Иммунный блоттинг в диагностике вич. Иммунный блоттинг Иммунный блот механизм практическое использование

Иммуноблоттинг – (от англ. «blot» – пятно) – метод идентификации антигенов (или антител) с помощью известных сывороток (или антигенов). Представляет собой сочетание гель-электрофореза с ИФА. Первоначально бактериальные клетки или вирионы разрушают при помощи ультразвука, а затем методом электрофореза разделяют все антигены вируса или бактериальных клеток и получают коммерческий реагент на специальной нитроцеллюлозной плёнке. При постановке иммуноблоттинга на плёнку с известными антигенами наносится исследуемая сыворотка пациента. После инкубации и отмывания несвязавшихся антител, приступают к ИФА – на плёнку наносят антисыворотку к иммуноглобулинам человека, меченную ферментом, и хромогенный субстрат, изменяющий окраску при взаимодействии с ферментом. При наличии комплексов антиген-антитело-антисыворотка к иммуноглобулину-фермент на носителе появляются окрашенные пятна. Метод иммуноблоттинга позволяет отдельно обнаружить антитела на различные антигены возбудителя (например, при ВИЧ-инфекции иммуноблоттинг выявляет антитела на gp120, gp24 и другие антигены вируса).

Радиоиммунный анализ (РИА)

В основе метода лежит реакция антиген-антитело с применением метки антигена или антитела радионуклидом. В качестве метки используются 125I, 14C, 3H, 51Cr и другие радионуклиды. Образующиеся иммунные комплексы выделяют из системы и определяют их радиоактивность на счётчиках (β-излучение). Интенсивность излучения прямо пропорциональна количеству связавшихся молекул антигена и антител.

Широко распространён твёрдофазный вариант РИА с использованием меченых антител или антигенов, сорбированных в лунках полистироловых панелей.

РИА применяют для выявления антигенов микробов, вирусов, различных гормонов, ферментов, лекарственных веществ, иммуноглобулинов, а также других веществ, содержащихся в исследуемом материале в минорных концентрациях 10-12–10-15 г/л.

Контрольные вопросы

Реакция иммунного бактериолиза: что это за реакция; что является антигеном, что – антителами, механизм реакции, методы постановки, практическое применение. Реакция иммунного гемолиза: необходимые ингредиенты, методика постановки; контроли, практическое применение. Реакция локального гемолиза в геле (реакция Йерне): принцип реакции, методика постановки, практическое применение. Реакция связывания комплемента: принцип реакции; что образуется при взаимодействии иммунной сыворотки со специфическим антигеном; что происходит с комплементом, если он присутствует при этом взаимодействии? Какова судьба комплемента в том случае, если между антигеном и антителами нет специфического сродства? С помощью какой реакции можно определить, что произошло с комплементом; почему используется именно эта реакция; каков видимый положительный результат РСК? Почему? Какое свойство комплемента используется в первой фазе РСК? Во второй фазе? Если конечным результатом РСК является гемолиз, что это означает – положительный или отрицательный результат? Объясните результаты: РСК+ + + +, РСК+ + +, РСК+ +, РСК+. Назовите ингредиенты первой системы РСК и ингредиенты второй системы РСК. Почему исследуемую сыворотку необходимо инактивировать? Как титруют комплемент? Гемолитическая сыворотка: что она содержит, как её получают, что такое титр и как его определяют? Какие животные используются для получения компонентов РСК? Методика постановки РСК на холоде. При постановке каких из перечисленных реакций необходимо участие комплемента: преципитации, флоккуляции, агглютинации, выявления неполных антител, иммунного бактериолиза, иммунного гемолиза, Йерне, РСК? Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) – укажите последовательность событий при прямой реакции Кунса; необходимые ингредиенты. Что является антигеном, что – антителами, чем помечены антитела, как учитывается результат реакции, как выглядит положительный результат? Практическое применение – что можно определить с помощью этой реакции? Непрямая реакция иммунофлюоресценции – укажите последовательность событий при этой реакции, необходимые ингредиенты, что является антигеном, какие иммунные сыворотки применяются; практическое применение; преимущество непрямой РИФ по сравнению с прямой реакцией. Иммуноферментный анализ (ИФА) – принцип реакции; необходимые ингредиенты; укажите последовательность событий при постановке реакции с целью обнаружения антигена в исследуемом материале; необходимые ингредиенты; что происходит при положительном результате, как он выглядит? Укажите последовательность действий при постановке ИФА с целью обнаружения антител в исследуемой сыворотке; необходимые ингредиенты; что происходит при положительном результате? Иммуноблоттинг – принцип реакции; основные этапы; необходимые ингредиенты; как учитывается результат; преимущества реакции. Радиоиммунный анализ (РИА) – из каких основных этапов складывается реакция; чем помечены антитела или антигены, как учитывается результат? Иммуноэлектронная микроскопия – принцип метода; основные этапы; необходимые ингредиенты; чем помечены антитела; как учитывается результат реакции. Реакции иммобилизации – принцип метода, техника постановки, компоненты, учёт результатов.

