Examinarea serului sanguin folosind metoda IFA. Analiza ELISA: ce este? de ce este nevoie? avantajele și dezavantajele metodei. Ce este ELISA

5.1 Esența și clasificarea ELISA.

ELISA a apărut la mijlocul anilor '60 și a fost dezvoltat inițial ca metodă de identificare a antigenului într-un eșantion histologic, precum și pentru vizualizarea liniilor de precipitare în testele de imunodifuzie și imunoelectroforeză, iar apoi a început să fie utilizat pentru determinarea cantitativă a antigenelor și anticorpilor în fluide biologice. La dezvoltarea metodei au luat parte E. Engvall și R. Pählman, precum și, în mod independent, W. Van Weeman și R. Schurs.

Orez. 6 Principiul de bază al ELISA:

pentru a identifica antigenele; 2) pentru a detecta anticorpi

Metoda se bazează pe legarea specifică a unui anticorp la un antigen, cu unul dintre componente conjugat la o enzimă; ca rezultat al reacției cu substratul cromogen corespunzător, se formează un produs colorat, a cărui cantitate poate fi determinată. spectrofotometric (Fig. 6).

Descoperirea posibilității de a imobiliza antigenul și anticorpul pe diferiți purtători, menținând în același timp activitatea lor de legare, a făcut posibilă extinderea utilizării ELISA în diferite domenii ale biologiei și medicinei.

Apariția anticorpilor monoclonali a contribuit la dezvoltarea ulterioară a ELISA, ceea ce a făcut posibilă creșterea sensibilității, specificității și reproductibilității rezultatelor.

Teoretic, ELISA se bazează pe date din imunochimia modernă și enzimologia chimică, cunoașterea legilor fizico-chimice ale reacției antigen-anticorp, precum și pe principiile principale ale chimiei analitice. Sensibilitatea ELISA și timpul necesar sunt determinate de mai mulți factori principali: caracteristicile cinetice și termodinamice ale reacției antigen-anticorp, raportul de reactivi, activitatea enzimei și rezoluția metodelor sale de detectare. ÎN vedere generala Reacția antigen-anticorp poate fi descrisă printr-o schemă simplă:

+[AG]↔[ATAG]

O varietate de obiecte de cercetare de la compuși cu molecul scăzut la viruși și bacterii, precum și un extraordinar cerc larg problemele asociate cu varietatea condițiilor de utilizare a ELISA conduc la dezvoltarea unui număr extrem de mare de variante ale acestei metode.

Orice versiune de ELISA conține 3 etape obligatorii:

1. stadiul recunoașterii compusului de testat de către un anticorp specific acestuia, care duce la formarea unui complex imun;

2. etapa de formare a legăturii conjugatului cu complexul imun sau cu situsuri de legare libere;

3. etapa de conversie a etichetei enzimatice într-un semnal înregistrat. Clasificarea metodelor ELISA se bazează pe mai multe abordări:

1. Pe baza tipului de reactivi prezenți în prima etapă a ELISA, se disting metodele competitive și necompetitive.

A) Într-un ELISA competitiv, în prima etapă, sistemul conține atât compusul analizat, cât și analogul său, marcat cu o enzimă și concurând cu aceasta pentru situsuri de legare specifice.

B) Metodele necompetitive se caracterizează prin prezența în sistem la prima etapă a doar compusului analizat și a centrilor de legare specifici acestuia.

2. Toate metodele ELISA sunt împărțite în omogene și eterogene.

Dacă toate cele trei etape ale ELISA au loc în soluție și între etapele principale nu există etape suplimentare pentru separarea complexelor imune formate de componentele nereacționate, metoda aparține grupului celor omogene.

Baza ELISA omogenă, utilizată, de regulă, pentru determinarea substanțelor cu molecul scăzut, este inhibarea activității enzimei atunci când se combină cu un antigen sau anticorp. Activitatea enzimatică este restabilită ca rezultat al reacției antigen-anticorp.

Când un anticorp se leagă la un antigen care conține o etichetă enzimatică, activitatea enzimatică este inhibată cu 95% față de substratul cu greutate moleculară mare, ceea ce se datorează excluderii sterice a substratului din centrul activ al enzimei. Pe măsură ce concentrația de antigen crește, se leagă mai mulți anticorpi și rămân mai mulți conjugați antigen-enzimă liberi, capabili să hidrolice substratul cu greutate moleculară mare. Analiza se efectuează foarte rapid, o determinare necesită 1 minut. Sensibilitatea metodei este destul de mare. Poate fi folosit pentru a determina o substanță la nivel de picomol.

Metodele eterogene se caracterizează prin analiza într-un sistem în două faze cu participarea unei faze de purtător solid și o etapă obligatorie de separare a complexelor imune de componentele nereacționate (spălare), care se află în faze diferite (complexele imune formate sunt pe faza solidă și complecșii nereacționați sunt în soluție). Metodele eterogene în care formarea complexelor imune în prima etapă are loc pe faza solidă se numesc metode în fază solidă.

Metodele sunt clasificate ca omogen-eterogene dacă etapa 1 - formarea de complexe specifice are loc în soluție, iar apoi se folosește o fază solidă cu un reactiv imobilizat pentru a separa componentele.

