred kratkim uporabljena tatoo ali se izvede piercing;
• Če je bila najdena druga okužba, je bila prenosna pot spolna (na primer, sifilis, bakterijska vaginoza, gonoreja);
• Če je prišlo do stika z okuženo osebo.

HIV imunoblot se izvaja z uporabo krvnega seruma ali plazme. Študija na enem traku zahteva 1,5-2 ml krvi ali 15-25 μl seruma.

Diagnostični dogodek vam omogoča, da prepoznate protitelesa ne le na virus humane imunske pomanjkljivosti, ampak tudi na druge patogene. Študija uporablja posebne sklope, značilne za različne bolezni, na primer:

• WSG1 in WSG2 IGM / IgG (za odkrivanje okužbe herpesvirus);
• Profil gorilnika IGM (za odkrivanje toksoplazmoze, rdečke, citomegalovirus okužbe, WSV 1 in WSV 2);
• Veb igmtigg (za identifikacijo virusne okužbe Epstein-Barr);
• HCV IGG (za identifikacijo virusnega hepatitisa tipa C).

Rezultat imunobrotiranja je lahko pozitiven (ko protitelesa) in negativni (če ni protiteles v biološkem materialu), kot tudi negotovo, lažno pozitivno in lažno negativno.

Kjer lahko preverite okužbo z virusom in kaj storiti naslednje

Vsak poliklinski, zasebni laboratorij, bolnišnica, klinika je specializirana za podobni diagnostični dogodek. Test lahko opravite na Centru za testiranje HIV. Nekatere zasebne klinike ponujajo svetovalne in testiranje storitev za AIDS virus in HIV doma.

POMEMBNO! Po prejemu rezultatov študije se morate obrniti na zdravnika, da dodeli ustrezno terapijo.

Pozitivni testi

Če so rezultati imunoblota pozitivni, to ne pomeni, da se okužba s HIV razvija v telesu. Za potrditev diagnoze so predpisane druge študije, na primer, posredno imunoflorescenco.

Čeprav je metoda imunoblota zelo občutljiva, vendar zaradi opredelitve imunoglobulinov razreda G, je lažni pozitivni rezultat možen v prvih treh tednih po okužbi. V tem primeru se po določenem času ponovno izvede preskus.

Vsi razlogi za pridobitev lažnega pozitivnega rezultata niso znani. Najpogostejši viri so obdobje nosečnosti in nedavna uvedba cepiva za imunskopreparanje. Če je po določenem času po določenem času, ko je izpostavljenost takšnim imunoblotskim faktorjem na HIV še vedno pozitivna, to pomeni, da je oseba okužena.

Negativen rezultat.

Imunoblot lahko daje negativen rezultat, ki signalizira odsotnost protiteles v telesu okužbe s HIV v telesu in posledično na polno zdravje.

Negativni imunoblot se pogosto opazi v "oknovem obdobju" (v prvih treh mesecih med okužbo in pojavom protiteles v krvi). V tem obdobju test ne zazna ustreznih protiteles, vendar se lahko v drugačni tekočini (sperma, ločena vaginalna) razkrije, da se izvede v velikih količinah.

Kako se izvede analiza

Imunoblot vam omogoča, da prepoznate protitelesa s preučevanjem krvi in \u200b\u200bnanašanjem gelne elektroforeze.

Najprej se izvede uničenje bakterijskih celic ali ultrazvočnih virov, po kateri je elektroforeza - ločevanje vseh virusnih antigenov ali bakterijskih celic. Posledično je na posebnem nitroceluloškem filmu postavljen komercialni reagent.

Med formulacijo imunobrotiranja na materialu z znanim antigenom se uporablja tudi testni serum. Po inkubaciji in pranju nepovezanih protiteles je bilo inkubirano, se začne imunimenska analiza, ki se uporabljajo za serum imunoglobulinov, ki so označeni z encimom, in kromogeni substrat, ki spreminja barvo pri stiku z encimom.

Če obstajajo protitelesa, se na nosilcu oblikujejo lise.

Za imunoblotiranje za HIV se krva uporablja

Linearna metoda

Linearna blots za HIV je posredna imunološka študija, ki jo dobimo s kvalitativnim kazalnikom autoantorja IgG.

Med imunološkimi raziskavami uporablja virusno snov formata HIV ali antigenov. V laboratorijskih pogojih združujejo beljakovine HIV in posameznih protiteles, ki so bili pridobljeni iz seruma. Nato se inkubacija izvaja z dodajanjem označenih protiteles in humanega imunoglobulina.