Задания для выполнения в процессе самоподготовки.

Заполните таблицу «Реакции иммунитета» в отношении реакций, разбираемых в рамках данной темы.

Реакции иммунитета

Работа студента на практическом занятии

Работу начать сразу с постановки 1 фазы РСК, но в тетрадь записать позже (см. ниже).

1. Реакция иммунного гемолиза. Посмотреть демонстрационную реакцию иммунного гемолиза, зарисовать в виде схемы, объяснить результат в опытной и в контрольных пробирках.

2. Реакция связывания комплемента

а) разобрать РСК по таблице;

б) начертить в тетрадь схему постановки РСК в виде таблицы;

в) поставить вторую фазу РСК (первая фаза ставится в начале занятия);

г) разобрать диагностические препараты, необходимые для РСК;

д) учесть результат. Сформулировать вывод о наличии специфических антител в исследуемой сыворотке.

3. Реакция иммунофлюоресценции. Изучите таблицу, составьте в тетради схему постановки реакции; посмотрите диагностические сыворотки; определите – что содержит сыворотка, как приготовлена, для какой реакции (прямой или непрямой РИФ) она применяется. Посмотрите демонстрационный результат РИФ в люминесцентном микроскопе.

4. Иммуноферментный анализ (ИФА). Составьте в тетради схему постановки реакции в двух вариантах: для обнаружения антигена в исследуемом материале и для обнаружения антител в сыворотке. Ознакомьтесь с набором ингредиентов для диагностики ВИЧ-инфекции и гепатита В. Определите, что содержит каждый ингредиент и для чего он применяется.

5. Иммуноблоттинг. Составьте в тетради схему постановки реакции; посмотрите демонстрацию – результат реакции.

6. Радиоиммунный анализ (РИА). Составьте в тетради схему реакции.

7. Иммунная электронная микроскопия (ИЭМ). Посмотрите демонстрацию – результат реакции, составьте в тетради схему реакции, укажите стрелками антиген (вирус) и меченые антитела.

Иммуноблоттинг - высокочувствительный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг используют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.

В общем смысле под иммуноблоттингом понимают анализ смеси белков, перенесенных на твердую подложку-мембрану, с которой они связываются ковалентными связями, с последующей иммунодетекцией.

Анализировать можно смесь белков, непосредственно нанесенную на подложку, — дот-блот анализ — либо после ее предварительного фракционирования методами электрофокусирования, диск-электрофореза или двумерного электрофореза — Вестерн-блот анализ (Western blotting).

Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофореза в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагу или нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА.

Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител больного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов человека, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс (антиген + антитело больного + антитело против Ig человека) выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.

Такая методология применяется также для отбора клонов бактерий, фагов или вирусов, экспрессирующих продукты целевых клонированных генов.

Перенос белков на мембрану осуществляется либо пассивно, либо с использованием аппаратуры для электропереноса. На эффективность переноса белков на мембрану влияет множество факторов, таких как молекулярная масса белков, пористость геля, время переноса и состав используемого буферного раствора (транс-буфера).

В зависимости от задач и условий проведения эксперимента подбираются условия переноса, обеспечивающие наилучшие результаты. В качестве подложек обычно используют нитроцеллюлозные, поливинилидендифлуоридные (ПВДФ) или положительно заряженные нейлоновые мембраны. Нитроцеллюлоза может связывать до 80 — 100 мкг белка на 1 см2.

Низкомолекулярные белки (с молекулярной массой менее 20 кДа) могут быть утеряны в результате промывок ет возможность предварительно исследовать полиморфизм определенных генетических локусов по длинам соответствующих рестрикционных фрагментов ДНК.