3. Conform principiului determinării substanței de testat:

A) Determinarea directă a concentrației unei substanțe (antigen sau anticorp) prin numărul de situsuri de legare care interacționează cu aceasta. În acest caz, eticheta enzimatică va fi localizată în complexul specific AG-AT format. Concentrația analitului va fi direct proporțională cu semnalul înregistrat.

B) Determinarea concentraţiei unei substanţe prin diferenţă numărul total site-uri de legare și site-uri de legare libere rămase. În acest caz, concentrația analitului va crește, iar semnalul înregistrat va scădea; prin urmare, în acest caz există o dependență inversă de mărimea semnalului înregistrat.

5.2 Caracteristicile componentelor utilizate în ELISA.

Enzime.

Etichetele enzimatice au un efect catalitic extrem de puternic; o moleculă de enzimă poate reacționa cu un număr mare de molecule de substrat. Astfel, o enzimă prezentă în cantități mici poate fi identificată și cuantificată prin formarea produselor și reacția pe care o catalizează. Un alt avantaj al utilizării enzimelor ca marcaje se datorează prezenței în moleculă a numeroase grupări funcționale (residuuri sulfhidril, carboxil, tirazină etc.), prin care moleculele de ligand pot fi atașate covalent.

Markerii enzimatici utilizați în ELISA trebuie să aibă următoarele proprietăți:

– activitate ridicată și stabilitate a enzimei în condiții analitice, atunci când este modificată și în conjugare cu anticorpi sau alte proteine;

– prezența substraturilor sensibile și simplitatea metodei de determinare a produselor sau substraturilor reacției enzimatice;

– capacitatea de a adapta sistemele de substrat la consolidarea ulterioară;

– absența enzimei și a inhibitorilor săi în cele studiate fluid biologic.

Cel puțin 15 enzime diferite pot fi utilizate în ELISA. Cele mai utilizate, în conformitate cu cerințele de mai sus, sunt peroxidaza de hrean (HRP), fosfataza alcalină (ALP) și β-D-galactozidaza. Toate trei sunt stabile și catalizează reacții extrem de sensibile. În plus, produsele rezultate din reacțiile catalizate de aceste enzime, în funcție de substratul utilizat, pot fi detectate nu numai prin metode colorimetrice, ci și prin metode fluorescente. Alte enzime sunt folosite mult mai rar. Acest lucru se explică prin activitatea lor specifică mai mică în comparație cu PC și AP.

Substraturi.

Alegerea substratului este determinată în primul rând de enzima utilizată ca etichetă, deoarece reacția enzimă-substrat este foarte specifică.

Cerințe de bază pentru substrat:

– asigurarea unei sensibilități ridicate a metodei în depistarea enzimei din conjugat;

– formarea de produși de reacție enzimă-substrat bine recunoscuți (de exemplu, colorați);

– substratul trebuie să fie sigur, ieftin, accesibil și convenabil de utilizat.

Mai des, se folosesc substraturi cromogene care, atunci când sunt distruse, formează o substanță colorată. Utilizarea substraturilor de înaltă energie – fluorescente, chemiluminiscente – este promițătoare. Utilizarea unor astfel de substraturi face posibilă creșterea teoretică a sensibilității ELISA cu două ordine de mărime.

Formarea unui conjugat.

Un conjugat este un antigen sau anticorp marcat cu o etichetă enzimatică. Formarea unui conjugat este una dintre etape importante efectuarea ELISA.

La formarea unui conjugat, metoda optimă de introducere a unei etichete enzimatice este selectată astfel încât ambele componente ale conjugatului să-și păstreze activitatea biologică: enzima - capacitatea de a interacționa cu substratul și antigenul sau anticorpul - antigenitatea și activitatea de legare a antigenului. , respectiv. Prezența unui antigen marcat, înalt purificat permite utilizarea metodelor competitive. În acest caz, în etapa finală este posibilă măsurarea activității conjugatului care nu este asociat cu anticorpii imobilizați, ceea ce evită procedura de spălare și face analiza mai convenabilă. Cu toate acestea, antigenele sunt diverse în proprietățile lor fizico-chimice și structura, ceea ce înseamnă că este imposibil să se dezvolte metode universale pentru obținerea unui conjugat cu un antigen. În acest caz, obținerea unui conjugat antigen-enzimă este o sarcină complexă separată. Prepararea anticorpilor marcați pentru ELISA este metodic mai accesibilă.

Conjugarea enzimei cu proteine active imunochimic se realizează prin diferite metode: reticulare chimică, legarea covalentă a moleculei de enzimă la Ag sau AT și formarea de compuși prin legături necovalente, de exemplu, atunci când conexiunea dintre enzimă şi Ag sau AT este efectuată imunologic, prin interacţiunea antigen-anticorp.

Cele mai utilizate sunt metodele covalente de preparare a conjugatelor. Alegerea reacției de legare este determinată de tipul de grupări funcționale disponibile în moleculele de proteine date. Glutaraldehida, periodatul de sodiu etc. sunt utilizate ca reactivi utilizați pentru a introduce enzima în moleculele de antigen și anticorp.