Diagnoza HIV pri novorojenčkih

V telesu otroka do 9 mesecev, rojenih iz okužene ženske, obstajajo protitelesa za HIV mamo, ki postane razlog za pridobitev lažnega pozitivnega rezultata ELISA. Iz tega razloga je prednost dana virološkim preskusom - kvantitativna analiza RNA in DNA PCR. Metoda kulture diagnostike okužbe je bolj občutljiva.

POMEMBNO! Indikacije za diagnostične ukrepe za identifikacijo okužbe s HIV pri novorojenčkih so: rojstvo okužene ženske, ki pridobi dvomljiv rezultat predhodno izvedljive analize.

Raziskave med nosečnostjo

Ker okužba z virusom HIV, lahko razvije v nosečnicah, mimo bodočega otroka, zahteva zgodnjo diagnozo za virus imunske pomanjkljivosti.

Prvič, Immunoassay analiza se izvaja kot pregled. Diagnostični dogodek pomaga zaznati protitelo okužbe v krvnemrumu. Kljub natančnim rezultatom analize med nosečnostjo je potrebna ponovno izvedba raziskav.

Raznolikost ELISA je imuna blotting, ki se pogosto uporablja med nosečnostjo. Glede na rezultate diagnoze se lahko protitelesa razkrijejo nekaterim antigenom, ki se razdelijo z molekulsko maso z elektroforezo.

Kako dobiti test

Imunsko blotting za HIV zahteva posebno usposabljanje, kot tudi druge metode diagnosticiranja bolezni. Če imate nekaj študij in dobite rezultate nekaterih kazalnikov skozi ves dan (na primer odgovor na alergene), potem je potrebno darovati kri za imunološko analizo samo zjutraj.

Dekodiranje rezultatov

Dešifriraj Rezultati imunoblota vodi laboratorijski delavec. Če smo našli 2 od 3 beljakovin HIV-1 ali HIV-2, to označuje prisotnost ustrezne okužbe v telesu. Študija se izvaja, da potrdi pozitivno analizo imunoasay. Zato se reakcija preveri za takšne beljakovine kot GP120 / 160, GP41 v kombinaciji s P24. Slednji je del treh genov pripomočkov - GAG POL in ENV.

Shematski prikaz rezultatov imunoblotiranja za HIV

Primarna diagnoza vključuje študijo P25 proteinov, GP110 / 120 in GP160, ki označuje zgodnjo fazo razvoja bolezni. S pozitivnim rezultatom, ki je dal drugi serološki encim imunoassay, se immunoblot izvede. Če je zadnji rezultat dal pozitiven rezultat, se potrdi diagnoza HIV.

Verjetnost pozitivnega rezultata je odvisna od obdobja, ki je potekal od trenutka okužbe pred diagnozo:

• 28 dni pozneje - 60-65%;
• 42 dni kasneje - 80%;
• 56 dni pozneje - 90%;
• 84 dni pozneje - 95%.

Lažni pozitivni rezultat je možen, če je bila ograja biološkega materiala za nadaljnjo diagnostiko izvedena med nosečnostjo, s kršitvijo hormonskega ozadja, dolgoročno zatiranje imunske funkcije z določenimi pripravami, ki jih ima oseba.

Merila za ocenjevanje analize

Rezultati analize ELISA in IMMUNOBLOTTING morajo izpolnjevati naslednja merila: \\ t

• blot preučevanega biološkega materiala sovpada z vzorcem primerjave blota;
• molekulska masa glavne odkrite komponente izpolnjuje zahteve specifikacije.

Rezultati, dobljeni v specializiranem laboratoriju, bodo najbolj natančni

Zaznavanje in njena vsebina mora izpolnjevati zahteve standardnega vzorčnega certifikata.

Nezazadnje rezultate

V nekaterih primerih Immunoblotting za HIV in AIDS ne ustreza negativnemu in pozitivnemu rezultatu, zdravnik ne more določiti pravega vzroka dvomljivih informacij. Pogosto je vzrok nepravilne interpretacije okužbe, ki jo povzroča drug serotip.

Za odpravo dvomov, PCR in IFA sta v dinamiki. V odsotnosti značilne bolezni simptomov za pol leta in dejavniki tveganja govorijo o polno zdravju. Na tej stopnji so diagnostični ukrepi energije.

Dušeni rezultat je mogoče pridobiti tudi pri razvoju drugačne nalezljive bolezni, raka neoplazme, alergijske reakcije.

POMEMBNO! Z dvomljivim rezultatom, oseba ne more biti krvi darovalec in drugi biološki material.