Кроме того, с помощью гибридизации по Саузерну можно легко выяснить, имеет ли целевой ген участок гидролиза определенной рестриктазой в своей внутренней части, что позволяет выбирать оптимальную стратегию клонирования изучаемого района генома.

По аналогичной схеме из агарозного геля на нитроцеллюлозный фильтр можно перенести и молекулы РНК. Этот метод был назван Северным блоттингом (Northern blotting) в противоположность блоттингу по Саузерну (Southern blotting), так как фамилия Саузерн в английском языке означает «южный».

Перенос на фильтры из геля белков соответственно назвали Западным блоттингом (Western blotting). Крупные белки (более 100 кДа), денатурированные в растворе додецилсульфата натрия (SDS), могут слабо переноситься на мембрану, если в транс-буфере присутствует этанол. Спирт значительно улучшает перенос белков с SDS-полиакриламидного геля, но сужает поры в геле, что и приводит к задержке крупных белков.

Мембрана ПВДФ оптимизирована для проведения иммунодетекции и способна удерживать специфически связавшиеся белки до 160 мкг/см2 при очень низком уровне неспецифического связывания.

Иммуноблоттинг

Немаловажное свойство этой мембраны — возможность ее многократного использования. Нейлоновые мембраны Zeta-Probe эффективно связывают SDS-белки в отсутствие спирта, причем это связывание устойчиво к последующим обработкам. Низкомолекулярные белки также удерживаются эффективно. Благодаря высокой связывающей емкости — около 480 мкг белка на 1 см2 — мембраны Zeta-Probe позволяют обнаруживать следовые количества белка в анализируемых смесях.

После того как антиген оказывается иммобилизованным на мембране, оставшиеся центры связывания блокируют растворами желатина, либо бычьего сывороточного альбумина, либо обезжиренного молока.

Затем мембрану инкубируют в растворе поликлональных или моноклональных антител к исследуемому анти гену. После отмывки несвязавшихся антител мембрану инкубируют в растворе вторичных антител, которые представляют собой конъюгат ферментов щелочной фосфатазы (alkaline phosphatase, АР) или пероксидазы хрена (horseradish peroxidase, HRP) с антивидовыми антителами (козьи антитела к иммуноглобулинам кролика, мыши или человека) либо белками А (белок Staphylococcus aureus) или G (белок Streptococcus sp.), имеющими высокую аффинность к Fc-области иммуноглобулинов.

Детекцию образованных иммунных комплексов проводят химическим или хемилюминесцентным способом. Субстратами для химической реакции при использовании конъюгатов щелочной фосфатазы служат 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат (BCIP) или тетразолий голубой (NBT), а при использовании конъюгатов пероксидазы хрена — 4-хлор-1-нафтол и перекись водорода.

В результате ферментативных реакций на мембране образуется окрашенная полоса или пятно в месте локализации комплекса антиген-антитело.

Чувствительность данного метода составляет 100 пг белка при использовании конъюгатов АР и 100-500 пг при использовании конъюгатов HRP. Хемилюминесцентная детекция иммунных комплексов позволяет определять менее 5 пг антигена. Принцип этого метода заключается в том, что при реакции HRP с перекисью водорода и циклическим диацилгидразинлюминолом происходит эмиссия света длиной волны 428 нм, которая может быть зафиксирована на светочувствительной пленке.

Реакция иммуноблотинга (РИ) разработана на основе ИФА. Является самым специфичным и чувствительным методом иммунохимического анализа. Иммуноблотинг (от англ. blot – промокать, пятно) сочетает ИФА с электрофорезом. Применяется для выявления не комплексных антител к ВИЧ, а антитела к отдельным его структурным белкам (белки-р24, гликопротеины-gр120, gр 41 и др.). Относятся к экспертным (подтверждающим) реакциям диагностики ВИЧ-инфекции.

Реакция проводится в несколько этапов:

Вирус разрушают на компоненты — антигены (р24, gр120, gр 41 и др.), которые подвергаются электрофорезу в полиакриламидном геле, то есть разделению антигенов на фракции по молекулярной массе.

2. Гель покрывают нитроцеллюлозной мембраной и на неё при помощи электрофореза переносятся фракции антигенов. Нитроцеллюлоза ведёт себя подобно промокательной бумаге. Мембрану разрезают на полоски (стрипы). Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антигенов.

Иммуноблоттинг - дополнительный непрямой метод

Стрипы с нанесёнными на него антигенами ВИЧ погружают в сыворотку обследуемого и затем отмывают от несвязавшегося материала.