Există metode într-o etapă și în două etape pentru obținerea conjugatelor folosind glutaraldehidă. Se pot forma conjugate de diferite dimensiuni cu activitate enzimatică redusă (15 - 60% din enzima liberă). Conjugatul rezultat dimensiuni mari poate împiedica steric determinarea substanței de testat. Conjugatele cu o greutate moleculară relativ mică constau dintr-un fragment Fab și o moleculă de enzimă.

Ca rezultat al sintezei în două etape, care constă în producerea pas cu pas a unei enzime modificată mai întâi cu un agent de reticulare, izolarea acesteia și apoi interacțiunea ulterioară cu un antigen (anticorp), moleculele unui se formează o compoziție omogenă, care conține 1-2 molecule de enzime per moleculă de imunoglobulină și menținând o activitate enzimatică și imunologică ridicată. Cu toate acestea, numărul de astfel de conjugați formați este mic (pentru peroxidaza de hrean este de 5-10%).

Cea mai mare aplicație practică a fost găsită în metoda de obținere a imunoperoxidazei conjugate, bazată pe oxidarea componentei glucide a enzimei cu periodat de sodiu (legarea peroxidazei în conjugat ajunge la 70-90% din cantitatea inițială de enzimă).

Un conjugat de încredere trebuie să aibă următoarele proprietăți:

Rezistență ridicată a anticorpilor și afinitate mare pentru antigen, astfel încât acesta să poată fi utilizat în diluție mare și astfel să reducă legarea nespecifică;

Specificitate suficientă în diluția de lucru;

Predominanţa formelor monomerice asupra celor polimerice, deoarece formele polimerice tind să adere nespecific la plastic, rezultând un nivel de fond ridicat de reacție;

Raportul molar optim între enzimă și anticorpi (raportul optim este de aproximativ 1:1);

Activitate enzimatică suficientă a conjugatului. Această proprietate este determinată în principal de condițiile de conjugare și de raportul dintre moleculele de enzimă și anticorpii din conjugat.

5.3 Metode ELISA eterogene.

ELISA eterogene (sau ELISA în fază solidă) includ metode în care analitul este prezent în două faze. Pentru a separa componentele unei reacții imunochimice, se folosește o fază solidă (un purtător insolubil, de obicei plastic) cu anticorpi sau antigen imobilizat pe ea, care este spălată în fiecare etapă pentru a îndepărta componentele intermediare și nereacționate.

Imobilizarea poate fi efectuată prin legarea covalentă a anticorpilor (antigenilor) la un purtător activat folosind abordări chimice, precum și prin adsorbția fizică a anticorpilor (antigenilor) pe suprafața polimerilor solizi (de exemplu, plăci de polistiren). În literatura străină, această direcție se numește test ELISA sau test imunosorbent legat de enzime.

ELISA necompetitiv pentru determinarea antigenelor folosind exemplul de utilizare a anticorpilor specifici marcați cu enzimă și a anticorpilor imobilizați.

O soluție care conține antigenul analizat este adăugată la purtătorul cu anticorpi imobilizați. În timpul procesului de incubare, se formează un complex specific antigen-anticorp. Apoi purtătorul este spălat de antigenele nelegate și se adaugă anticorpi marcați - un conjugat. În acest caz, cantitatea de conjugat legat este direct proporțională cu cantitatea de antigen din proba de testat. După incubarea secundară și îndepărtarea excesului de conjugat, se adaugă un substrat cromogen pentru enzima utilizată, care își schimbă culoarea sub acțiunea enzimei, adică are loc o reacție enzimatică cu colorarea soluției în godeuri. Gradul de colorare este direct proporțional cu cantitatea de anticorpi specifici marcați cu enzima, enzima și, în consecință, antigenul studiat. Măsurătorile densitate optica soluția în godeuri la o anumită lungime de undă (în funcție de substratul utilizat) se realizează folosind spectrofotometre speciale adaptate pentru cititoarele de microplăci. O evaluare cantitativă a concentrației de antigen din probă se determină prin compararea rezultatelor cu o curbă de calibrare a dependenței densității optice a soluției de concentrația soluției standard de antigen.

Figura 7.

Deoarece în stadiul identificării unui imunocomplex specific, antigenul este asociat cu molecule de anticorpi imobilizați și marcați, în literatură această metodă este adesea numită metoda „sandwich” (din engleză sandvich) sau metoda ELISA cu două locuri (din testul englezesc cu două locuri).

Această metodă poate fi utilizată pentru a analiza numai acele antigene care au cel puțin doi determinanți antigenici pe suprafața lor. Este inacceptabil pentru analiza unui număr mare de antigene monovalente (compuși medicinali, pesticide etc.).

Avantajul principal aceasta metoda- sensibilitate crescută. Limita de detecție a compușilor prin această metodă atinge în prezent o valoare de aproximativ 10-21 moli, ceea ce corespunde detectării a doar 600 de molecule de analit într-o probă. Sensibilitatea maximă este atinsă atunci când fiecare reacție imunologică este efectuată în echilibru, ceea ce afectează durata analizei, care este în medie de 4-6 ore. ELISA necompetitiv pentru determinarea anticorpilor folosind exemplul de utilizare a anticorpilor secundari marcați cu enzimă și a antigenelor imobilizate.

Serul de testat este adăugat la antigenul imobilizat. După incubarea și spălarea anticorpilor nelegați, se adaugă anticorpi secundari marcați care sunt specifici anticorpilor analizați. După incubarea secundară și îndepărtarea excesului de anticorpi secundari marcați, conținutul etichetei enzimatice de pe purtător este proporțional cu concentrația de anticorpi specifici din ser.