Tipične napake pri diagnozi okužbe s HIV

Ograja biološkega materiala, dostave in oblikovanja materialov, ki se uporabljajo pri izvajanju laboratorijske diagnostike, mora izpolnjevati naslednja pravila: \\ t

1. Spremljevalna dokumentacija se izda z imenom preskusnega sistema, rok uporabnosti in serije.
2. Podatki o potnem listu pregledanega, datuma, kraja vnosa biološkega materiala so v celoti označeni.
3. Serum se shrani, ne daljši od uveljavljenega obdobja, dovoljena volumna bioptata se preučuje - ne manj kot 2-5 ml.
4. Številka na steklenici ustreza določeni številki v smeri.
5. Ograja biološkega materiala se pojavi v skladu z uveljavljenimi pravili, in sicer od vene za komolce. V sestavi krvnega testa ne bi smelo biti nobenih strdkov.

Za ograjo materiala se uporablja suha cev. Novorojenci pogosto prevzamejo kapljico, kar kaže na to dejstvo v smeri.

Tipična napaka zdravnikov - shranjevanje nastalega materiala, ki je daljša od 12 ur pri sobni temperaturi in daljši od 1 dni pri temperaturi 4-8 stopinj nad Celzijam. Zaradi prihajajoče hemolize so rezultati diagnostičnega dogodka izkrivljeni.

Torej, na tipične napake med diagnozo okužbe s HIV, vključujejo:

• napačna ograja biološkega materiala;
• nepravilno skladiščenje biopsije
• nepravilen prevoz diagnostičnih sistemov;
• dolgi preskusni sistem za shranjevanje.

Tudi kakovost vode, ki se uporablja za pranje posod, vpliva rezultat, ki je nameščen v biološkem materialu.

Po prejemu rezultatov študije bi moral laboratorij delavec izdati zaključek za zdravnika. Če je bila diagnoza izvedena v "okno", predpiše diagnozo po določenem času. V vsakem primeru, da se diagnoza okužbe s HIV, ena imunoblot ni dovolj. Potrebna je celovita diagnoza.

V praksi laboratorijske diagnoze nalezljivih bolezni, včasih ni treba določiti protiteles na vseh patogen, in na določene beljakovine (antigenov), to je spekter posebnih protiteles. Če je v ta namen uporabiti metodo analize trdne faze imunoassay, potem je treba v tem primeru treba poudariti in očistiti potrebne antigene iz kulture patogena. Nastale beljakovine se uporabljajo ločeno na trdno fazo. V primeru uporabe 96-lo-nočne tablete - v vsakem vodnjak v eni vrsti antigena. Potem so specifična protitelesa določena s posrednim metodo.

Glede na prisotnost pozitivne reakcije v vodnjak z enim ali drugim antigenom, lahko presodi prisotnost ustreznih specifičnih protiteles. Te vrste imunoopimenskih testnih sistemov ponujajo proizvajalci, vendar široko razširjeni, zaradi večje informativnosti in enostavnosti izvajanja same raziskave, prejeli metodo imunskega blota (zahodni blot).

Imunsko blotting vam omogoča, da se določi protitelo v krvi hkrati in hkrati diferencirana za vse diagnostično pomembne patogene beljakovine. Prevod iz angleščine Western Blot pomeni zahodni prenos (dobesedno). Zgodba tega nenavadnega mandata je naslednja.

Učenjak južnega imena Sauser (E. Južni) leta 1975 je bil prvič predlagal način prenosa elektroforetrijev ločenih fragmentov DNK iz gela na membrano. Po mnenju avtorja je metoda in imenovala južno bloto, kar pomeni "Južni prenos". Postopek prenosa RNA molekul, nato pa je bil strokovnjaki roman Severn Blot - "Severni transfer". Sprva je bila v šali, nato pa je bilo to ime določeno v uradni znanstveni literaturi.

G. Toyubin leta 1979 je objavil rezultate prvih poskusov na beljakovinskem blobu. V nadaljevanju tradicije "geografskih" postavk metod prenosa bioloških makromolekul se je ta metoda imenovana "zahodna" prenos -Western blot.

V prvi fazi te metode se elektroforetno ločevanje zmesi patogenih beljakovin v poliakrilamidnem gelu v prisotnosti natrijevega dodecil sulfata izvede v prisotnosti natrijevega dodecil sulfata (DSN). DSN, ki je površna snov, enakomerno obdajajo beljakovinske molekule in ji daje negativno naboje približno enaka vsem. Zato se molekule gibljejo v električnem polju v eni smeri, hitrost promocije pa je odvisna samo od velikosti molekule (molekulske mase) beljakovin.