4. Стрипы инкубируют антиглобулиновой сывороткой, меченой пероксидазой, отмывают.

Добавляют субстрат и отмечают число окрашенных фракций (пятен), которые соответствуют в зоне локализации комплекса АГ-АТ.

Наличие полос на определённых участках стрипа подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ. Результат иммуноблоттинга считается положительным, если на мембране видны полосы, соответствующие любым двум из трех антигенов ВИЧ - р24, gp41 и gp 120 (рис.37).

РИСУНКИ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Основная литература

Медицинская микробиология, вирусология и иммунология: учебник для студентов мед. вузов 2-е изд., испр. и доп. — 702 с. Под ред. А.А. Воробьева. М. : МИА, 2012.

2. Микробиология, вирусология и иммунология: руководство к лабораторным занятиям: учеб.пособие/(В.Б.Сбойчаков и др.); под ред. В.Б.Сбойчакова, М.М.Карапаца. – М.:ГЭОТАР-Медиа, 2014.- 320с.:ил.

3. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология [Электронный ресурс]: учебник для мед.

вузов — 760 с. — Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Коротяев А.И., Бабичев С.А. СПб.: Спецлит, 2010.

4. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология [Электронный ресурс] : учебник: в 2 т. / Т. 1. — 448 с. — Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Зверев В.В., Бойченко М.Н.

М. : Гэотар Медиа, 2010. .

5. Медицинская микробиология, вирусология и иммунология [Электронный ресурс]: учебник: в 2 т. Т. 2. — 480 с. Режим доступа: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Зверев В.В., Бойченко М.Н. М. : Гэотар Медиа, 2010.

Дополнительная литература

1. Иммунодиагностические реакции: учебное пособие / сост.: Г.К.Давлетшина, З.Г.Габидуллин, А.А.Ахтариева, М.М.Туйгунов, А.К.Булгаков, Т.А.Савченко, Р.Ф.

Хуснаризанова, Ю.З.Габидуллин, М.М.Алсынбаев – Уфа: Изд-во ГБОУ ВПО БГМУ Минздрава России, 2016. — 86с.

2. Особенности некоторых свойств, определяющих патогенный потенциал сокультивируемых вариаций бактерий Еnterobacter, Сitrobacter, Serratia, E.coli, Proteus: научное издание / Ю. З. Габидуллин, Р. С. Суфияров, И. И. Долгушин – Уфа, 2015. – 250 с.

Главная » Иммуноблот – что это? Иммуноблот в диагностике инфекционных заболеваний

Иммуноблот – что это? Иммуноблот в диагностике инфекционных заболеваний

Что такое иммуноблот? Это распространенный метод лабораторной диагностики вирусных инфекций человека. Он является одним из наиболее точных и надежных способов обнаружить наличие ВИЧ.

Для надежности он даже больше, чем энзим-соединенный assay иммуносорбента (elisa). Результаты иммуноблот считается неопровержимой и окончательной.Общая информация

Иммуноблот – что это? Для того, чтобы признать человека ВИЧ, вы должны пройти лабораторный метод исследования сыворотки крови на наличие антител.

Методом Вестерн-блот разделы также называется Вестерн-блот (вестерн блот). Он используется для обнаружения вирусных инфекций человека, в качестве дополнительного экспертного метода. Это необходимо для подтверждения ИФА – лабораторное исследование, позволяющее определить в крови наличие антител к ВИЧ. Иммуноблот перепроверить положительный ИФА.

Он считается наиболее чувствительным, сложным и дорогим.

Цель

Что такое иммуноблот? Эта методика лабораторных исследований сыворотки крови на наличие антител к вирусу.

В ходе специальных исследований общий вирусных белков в геле и на нитроцеллюлозные мембраны.

Иммуноблоттинг (выявление антител в сыворотках больных к определенным антигенам возбудителя)

Предназначен процедуру Вестерн-блот секций для определения ВИЧ-инфекции на разных стадиях. На первом этапе, очищенный вирус из составных частей подвергается электрофорезом и антигены, входящие в нее, деленной на молекулярный вес.

Вирус иммунодефицита человека размножается в живых клетках, внедренные в его генетической информации. На этой стадии, человек становится носителем вируса ВИЧ, если вы были инфицированы.