Această schemă este una dintre cele mai comune ELISA pentru detectarea anticorpilor, deoarece permite detectarea anticorpilor la diferiți antigeni.

ELISA competitiv eterogen pentru determinarea antigenului folosind exemplul de utilizare a antigenului marcat și a anticorpilor imobilizați.

La anticorpii imobilizați pe purtător se adaugă o soluție care conține antigenul analizat și o concentrație fixă de conjugat antigen-enzimă. După incubare, purtătorul este spălat de antigenul liber și marcat nelegat și se înregistrează activitatea enzimatică pe purtător, care este invers proporțională cu concentrația antigenului care se determină.



5.4 Metoda ELISA omogenă.

Testul imunoenzimatic omogene (HELISA) este cel mai simplu din punct de vedere metodologic tip de ELISA. Când se efectuează, unul dintre participanții la reacția imună (de obicei un antigen cu greutate moleculară mică) este marcat cu o enzimă și se monitorizează progresul formării complexului antigen-anticorp, înregistrând modificările activității enzimatice.

O astfel de încălcare a activității enzimatice poate apărea fie din cauza separării spațiale a enzimei și substratului, fie din cauza modificărilor conformaționale ale moleculei de enzimă care însoțesc formarea complexului imun. HIFA are o serie de avantaje semnificative față de alte metode imunochimice. În primul rând, expresia ridicată (întreaga analiză folosind HIFA durează minute și chiar fracțiuni de minute).

Orez.8 Opțiuni de imunotest enzimatic omogene(A - efectul separării enzimei (F) și a substratului (C) din cauza obstacolelor sterice în timpul interacțiunii antigenului (Ag) și anticorpului (Ab); B - efectul modificării conformației enzimă în timpul formării complexului antigen-anticorp).

În al doilea rând, metoda este într-o singură etapă și nu necesită pași de spălare intensivi în muncă și consumatoare de timp. Și în sfârșit, în al treilea rând, metoda necesită volume minime (8-50 μl) și cantități dintr-o probă biologică sau clinică. Cu toate acestea, metoda HIFA are un dezavantaj extrem de semnificativ - pe baza ei, este posibil să se creeze sisteme de testare de diagnosticare numai pentru antigene cu greutate moleculară mică. Numai în acest caz, anticorpul, interacționând cu antigenul, poate proteja sau modifica eficient molecula de enzimă asociată cu acest antigen. În această privință (în ciuda simplității aparente și a avantajelor evidente față de alte metode, instrumentele de diagnosticare au fost create pe baza HIFA pentru a identifica doar hormoni, peptide, medicamente și substanțe narcoticeși unele proteine cu greutate moleculară mică.

5.5 „Sandwich” - o variantă ELISA pentru detectarea antigenelor.

Antigenele detectate utilizând această variantă ELISA trebuie să aibă epitopi multipli capabili să lege anticorpi sau să aibă epitopi repetați, separați spațial, de aceeași specificitate.

Când se efectuează această versiune de ELISA, anticorpii poli- sau monoclonali foarte specifici adsorbiți pe faza solidă sunt incubați cu proba de testat. După procedura de spălare, anticorpii marcați cu enzimă (conjugați) la același antigen sunt adăugați în godeuri și apoi sunt efectuate toate celelalte etape ale reacției. Eficiența formării unui complex specific în fiecare etapă a analizei depinde de constanta de legare a reacției antigen-anticorp.

Sul tehnici disponibile diagnosticul s-a extins rapid în ultimele decenii, diagnosticienii încearcă să combine avantajele tuturor analizelor anterioare în metode noi, scăpând de toate dezavantajele lor anterioare.

Recent, din ce în ce mai des pe listă proceduri de diagnosticare include imunotestul enzimatic - un test modern și destul de nou despre care se cunosc puține unei persoane obișnuite, fără legătură cu medicină. Cu toate acestea, această tehnică câștigă rapid rangul aderenților săi în rândul personalului medical calificat. Puteți încerca să vă dați seama ce este și în ce cazuri ar trebui utilizat, familiarizându-vă cu caracteristicile și caracteristicile sale principale.

Imunotestul enzimatic este o tehnică instrumentală de laborator bazată pe reacția moleculară „antigen-anticorp”, care permite detectarea proteinelor specifice în materiale biologice (probe pentru cercetare). Astfel de proteine pot fi enzime, diverse microorganisme (viruși, bacterii, ciuperci), protozoare etc.

După descoperirea metodei, i s-a dat denumirea de test ELISA, care nu are nicio legătură cu numele descoperitorilor, ci este o abreviere. Numele complet V versiune în limba engleză- Test legat de imuno absorbția enzimelor. Medicii din întreaga lume folosesc acest nume; unii medici din țările vorbitoare de limbă rusă numesc și acest tip de cercetare în acest fel.

Principiul principal al metodei este reacția moleculară „antigen-anticorp”.

Un antigen este orice moleculă străină care intră în corpul uman ca parte a microbilor care provoacă boala. Antigenele sunt de obicei molecule proteice. În plus față de microorganisme, un astfel de „străin” pot fi celule sanguine străine care nu se potrivesc cu grupul sau cu factorul Rh.