Zaradi elektroforetskega postopka se doseže gelna plošča, v debelini, od katerih se beljakovine nahajajo v obliki ločenih talnih črtovnih območij. V smeri gibanja so razdeljeni v naslednje naročilo: večja od velike molekulske mase je bližje začetku, približno 120-150 kDa, in cilj vseh beljakovin, ki tehtajo 5-10 kDa Napredno. V drugi fazi se gelna plošča uporablja za nitrocelulozni list in preprečuje ta zasnovo med elektrodami DC vira. Pod delovanjem električnega polja so beljakovine tečejo iz poroznega gela v bolj gosto membrano, kjer so trdno fiksne.

Nastalo blot se predeluje z raztopino zaklepanja, ki vsebuje brezbrižne beljakovine in / ali neionske detergente (twin 20), ki so blokirane na membrani brez antigena. Nato je membranski list narezan na ozke trakove tako, da vsak trak vsebuje vse antigenske frakcije. Opisane stopnje izvajajo proizvajalec.

V komercialnih testnih sistemih, da se določi protitelesa z metodo imunskega blotting, je že pripravljen za študijo blotov (črte, ali trakovi). Uporabnik določi celoten spekter specifičnih protiteles na patogene beljakovine v skladu s sistemom posredne metode. Kot kromogen, je topna brezbarvna snov uporabljena kot kromogen, izdelek, katerega pridobi slikanje, postane netopna in poravna (oborine) na nitrocelulozo.

Zaradi zaporednega izvajanja imunske in encimske reakcije, v prisotnosti protiteles v preučevanem vzorcu, temni prečni trakovi pojavijo na blotu, katerega lokacija se nahaja v območju nekaterih patogenskih beljakovin. Vsak taki trak označuje prisotnost posebnih protiteles na ustrezen antigen. Rezultat študije, ki jo je izvedla metoda imunskega blota, se izda v obliki prenosa protiteles na specifične patogene beljakovine. Na primer: "Protitelesa na beljakovine P17 in P24 se razkrijejo."

Nitrocelulozna blots po manifestaciji se lahko shrani dolgo v suho obliko. Vendar pa je intenzivnost barve hkrati bistveno oslabljena. Mokri blots se lahko fotografirate ali uporabljajo skenerje, da vnesejo svojo grafično sliko v spomin na osebne računalnike. Posebni računalniški programi omogočajo obdelavo dobljenih rezultatov in hitro spremljate spekter zvočnikov protiteles med dinamičnim opazovanjem.

Imunoblotting (Immunoblot) je zelo specifična in zelo občutljiva referenčna metoda, ki potrjuje diagnozo pri bolnikih s pozitivnimi ali negotovimi rezultati analiz, pridobljenih vklj. Z uporabo RPGA ali IFA .

Ta metoda odkrivanja protiteles na posamezne antigene patogena temelji na formulaciji ELISA na nitroceluloznih membranah, ki so v obliki ločenih pasov nagnjeni k specifičnim beljakovinam, ločenim z gel elektroforezo. Če obstajajo protitelesa proti določenim antigenom - se v ustreznem traku traku pojavi temna črta. Edinstvenost imunoblota je sestavljena iz njegove visoke informativnosti in zanesljivosti dobljenih rezultatov.

Material za raziskave Je serumska ali krvna plazma. Za študij na istem traku je potrebna 1,5-2 ml krvi ali 15-25 μl seruma.

Po priporočilu WHO se imunoblotiranje (Western blot) uporablja pri diagnozi okužbe s HIV kot dodatno strokovno metodo, ki mora potrditi rezultate ELISA. Običajno ta metoda preveri pozitiven rezultat za ELFA, saj se šteje za bolj občutljivo in specifično, čeprav bolj zapleteno in drago.

Imunsko blot združuje imunsko-imunimalno analizo (ELISA) s predhodno elektroforetno ločevanje virusnih beljakovin v gelu in njihovega prenosa na membrano nitroceluloze. Postopek imunoblota je sestavljen iz več faz. Prvič, predhodno prečiščeni in uničeni na kompozitne komponente HIV, je izpostavljen elektroforezi, medtem ko so vsi antigeni, vključeni v virus, ločeni z molekulsko maso. Nato se metoda za blotting antigena prenese iz gela v trak nitroceluloze ali najlonskega filtra, ki od zdaj naprej vsebuje neviden spekter beljakovin, značilnih za HIV. Nadalje, material (serum, pacient krvna plazma itd.), Se uporablja na traku, in če obstajajo posebna protitelesa v vzorcu, so povezane z strogo ustreznimi trakovi beljakovin-antigenov. Kot posledica naknadnih manipulacij (podobno IFA) je rezultat te interakcije vizualiziran - je narejen viden. Prisotnost trakov na določenih delih traku potrjuje prisotnost protiteles v preučevanem serumu, da strogo definirajo antigene HIV.