Специфика этого заболевания заключается в том, что он долгое время не проявляется. Вирус разрушает лимфоциты, таким образом, у человека снижается иммунитет и организм становится неспособным бороться с инфекциями.

Если ВИЧ-это правильно и своевременно лечить, пациент будет жить до глубокой старости. Отсутствие лечения неизбежно приводит к смерти. С момента инфекции, но без лечения, максимальный срок не более десяти лет.

Особенности

Анализ иммуноблот-это надежный метод, который позволяет определить наличие антител к ВИЧ-антигенам первого и второго типа.

Если человек инфицирован, после двух недель антитела, которые могут быть обнаружены значительно позже. Особенностью ВИЧ является то, что количество антител быстро увеличивается и остается в крови пациента. Даже если они присутствуют, болезнь может никак не проявляться в течение двух или более лет. Метод ИФА не всегда точно указывает на наличие болезни, требующая подтверждения результатов от-ПЦР и Вестерн-блот разделы, если иммуноферментный анализ показал положительный результат.

Показания к

Что это за «иммуноблот» уже выяснили, но которые вводят в исследовании?

Поводом к проверке на вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) иммуноблот станет положительным результатом ИФА. Нужно пройти через твердофазного иммуноферментного анализа у больных, которым предстоит операция. Кроме того, вы должны сделать анализ планирующих беременность женщин, а также тех, кто ведет беспорядочную половую жизнь. Вестерн-блот разделах назначают пациентам с ВИЧ-инфекцией, если результаты elisa являются сомнительными.

Поводом для обращения к врачу могут быть следующие тревожные симптомы: быстрая потеря веса;слабость, потеря функции;расстройства кишечника (понос), которая длится три недели;обезвоживание;лихорадка;увеличение лимфатических узлов в организме;развитие кандидоза, туберкулеза, пневмонии, токсоплазмоз, обострение герпеса.

Пациенту не нужно готовиться перед сдачей венозной крови.

За 8-10 часов перед тестом не кушать. Не рекомендуется за день до сдачи крови употреблять алкоголь и кофейных напитков, тяжелых физических упражнений, испытывать волнение.

Где сделать анализ?

Где я могу пройти тестирование на ВИЧ?

ИФА, иммуноблот анализа, проведенного в городских частных клиниках, результаты дают в течение дня. Возможна и срочная диагностика. В общественных учреждениях, медицинских тестов elisa и Вестерн-блот секции бесплатно, в соответствии с законодательством Российской Федерации.

Обязательную проверку на инфекционные заболевания беременных женщин, и больных, нуждающихся в госпитализации или хирургического вмешательства.Как проводится это исследование?

Как провести ИФА? Иммуноблот положительный/отрицательный подтверждает или опровергает результаты elisa. Процедура достаточно простая. Специалист осуществляет забор венозной крови, по времени это занимает менее пяти минут.

После отбора пробы, место инъекции следует продезинфицировать и заклеить пластырем. Забор проводится натощак, поэтому после процедуры не помешает съесть плитку горького шоколада или сладкий горячий напиток.

Чтобы получить направление на бесплатный анализ в государственном медицинском учреждении, необходимо посетить терапевта.

В целом, иммуноблот не отличается от других исследований крови путем забора. Методология исследования проста. Если в крови человека присутствует вирус, организм для его уничтожения начинает вырабатывать антитела. Для каждого вируса существует множество белковых антигенов. Обнаружение этих антител является основой метода Вестерн-блот разделы. Стоимость

Сколько анализ? Иммуноблот ВИЧ относится к дешевым исследований.

В среднем, скрининговые методы иммуноанализа составляет от 500 до 900 рублей. Вестерн-блот разделов является изучение проверки, стоимость которых колеблется от трех до пяти тысяч рублей. Более сложные методы намного дороже. Например, для анализа полимеразной цепной реакции (ПЦР) нужно будет заплатить около 12000 рублей.

Интерпретация результатов

Наиболее распространенные методы диагностики ВИЧ-инфекции является иммуноферментный анализ и иммуноблот.

Они это для определения в сыворотке антител к вирусу иммунодефицита человека. Инфекция обычно подтверждается двух тестов: скрининг и подтверждающий. Интерпретация результатов должна производиться врачом, он диагностирует и назначает лечение. Если иммуноблот положительный, это означает, что в человеческом организме вирус.

Положительный результат не должен стать поводом для самостоятельного лечения, поскольку каждый пациент может иметь свои собственные картины заболевания.