Ca răspuns la intrarea unui astfel de antigen în organism, este lansată o reacție imună, care are ca scop protejarea împotriva oricăror molecule străine. Acest lucru se întâmplă din cauza sintezei agenților speciali ai sistemului imunitar - anticorpi (imunoglobuline). Fiecare anticorp este potrivit doar pentru un antigen specific și neutralizează „străinul” patogen prin legarea de acesta într-un singur complex. Procesul de astfel de legare este numit reacția „antigen-anticorp”.

Tipuri de anticorpi

Toți anticorpii (imunoglobulinele) sunt împărțiți în 5 tipuri, în funcție de stadiul răspunsului imun în care apar:

Pentru diagnosticul ELISA, cele mai importante niveluri sunt imunoglobuline IgG, IgM și IgA. După titrurile lor, puteți afla dacă o persoană a mai avut boala sau s-a infectat recent, dacă a dezvoltat imunitate sau dacă organismul său este lipsit de apărare împotriva patologiei.

Avantajele și dezavantajele imunotestului enzimatic

În prezent, ELISA este una dintre cele mai precise și sensibile metode. A fost adoptat de specialiști în zone diferite medicină și continuă să-și extindă domeniile de aplicare.

Avantajele metodei

Precizie ridicată a datelor obținute.
Sensibilitate (vă permite să detectați substanța necesară chiar și cu prezența minimă a agentului patogen în probă).
Posibilitate de diagnostic în primele zile de boală sau în perioada de incubație.
Viteza de achiziție a datelor în comparație cu alte metode de precizie similară.
Automatizare ridicată a procesului și participare umană minimă, ceea ce reduce eroarea executantului.
Obținerea de date privind stadiul procesului patologic și eficacitatea terapiei alese.
Nedureros și minim invaziv la colectarea materialului.

Dezavantajele metodei

În cele mai multe cazuri, vă permite să determinați răspunsul organismului la un agent patogen și nu agentul patogen în sine.
Înainte de testare, boala suspectată trebuie cunoscută cu exactitate, deoarece testul este foarte specific.
Probabilitatea unor citiri false cauzate de probleme tehnice, luarea de medicamente sau prezența simultană a mai multor boli cronice sau încălcări procesele metaboliceîn corpul pacientului.
Interpretarea rezultatelor trebuie făcută numai de un specialist înalt calificat, deoarece pentru interpretarea datelor obținute este necesar să aveți cunoștințe. antrenament specialși un stoc mare de cunoștințe medicale într-un anumit domeniu.
ELISA este un test destul de rar, deci nu se efectuează în toate laboratoarele de diagnostic.
Metoda este destul de costisitoare, deoarece pe lângă reactivi, laboratorul trebuie să aibă numeroase echipamente scumpe și mostre de antigene produse în institute speciale.

În ce cazuri se utilizează imunotestul enzimatic?

Lista completă a indicațiilor pentru imunotestul enzimatic este foarte largă; include aproape toate ramurile medicinei.

Cel mai adesea, ELISA este utilizată în următoarele scopuri:

Identificare boli infecțioase;
diagnosticul bolilor cu transmitere sexuală;
definiție starea imunitară sau anumite boli autoimune;
identificarea markerilor tumorali;
determinarea hormonilor.

În caz de infecţii şi boli virale Tehnica ne permite să identificăm următoarele patologii:

În plus, ELISA vă permite să determinați rapid și eficient starea de infarct, să evaluați potențialul de reproducere al organismului, să identificați alergiile, sursa acestora etc.

Tehnica imunologică enzimatică este utilizată pentru a efectua studii cliniceîn timpul dezvoltării de noi medicamenteși în evaluarea impactului acestora asupra organismului uman.

Tipuri de mostre și metode de selecție a acestora pentru cercetare

Cel mai frecvent studiat material pentru imunotestul enzimatic Sângele folosit este prelevat din vena cubitală a pacientului. Recoltarea probelor se efectuează pe stomacul gol, în principal dimineața. După prelevare, acele celule formate care interferează cu cercetarea sunt separate și îndepărtate din sânge, lăsând doar ser.

La diagnosticare infecții genito-urinale Adesea, materialul este frotiu din țesuturile mucoase ale organelor genitale, mucus din uretra sau colul uterin, mostre din rect, răzuire de la eroziuni sau ulcere în zona inghinală și din alte părți ale corpului. De asemenea, se pot lua tampoane cavitatea bucală, precum și din nazofaringe.

Uneori imunotestul enzimatic este utilizat în obstetrică și practica ginecologicaîn timpul sarcinii pentru a determina starea lichidului amniotic. În acest caz, modelul devine lichid amniotic. În acest scop, ele nu sunt selectate un numar mare de lichid prin perforarea sacului amniotic cu un ac lung. Toate manipulările sunt efectuate cu instrumente sterile pentru a minimiza posibilele riscuri.

Adesea materialul devine spinal sau lichid seros. Acest lucru se întâmplă când Anestezie locala, care se administrează prin injecție.