Imunsko blot se najpogosteje uporablja za potrditev diagnoze okužbe s HIV. Kdo meni, da pozitivne serumi, v katerih protitelesa na katere koli dve proteini HIV lupine zaznajo s imunskim blotom. Po teh priporočilih, če obstaja reakcija samo z enim od lupinskih proteinov (GP160, GP120, GP41) v kombinaciji ali brez reakcije z drugimi beljakovinami, je rezultat, ki se šteje za dvomljivo in ponovno preučevanje priporočamo z uporabo niza druge serije ali drugo podjetje. Če po tem rezultat ostaja dvomljivo, se raziskava nadaljuje vsake 3 mesece.

Lastnosti

Analiza Imunoblota je zanesljiva metoda, ki vam omogoča, da določite prisotnost protiteles do antigenov HIV prvega in drugega tipa. Če je oseba okužena, protitelesa, ki jih je mogoče zaznati, in veliko kasneje pa se pojavijo v dveh tednih. Značilnost HIV je, da se količina protiteles hitro poveča in se ohrani v pacientovi krvi. Tudi če so prisotni, se bolezen ne sme manifestirati v dveh ali več letih. Metoda ELISA ne natančno določa prisotnosti bolezni, zato potrditev rezultatov z imunoblotiranjem in PCR, če je imunskoasimenzionalna analiza pokazala pozitiven rezultat.

Indikacija za imenovanje.

Kaj je "Imunoblot" že ugotovljeno, toda kdo predpisuje to študijo? Razlog za preskuse za virus imunske pomanjkljivosti (HIV) z metodo imunablota postane pozitiven rezultat ELISA. Potrebno je iti skozi analizo imunoferancije bolnikom, ki bodo upravljani. Poleg tega je treba analizirati ženske, ki načrtujejo nosečnost, pa tudi vsakogar, ki vodi grdo spolno življenje. Imunoblotiranje bolnikov z virusom HIV, če rezultati IFA povzročajo dvome.

Naslednji moteči simptomi lahko postanejo razlog za privlačnost zdravnika:

• ostra hujšanja;
• šibkost, izguba uspešnosti;
• črevesne motnje (driska), ki se nadaljuje tri tedne;
• dehidracija telesa;
• vročina;
• povečanje bezgavk na telesu;
• razvoj kandidiaze, tuberkuloze, pljučnice, toksoplazmoze, poslabšanja herpes.

Pacienta ni treba pripraviti pred predaji venske krvi. 8-10 ur pred študijo ni mogoče jesti. Ni priporočljivo za dan, preden se krva uporablja za uporabo alkoholnih in kavnih napitkov, se ukvarjajo z močno vadbo, mahanje razburjenja.

Kako je študija?

Z vidika bolnika se imunoblot ne razlikuje od druge analize: venska krvi se preiskuje, rezultat pa se raziskuje in rezultat. Ampak, če greš malo več podrobnosti, ni zelo preprosta, vendar še vedno poskušam ugotoviti.

Sprva, na rastlini reagenta, se vzame "referenčni" virus človeške imunske pomanjkljivosti. Potem s pomočjo posebnega postopka (elektroforeza) v okolju gela, se virus uniči na svoje najmanjše komponente: beljakovine (virusne antigene). Potem, s pomočjo blotting samega (iz angleščine), se delci dajo na poseben material - nitroceluloza ali najlon filter, indikator je pripravljen za uporabo, tako imenovani trak. Strip je trak, v katerem so antigeni razdeljeni glede na njihovo molekulsko maso, v jasnem zaporedju, to je vsak milimetrski papir ustreza določenemu proteinu.

Kot veste, če obstajajo virusi v krvi osebe, telo začne proizvodnjo protiteles proti njihovim školjkam (definiranih beljakovin) protiteles in kaj za vsak virus ima svoj posamezni antigen beljakovin. Identifikacija protiteles do antigenov beljakovin v krvi je osnova metode imunoblota. Konec koncev, če protitelo se sooča z antigenom, zagotovo sodelujejo med seboj - "Stick".