Качественный анализ включает в себя скрининг и сертификационный. Если у пациента не обнаруживается вирус, результат показывает «отрицательно». Когда обнаружен данный сертификат, скрининг проводят дополнительные исследования. Иммуноблот анализ, который подтверждает или опровергает скрининга. Если тест-полоски появляются в потемнение определенных областях (локализация белков), поставлен диагноз «ВИЧ».

Если результаты сомнительны, то испытания проводятся в течение трех месяцев.

Чтобы предотвратить заражение вирусом иммунодефицита человека возможно, если соблюдать определенные правила: избегать случайных половых контактов, использовать презервативы при контакте, не употребляю наркотики.

Если заболевание обнаружено у беременной женщины, важно следовать рекомендациям лечащего врача, не забывать о тесты на наличие вируса.

Что такое вестерн-блоттинг?

Идентификация белка всложных смесях или экстрактах различных тканей является одной из часто встречающихся задач. Используя такой инструмент как специфичные антитела, можно определить исследуемый белок с минимумом временных и финансовых затрат.

В методе Вестерн-блоттинг (Western blotting) на первом этапе смесь белков разделяется методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН), затем переносится на нитроцеллюлозную мембрану методом электроблоттинга.

Суть данного метода заключается в том, что гель после электрофореза помещается на нитроцеллюлозную мембрану между слоями фильтровальной бумаги. Собранный таким образом «сэндвич» помещается в электрическое поле так, что комплексы белок-ДСН движутся поперек пластины геля и иммобилизуются (в результате неспецифической сорбции) на поверхности нитроцеллюлозной мембраны.

В связывании комплекса белок-ДСН с нитроцеллюлозной мембраной принимают участие в основном силы электрической природы, причем данное взаимодействие является многоточечным и приводит к «распластыванию» белков на поверхности мембраны. Таким образом, после электропереноса мы получаем на нитроцеллюлозе реплику геля с белками, расположенными так же, как и в полиакриламидном геле.

После проведения ДСН - электрофореза, электропереноса и сорбции белков из геля на нитроцеллюлозную мембрану третичная конформация белка сильно изменена, если вообще правильно говорить о существовании третичной структуры для белка после такой жесткой обработки. Поэтому для иммунохимической детекции исследуемого белка обычно используются только моно- или поликлональные антитела, специфичные к линейным участкам белковой молекулы.

51. Иммуноферментный анализ, иммуноблоттинг. Меха-низм, компоненты, применение.

Антитела, специфичные к конформационным эпитопам (или участкам, включающим в себя межсубъединичные контакты), как правило, не пригодны для использования в методе Вестерн-блоттинг.

После переноса белков мембрану инкубируют последовательно с антителами, специфичными к исследуемому белку, а затем со вторичными антителами, специфичными к Fc-фрагментам первичных антител, конъюгированными с ферментной (или какой-либо другой) меткой (рис.

1 А). В случае, когда с меткой конъюгированы непосредственно первичные, специфичные к исследуемому антигену антитела, вторичные антитела не требуются (рис. 1 Б). Образовавшиеся в месте локализации исследуемого белка иммунные комплексы «проявляются» с помощью хромогенного субстрата (зависит от типа метки).

Чувствительность и специфичность метода сильно зависят от того, какие антитела используются при проведении исследований.

Используемые антитела должны быть специфичны к уникальной, характерной только для исследуемого белка последовательности аминокислот. В противном случае возможно взаимодействие (особенно в случае грубых белковых экстрактов) антител с несколькими белковыми молекулами, что в свою очередь приведет к появлению на мембране нескольких окрашенных полос.

Идентификация исследуемого белка в таком случае часто бывает затруднительной либо вообще невозможной.

Вторым важным фактором, о котором следует помнить при выборе антител, является аффинитет. Чем выше аффинитет используемых антител, тем ярче и четче прокрашиваются белковые полосы, тем выше чувствительность метода. При использовании высокоаффинных антител можно достичь чувствительности 1 нг и даже выше.

Для визуализации результата взаимодействия связанного с мембраной антигена и антител используют вторичные антитела, конъюгированные с агентами, способными в определенных условиях давать определенный сигнал.

Обычно в качестве такого агента используют фермент (пероксидазу или фосфатазу), продукт реакции которого имеет окраску и выпадает на мембране в виде нерастворимого осадка.

Также в данном методе возможно использование флуоресцентных меток.