Specialistul care trimite pentru studiu ar trebui să clarifice ce tip de materiale sunt necesare pentru imunotestul enzimatic. Adesea se prelevează simultan probe de mai multe tipuri sau din locuri diferite. Medicul care emite o trimitere pentru acest tip de examinare ar trebui, de asemenea, să informeze pacientul despre pregătirile pentru donarea de biomaterial.

Pregătire pentru imunotestul enzimatic

Pentru a crește acuratețea datelor obținute după imunotestul enzimatic, pregătirea pentru selectarea materialului ar trebui să fie după cum urmează:

Cu 10 zile înainte de studiu, excludeți antibioticele, medicamentele antivirale și antimicotice;
pentru o zi este necesar să excludeți alcoolul, fumatul și luarea de substanțe narcotice;
în aceeași perioadă, este necesar să se evite suprasolicitarea fizică;
Avertizați medicul cu privire la toate medicamentele pe care le ia pacientul;
Anunțați medicul dumneavoastră dacă sunteți gravidă sau bănuiți că sunteți gravidă.

Cel mai bine este ca materialele de testare să fie colectate dimineața pe stomacul gol.

Dacă diagnosticul urmărește determinarea stării niveluri hormonale, atunci este important să se asigure stare calmă cu o zi înainte și evitați tensiunea nervoasă. Pentru femei, donarea de sânge pentru hormoni este clar determinată de perioadă ciclu lunar, care va fi discutat de medic la momentul programarii.

Cu 2-3 zile înainte de prelevare, trebuie să excludeți din meniu alimentele prăjite și grase și, înainte de testarea hepatitei, nu mâncați citrice sau alte fructe și legume portocalii sau galbene.

Interpretarea rezultatelor imunotestelor enzimatice

Rezultatul unui studiu calitativ este de obicei indicat de semnele „+” (detectat) sau „-” (negăsit).

Pe baza prezenței sau absenței anumitor grupuri de imunoglobuline, se pot trage următoarele concluzii:

JgM (-), JgG (-), JgA (-) - imunitatea la boală este complet absentă (corpul nu a întâlnit anterior acest tip de antigen);
JgM (-), JgG (+), JgA (-) - a existat o coliziune anterioară cu acest antigen sau cu vaccinul;
JgM (+), JgG (-/+), JgA (-/+) - proces patologic acut (cel mai probabil primar);
JgM (-), JgG (+/-), JgA (+/-) - proces cronic;
JgM (+), JgG (+), JgA (+) - recidivă;
JgM (-) - stadiu de recuperare.

Valorile cantitative poartă o încărcătură mare de informații, dar numai medicul curant le poate interpreta, pe baza indicațiilor anterioare, a vârstei pacientului și a normelor pentru fiecare boală specifică. Din acest motiv nu puteți evalua singur rezultatele.

Cât timp trebuie să așteptați pentru rezultate?

Această tehnică are multe varietăți, în funcție de care se determină perioada de obținere a datelor în mână. Durata medie Diagnosticarea ELISA durează 4-6 ore, ceea ce vă permite să oferiți rezultate chiar a doua zi.

Cele mai lungi metode durează până la 10 zile, de exemplu, în cazul infecției cu HIV.

In caz de nevoie urgenta se pot folosi metode expres, in care raspunsul se obtine in 1-2 ore.

Unde pot obține teste ELISA?

Deoarece echipamentele pentru acest tip de diagnosticare sunt destul de costisitoare, nu toate laboratoarele le pot achiziționa. În plus, testele care conțin antigeni specifici au o perioadă de valabilitate limitată (de obicei aproximativ 1 an) și, prin urmare, trebuie actualizate în mod constant.

Din aceste motive, guvernul institutii medicale Laboratoarele ELISA nu sunt întotdeauna disponibile. Cel mai adesea este necesar să contactați mari centre medicale private sau mari centre de diagnostic.

Pentru a efectua un test ELISA, laboratorul trebuie să aibă o licență specială, iar personalul și asistenții de laborator trebuie să urmeze o pregătire specială.

Cel mai adesea specific centru de diagnostic sau laboratorul este recomandat de medicul care trimite pacientul spre examinare.

Costul imunotestului enzimatic

Prețul pentru acest studiu depinde de regiunea țării și de nivelul clinicii care oferă serviciul. La Moscova, prețul minim pentru determinarea unui antigen începe de la 700 de ruble. Dacă este necesară identificarea mai multor imunoglobuline deodată, se va aduna prețul.

În cazul unei analize urgente, costul crește cu 150-200 de ruble. pentru fiecare antigen.

În ciuda costului destul de ridicat, imunotestul enzimatic face posibilă examinarea pacientului cât mai informativă și rapidă posibil, ceea ce reduce timpul înainte de începerea tratamentului și permite o stabilizare mai rapidă a stării persoanei.

Acest videoclip prezintă filmul „Bazele imunotestului enzimatic”.

Cum se efectuează un studiu ELISA?