Torej, antigeni so na traku traku in, v primeru prisotnosti v krvi osnovnih primernih antigenov, nujno nujno komunicirajo drug z drugim, in na tem mestu, na traku traku, se prikaže indikator - stanovanje (kot preskus nosečnosti). In na določenem kraju traku, zato bo zdravnik razumel, ali obstaja niz beljakovin, značilen za določen virus v krvi.

Torej, na primer, če je center zatemnitve na lokaciji beljakovin gP160, GP120, GP41hIV je diagnosticiran, za druge viruse, bo popolnoma drugačen sklop beljakovin.

Opozoriti je treba, da Imunoblot vam omogoča, da natančno vzpostavite prisotnost virusa samo, če je komplet protiteles v krvi končana, to je, če so beljakovine GP160, GP120, GP41 prisotni hkrati, potem je 100 Okužba z virusom HIV. Ampak, če vsaj eden ni, na primer: GP41 je odsoten, in obstaja samo GP160, GP120, potem se preskus šteje za dvomljiva in zahteva ponovitev.

FAQ.

Katere stopnje vključujejo imunoblot?

1. Priprava traku.Pre-prečiščena in uničena na kompozitne komponente, imunsko pomanjkljivost (HIV) je izpostavljena elektroforezi, medtem ko so antigeni, vključeni v HIV, ločeni z molekulsko maso. Nato z blottingom (analog ekstrudiranja na "mokrih" odvečnih črnila "se antigeni prenesejo na nitrocelulozni trak, ki od zdaj naprej vsebuje nevidno podobo antigenske striptične spektra karakteristike HIV.
2. Vzorčna študija.Preskusni material (serum, plazma v krvi bolnika itd.) Uporablja se na nitroceluloškem traku), in če obstajajo posebna protitelesa v vzorcu, so povezane s strogo ustrezajo jim (complimentary) antigenske trakove. Zaradi poznejših manipulacij je rezultat te interakcije vizualiziran - to je bilo vidno.
3. Razlaga rezultata.Prisotnost pasov na nekaterih območjih nitrocelulozne plošče potrjuje prisotnost v preučevanih serumih protiteles do strogo opredeljenih antigenov HIV.

• Strip A - Pozitivna kontrola
• Strip In - slabosti
• Strip C - negativna kontrola
• Strip D je pozitiven vzorec (zaznana je bila prisotnost protiteles do HIV-1)

Kako dešifrirati analizo?

Če je IFA pokazala prisotnost vseh ali skoraj vseh protiteles do antigenov po tem preskusnem sistemu, to pomeni pozitivno analizo HIV. Če je odgovor po drugem serološkemu imunološke analize pozitiven, je treba izvesti imunoblot. Dekodiranje rezultatov bo bolj pravilno. Če je analiza encimske imunoasala dala pozitiven rezultat, je tudi naslednja analiza imunoblota pokazala HIV, nato pa je končni rezultat nastavljen.

Ko so analize dešifrirane, je treba vedeti, da je pozitiven preskus HIV določena z:

• od 60% na 65% 28 dni po okužbi;
• v 80% - po 42 dneh;
• 90% - po 56 dneh;
• 95% - po 84 dneh.

Če je prejeti pozitiven odziv HIV, bo to pomenilo, da se protitelesa na virus razkrijejo. Da bi se izognili lažnemu pozitivnemu odzivu, morate ponovno prenesti analize, je zaželeno dvakrat. Če se protitelesa proti imunske pomanjkljivosti razkrijejo med dobavo dveh analiz dveh ali z predajo 3 testov v 2, se šteje, da je rezultat pozitiven.

Antigen R 24 se lahko po 14 dneh od datuma okužbe razkrije v krvi. Z uporabo metode imunimalne analize se ta antigen zazna od 14 do 56 dni. Po 60 dneh ni več v krvi. Šele ko se v telesu oblikuje aids, se rast tega beljakovine P24 v krvi ponovi. Zato se preskusni sistemi analize imunoperja uporabljajo za zaznavanje HIV v prvih dneh okužbe, da se ugotovi, kako se bolezen pojavi in \u200b\u200bspremlja postopek zdravljenja. Visoka analitična občutljivost imunopermentalne analize zazna antigena P24 v biološkem materialu v HIV prvega podtipa pri koncentraciji od 5 do 10 pkg / ml, z drugim podtipom HIV 0,5 ng / ml / ml in manj.

Spodaj dvomljiv Rezultat imuno-encimske analize je namenjen, da se je med diagnozo nekje napačno zamenjal medicinski delavci, ali so pri ljudeh obstajali znaki okužbe, rezultat pa je negativen, kar povzroča sum, ki povzroča sum, oseba je posredovana ponovna ocena.