Mecanismul de reacție

Testul imunosorbent legat de enzime se bazează pe reacția imună a unui antigen cu un anticorp, iar atașarea unei etichete enzimatice la anticorpi permite ca rezultatul reacției antigen-anticorp să fie luat în considerare prin apariția activității enzimatice sau prin o modificare a nivelului său.Într-o formă simplificată, mecanismul de reacție poate fi prezentat astfel:

	Prima reacție are loc între Ig (Ab) detectat și antigenul patogen purificat (Ag), fixat pe suprafața godeurilor tabletei imunologice.
	Pentru a identifica complexele imune formate, se efectuează o a doua reacție imunologică, în care Ig-ul specific legat acționează ca un antigen și un conjugat reprezentând o Ig (Ab) la Ig umană corespunzătoare, marcată cu enzima -peroxidază (K) , este folosit ca anticorpi la acesta.
	În continuare, are loc o reacție enzimatică, catalizată de partea enzimatică a moleculei conjugate.Sustratul acestei reacții este o substanță incoloră - un cromogen, care în timpul reacției formează o substanță colorată. Intensitatea culorii în godeu depinde într-un anumit fel de cantitatea de imunoglobuline conținută în probă.

Calculul rezultatelor

Efectuarea imunotestului enzimatic

Pentru serodiagnostic se folosesc plăci de polistiren cu 96 de godeuri, pe pereții celulelor a căror antigen este pre-adsorbit. Serul de testat este adăugat în celula tabletei. În acest caz, anticorpii omologi cu antigenul sunt atașați de acesta. Anticorpii neatașați sunt îndepărtați prin spălare. Apoi, anticorpii împotriva imunoglobulinelor umane (anticorpi) marcați cu o enzimă sunt adăugați la celule. Dacă anticorpii detectabili au fost prezenți în serul de testare, atunci în această etapă ei vor acționa ca antigeni cu care anticorpii marcați vor reacționa. Adăugarea unei substanțe cromogene (colorant) după spălare ne va permite să luăm în considerare reacția culorii în curs de dezvoltare în celule. Intensitatea culorii este proporțională cu cantitatea de enzimă și, prin urmare, cu cantitatea de anticorpi.La măsurarea densității optice (DO) a unui lichid dintr-o celulă și compararea acestuia cu o probă de control, concentrația de anticorpi se calculează în unități. de volum.Cel mai des folosit este calculul rezultatelor în unități de densitate optică.Trebuie să țină cont de faptul că Fiecare sistem de testare are proprii indicatori pentru înregistrarea rezultatelor și indicatorii de normalitate și patologie după care ar trebui să se ghideze atunci când se interpretează rezultate.

Ce infecții pot fi detectate prin ELISA?

În principal în venerologia modernă este utilizat pentru diagnosticul de sifilis (în combinație cu alte reacții), infecție cu HIV, hepatită virală.Are valoare limitată pentru diagnosticul infecției cu chlamydia, infecție cu citomegalovirus și alte infecții herpetice.Se folosește și metoda ELISA. pentru a determina anticorpi în diferite boli infecțioase, niveluri de hormoni, autoanticorpi și diferiți markeri ai cancerului.

Cum se interpretează rezultatele ELISA

Studierea prezenței și a nivelului de anticorpi din diferite clase în unele cazuri ajută la determinarea etapelor proces infecțios

Stadiul bolii	IgM	IgA	IgG
Faza primara (2 săptămâni de la infecție)
Faza primara (2,5 - 3 săptămâni de la infecție)
Faza primara (3-4 săptămâni de la infecție)
Exacerbarea fazei cronice (2 săptămâni de la debutul exacerbării)
Faza cronică
Trecut (infecție vindecată)
Recuperare		scăderea titrului de 2-4 ori după tratament de succes	titrul scade de 4-8 ori la 1-1,5 luni dupa tratamentul cu succes
Rezultat negativ

Din păcate, un avantaj atât de important al ELISA ca cuantificarea anticorpii nu sunt de mare importanță în munca practica- adica nu permite un diagnostic precis și nu afectează doza și timpul de administrare a medicamentelor.

Care este rolul metodei ELISA în diagnosticul sifilisului

Metoda ELISA în diagnosticarea sifilisului a fost utilizată pentru prima dată în 1975. În prezent, este utilizată pe scară largă pentru diagnosticul serologic al sifilisului în Rusia și este folosită ca test de confirmare pentru sifilis. De obicei, se efectuează un studiu pentru a identifica așa-numitul anticorpi totali la antigenele de treponema pallidum (IgM și IgG), deși în unele cazuri este posibil să se determine doar anticorpi „precoce” din clasa M. ELISA pentru sifilis devine pozitiv după 3 săptămâni de la momentul infecției și rămâne pozitiv pentru o perioadă destul de lungă. perioadă lungă de timp chiar și după tratament (uneori pe tot parcursul vieții). Prin urmare, ELISA nu este utilizat ca test pentru a confirma vindecarea sifilisului. În cele mai multe cazuri, se efectuează doar o determinare calitativă a ELISA - adică. doar un rezultat pozitiv sau negativ, deși determinarea cantitativă este posibilă.

Pentru o evaluare cuprinzătoare a stării corpului (în special a acestuia funcții de protecție) este prescris un test imunosorbent legat de enzime (ELISA). Testul de sânge ELISA se efectuează pentru diagnosticarea patologiilor infecțioase, autoimune, hematologice, primare și imunodeficiențe secundare. În acest articol, ne propunem să luăm în considerare mai detaliat ce este un test de sânge ELISA, precum și ce indicații există pentru implementarea acestuia.