Spodaj lažno pozitiven Rezultat je rezultat, ko je bila izvedena preskuse krvi v naslednjih bolnikovih državah:

• nosečnost;
• Če ima oseba kršeno hormonsko ozadje;
• s podaljšano imunosupresijo.

Kako dešifrirati analizo v tem primeru? Lažni pozitivni rezultat je nameščen, če se razkrije vsaj en beljakovin. Zaradi dejstva, da je antigen P24 zelo odvisen od posameznih različic, nato z uporabo te metode, se v prvem obdobju okužbe zazna z 20% na 30% bolnikov.

Kako zanesljiv je pozitiven rezultat testa?

Včasih ima IFA lažne pozitivne rezultate (približno 1% primerov), vzrok tega rezultata je lahko nosečnost, različne virusne okužbe, kot tudi preprosta nesreča. Po prejemu pozitivnega rezultata je bolj natančen test - imunoblot, ki temelji na rezultatih, od katerih je izdelana diagnoza. Pozitivni rezultat imunoblota po pozitivni ELISA je zanesljiv za 99,9% - to je največja natančnost za vsak medicinski preskus. Če je imunoblot negativen, to pomeni, da je bil prvi test napačen pozitiven, in v resnici HIV pri ljudeh.

Kaj je nedoločen (dvomljiv) rezultat?

Če je IFA pozitivna ali negativna, je lahko imunoblot pozitiven, negativen ali negotov. Nedoločen rezultat imunoblota, t.j. Prisotnost vsaj enega proteina v imunoblotu se lahko opazi, če se je okužba pred kratkim zgodila, in obstaja manj protiteles za HIV v krvi, v tem primeru bo imunoblot po nekaj časa postal pozitiven. Tudi nedoločen rezultat se lahko pojavi v odsotnosti okužbe s HIV v hepatitisu, nekatere kronične presnovne bolezni ali med nosečnostjo. V tem primeru bo imunoblot negativen, ali pa bo ugotovljen vzrok negotovega rezultata.

Koliko je analiza?

Imunoblot na HIV ne velja za poceni raziskave. V povprečju, pregled presejanja z imunoferment metode stane od 500 do 900 rubljev. Imunoblotiranje je študija preverjanja, katere stroške se gibljejo od tri do pet tisoč rubljev. Bolj zapletene metode so veliko dražje. Na primer, za analizo verižne reakcije polimeraze (PCR), bo potrebno plačati približno 12.000 rubljev.

Kje narediti analizo?

Kje lahko prenesem HIV? ELISA, Imunoblotova raziskava se izvaja v mestnih zasebnih klinikah, rezultati se izdajo čez dan. Nujna diagnostika je možna. V državnih zdravstvenih ustanovah se preskusi IFA in imunobrotiranje izvajajo brezplačno, v skladu z zakonodajo Ruske federacije. V obveznih, so nosečnice pregledane za nalezljive bolezni, pa tudi bolnike, ki imajo hospitalizacijo ali operativno posredovanje.

Solidna faza epizoda - možnost preskusa, ko je ena od komponent imunske reakcije (antigen ali protitelesa), ki je na trdnem nosilcu, na primer, v vodnjakih polistirena tablete. Komponente se zaznajo z dodajanjem označenih protiteles ali antigenov. S pozitivnim rezultatom se barva kromogena razlikuje. Vsakič po dodajanju naslednje komponente iz vodnjakov, nepristranski reagenti odstranijo s pranjem,

Pri določanju protiteles (leva risba) v vodnjakih s sorbed antigenom, zaporedno dodamo serum pacienta, antihiklobulin serum, označen z encimom, in substrat / kromogen za encim.

II. Pri določanju antigena (desna slika) v vodnjakih s sorbed protitelesi je antigen izdelan (na primer. Serum z višinsko antigenom), diagnostični serum proti IT in sekundarnimi protitelesi (proti diagnostični serumu), označen z encimom, in nato substrat / kromogen za encim.

Konkurenčna IFA. za določitev antigenov: želeni antigen in encimsko označen antigen tekmujejo med seboj za vezavo omejenega števila imunskih serumskih protiteles.

Drugi preskus je konkurenčna ELISA, da določi protitelesa: želena protitelesa in protitelesa, označena s protitelesi, ki se med seboj tekmujejo za antigene, sorbed na trdni fazi.

Imunobloting. - Visoko občutljiva metoda zaznavanja beljakovin, ki temeljijo na kombinaciji elektroforeze in ELISA ali RIA. Imunoblotiranje se uporablja kot diagnostična metoda za okužbo s HIV itd.