Indicații pentru prescrierea unui test de sânge folosind metoda ELISA și principiul funcționării acestuia

După cum am observat deja, un test de sânge folosind metoda ELISA este un test de laborator prin care se determină antigene sau anticorpi într-o probă de sânge. Această analiză utilizat pentru detectarea nivelului de hormoni, complexe imunologice și imunoglobuline. Exista următoarele lecturi pentru analiza ELISA:

Diagnosticul alergiilor.
Diagnosticul bolilor de origine virală - Virusul Epstein-Barr, herpes, hepatită, citomegalovirus.
Diagnosticul infecțiilor cu transmitere sexuală - micoplasmă, ureaplasmă, sifilis, trichomonas, chlamydia.
Definiţia immunodeficiency.
Diagnosticul patologiilor oncologice.
Evaluarea eficacității terapiei.
Determinarea nivelului hormonal.
Examen preoperator complet.

Principiul de funcționare al unui imunotest enzimatic se bazează pe un test de sânge pentru prezența imunoglobulinelor (proteine specifice anticorpilor). Imunoglobulinele sunt produse de sistemul imunitar atunci când antigenele (microorganisme străine) pătrund în corpul uman. Aceste molecule imune se leagă de diverși agenți patogeni infecțioși și îi neutralizează. Important trăsătură distinctivă pe care le au imunoglobulinele este specificitatea lor. Datorită acestor caracteristici, ei pot forma un complex antigen-anticorp prin legarea la un antigen specific. Atunci când se efectuează un test de sânge ELISA, acest complex este determinat cantitativ și calitativ.

Pentru acest studiu Sângele uman este adesea folosit. Cu toate acestea, puteți lua conținutul ca material pentru analiză vitros, lichid amniotic, fluid cerebrospinal. Proba de sânge este de obicei prelevată din vena antecubitală a pacientului. Se recomandă donarea sângelui pe stomacul gol (trebuie să treacă cel puțin 12 ore de la momentul respectiv ultima intalnire alimente). Dacă pacientul ia medicamente Ar trebui să spuneți medicului dumneavoastră, deoarece unele dintre ele pot afecta rezultatul testului. Fiabilitatea rezultatelor testelor este, de asemenea, afectată de consumul de droguri și alcool.

Interpretarea testului de sânge pentru ELISA

Forma pentru această analiză indică de obicei un rezultat negativ (-) sau pozitiv (+) pentru calcularea fiecărei clase de imunoglobuline.

Ne propunem să luăm în considerare interpretarea interpretării probabile a testului de sânge ELISA.

IgG, IgA nu sunt detectate și rezultat IgM negativ – recuperare completă.
Rezultatul IgM, IgA, IgG este negativ – nu există imunitate la infecție.
Rezultatul IgG, IgA este pozitiv și negativ, precum și rezultatul IgM este pozitiv - prezența unei infecții acute.
Pozitiv rezultat IgGși un rezultat negativ al IgA și IgM – imunitatea post-vaccinare sau post-infecțioasă.
Rezultat pozitiv sau negativ al IgG, IgA și rezultat negativ al IgM – infecție cronică.
Rezultatul IgG, IgM, IgA este pozitiv - exacerbarea patologiei infecțioase cronice.

Într-un imunotest enzimatic al sângelui, pe lângă specificarea claselor de anticorpi, indicatorii lor cantitativi sunt indicați în transcriere. Cu toate acestea, doar medicul curant oferă o explicație extinsă a acestora.

Punctele forte și punctele slabe ale acestui studiu

Cost relativ mic.
Ușurință în utilizare.
Posibilitate de diagnosticare pe stadiu timpuriu boala suspectata.
Precizie relativ mare a datelor obținute.
Perioada scurtă de timp necesară obținerii rezultatului cercetării.
Capacitatea de a monitoriza dinamica dezvoltării procesului infecțios în organism.
Nivel ridicat de unificare, ceea ce face posibilă efectuarea de anchete în masă.
Automatizarea tuturor etapelor cercetării.

Dezavantajul testului de sânge ELISA este că poate fi destul de bun în cazuri rare da rezultate fals pozitive sau fals negative. De asemenea, la efectuarea cercetărilor, pe lângă erorile tehnice, cauza rezultate false pacientul poate beneficia factor reumatoid, prezența unor boli cronice (în care se produc anticorpi), luând anumite medicamente consumabile medicale, tulburări metabolice.

Giardioza.
ascariaza.
Cisticercoza.
Amebiaza.
Trichineloza - studiul se efectuează de mai multe ori; nivelul maxim de anticorpi este determinat la 4-12 săptămâni după infectare.
taeniasis.
Opistorhiază – efectuată diagnostic diferentiatîntre acută şi forma cronica boli.
Toxoplasmoza.
Fascioliaza – in stadiul acut boala este determinată de prezența anticorpilor.
Leishmanioza cutanată sau viscerală.

Deci, putem rezuma: un test ELISA pentru paraziți este necesar pentru a identifica antigenele (produșii de deșeuri ale paraziților și însăși prezența lor), precum și anticorpii (imunoglobuline). Specificul acestei metode de cercetare în identificarea paraziților, conform datelor statistice, este de aproximativ 90%. Datorită acestei analize, medicul poate determina cu exactitate tipul de paraziți, numărul lor total și, de asemenea, poate urmări dinamica dezvoltării. procese patologice datorită nivelului de anticorpi.