Antigeni patogena so ločeni z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu, nato pa jih prenesejo iz gela na aktivirano papirno nitrocelulozno membrano in razstavljajo uporabo ELISA. Podjetja proizvajajo takšne trakove z "bloti" antigenov. Za te trakove se uporablja bolni serum. . Potem, po inkubaciji, se ukradejo iz nereaktivnih protiteles bolnika in seruma proti humanim imunoglobulinom, označeno z encimom . (Antigen + antigena antigena + antigena + antigena antigena antigena antigena antigena osebe] je zaznana z dodajanjem kromogenega substrata, ki spreminja barvo pod delovanjem encima.

52. Interferoni, narava. Metode za pridobitev in uporabo.

Interferon.se nanaša na pomembne zaščitne beljakovine imunskega sistema. Odprto pri preučevanju vmešavanja virusov, tj. Pojavov, ko živali ali kulture celic, okuženih z enim virusom, postala neobčutljiva na okužbo z drugim virusom. Izkazalo se je, da je motnje posledica nastalega proteina z zaščitno protivirusno lastnino. Ta protein je bil imenovan interferon.

Interferon je družina glikoproteinskih proteinov, ki se sintetizirajo po celicah imunskega sistema in vezivnega tkiva. Odvisno od teh celic je interferon sintetiziran, tri vrste so izolirani: α, β in γ-interferoni.

Alpha interferon.proizvaja levkocite in prejel ime levkocitov; beta interferon.imenovan fibroblastičen, saj je sintetiziran s fibroblasti - vezivni tkivni celice, in gama interferon.- Imun, kot ga ustvarijo aktivirani T-limfociti, makrofagi, naravni morilci, i.e. imunske celice.

Interferon se nenehno sintetizira v telesu, njegova koncentracija krvi pa se hrani na ravni približno 2 me / ml (1 mednarodna enota - jaz je količina interferona, zaščita celične kulture od 1 CPD 50 virus). Proizvodnja interferona se močno poveča, ko se okuži z virusi, pa tudi, ko je izpostavljen interferonom induktorjem, kot so RNA, DNA, kompleksni polimeri. Takšen interferonski induktorji so dobili ime interferonogen.

Poleg protivirusnega delovanja ima interferon zaščito protitumora, saj zamuja širjenje (reprodukcija) tumorskih celic, kot tudi imunomodulatorno dejavnost, ki spodbuja fagocitozo, naravne morilce, prilagajanje protiteles v celicah, ki aktivirajo izraz glavne kompleksa histokompatibilnosti.

Mehanizem ukrepainterferon je zapleten. Interferon neposredno na virus zunaj celice ne deluje, vendar je povezan s posebnimi celičnimi receptorji in vpliva na proces reprodukcije virusa znotraj celice na fazi sinteze beljakovin.

Uporaba interferona. Učinek interferona je učinkovitejši, kot preden začne sintetizirati ali vstopiti v telo od zunaj. Zato se uporablja z profilaktičnim ciljem z mnogimi virusnimi okužbami, kot so gripa, kot tudi s terapevtskimi namenom pri kroničnih virusnih okužbah, kot so parenteralni hepatitis (B, C, D), herpes, multipla skleroza itd. Pozitivni rezultati pri zdravljenju malignih tumorjev in bolezni, povezanih z imunodeficial.

Interferoni imajo specifičnost vrst, t.j., človeški interferon je manj učinkovit za živali in obratno. Vendar pa je ta posebnost vrst relativna.

Pridobitev interferona. Interferon se pridobivata na dva načina: a) z okužbo levkocitov ali limfocitov človeških krvi z varnim virusom, zaradi katere se okužene celice sintetizirajo z interferonom, ki se nato izolira in oblikuje pripravke interferona; b) Genetsko inženirsko metodo - z gojenjem v proizvodnih pogojih rekombinantnih bakterijskih sevov, ki lahko proizvajajo interferon. Uporabljajo se rekombinantni sevi pseudomonad, črevesne palice z interferonskimi geni, ki so vgrajeni v njihovo DNK. Interferon, pridobljen z metodo genskega inženiringa, se imenuje rekombinantni. V naši državi je rekombinantni interferon prejel uradno ime "Refaferon". Proizvodnja tega zdravila je v veliki meri učinkovitejša in cenejša od levkocitov.

Rekombinantni interferon se je v medicini široko uporabljal kot preventivno in terapevtsko sredstvo za virusne okužbe, neoplazme in imunodeficient.