Рис. 1. Схема иммунохимического окрашивания исследуемого белка: А - с использованием вторичных антител, конъюгированных с ферментной меткой; Б - первичное антитело напрямую конъюгировано с ферментной меткой.

Протокол:

I. Подготовка геля и мембраны и электроперенос белков

Полиакриламидный гель после проведения электрофореза помещают в ванночку с буфером для блоттинга (25 мМ Трис, рН 8,3, 192 мМ глицин, 10% этанол).

Два листа фильтровальной бумаги, вырезанные по форме кассеты для блоттинга и смоченные буфером для блоттинга, помещают на ту часть кассеты, которая будет обращена к аноду. Затем на фильтровальную бумагу помещают предварительно смоченную тем же буфером нитроцеллюлозную мембрану, следя за тем, чтобы между мембраной и бумагой не было пузырей воздуха.

После этого на мембрану следует осторожно поместить гель, снова обратив особое внимание на отсутствие пузырей воздуха между гелем и мембраной. Завершают формирование сэндвича два слоя смоченной фильтровальной бумаги, которые помещаются на поверхность геля (Рис. 2). Полученный сэндвич зажимается в кассете и помещается между электродами так, чтобы мембрана была обращена к аноду.

Рис. 2. Схема электропереноса белков на мембрану.

II. Электроперенос

Электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану проводят в буфере, содержащем 25 мМ Трис, рН 8,3, 192 мМ глицин, 10% этанол в течение 30-50 мин при постоянном напряжении 100 В.

Время электропереноса зависит от размера переносимых белков, чем больше белок, тем дольше осуществляется электроперенос. Качество электропереноса и расположение белковых полос оценивают, окрашивая нитроцеллюлозную мембрану 0,3% раствором Ponceau S в 1% уксусной кислоте. Перед проведением иммунохимического окрашивания мембрану следует промыть несколько раз слабо щелочным водным раствором Трис для удаления связавшегося с белками красителя.

III. Иммунохимическое окрашивание белков, иммобилизованных на нитроцеллюлозной мембране

Для блокирования мест неспецифического связывания антител мембрану инкубируют при постоянном перемешивании при комнатной температуре в течение 30 мин в PBST (для лучшей блокировки можно использовать раствор PBST, содержащий 10% сухое обезжиренное молоко).

После блокировки мембрану инкубируют в течение часа при комнатной температуре и постоянном перемешивании в PBST, содержащем 1-10 мкг/мл специфичных антител.

Оптимальная концентрация антител подбирается эмпирически и зависит от аффинности взаимодействия антител с антигеном.

По окончании инкубации мембрану промыть 5 раз PBST и перенести в раствор вторичных антител, конъюгированных с пероксидазой хрена. Разведение конъюгата обычно указывается производителем на упаковке, либо подбирается исследователем эмпирически. В растворе вторичных антител мембрану инкубировать 1 час при постоянном перемешивании.

После тщательной отмывки (минимум 5 - 6 раз менять буфер) PBST мембрану переносят в раствор хромогенного субстрата, содержащий 3 мг диаминобензидина (ДАБ) и 10 мкл 30% перекиси водорода в 10 мл 0.1 М трис-HCl, рН 7,6.

Инкубацию проводят при перемешивании 5 - 10 минут. Мембрану после окончания инкубации с субстратом следует промыть PBST, подсушить, промокнув фильтровальной бумагой, и сразу же сделать электронную копию, сканируя в цвете. Если мембрана полностью высыхает, прокрашенные белковые полосы бледнеют, и изображение получается менее ярким и контрастным.

Примечание: ДАБ является токсичным веществом и потенциальным канцерогеном. Работать только в резиновых перчатках!

Иммуноблоттинг – диагностическое мероприятие, проводимое в лабораторных условиях, по результатам которого выявляют антитела к возбудителям различных заболеваний. Одним из таковых выступает вирус иммунодефицита человека. Сразу стоит отметить, что такое исследование, как иммуноблоттинг на ВИЧ – это дополнительное мероприятие, которое назначают для подтверждения положительного результата ИФА.

Вирус иммунодефицита человека – медленно прогрессирующая инфекция. Со времени проникновения в организм патогенов и до проявления первой симптоматики часто проходит достаточно продолжительное время, которое может достигать нескольких лет.

На начальном этапе развития клинические проявления могут отсутствовать. Повышение общей температуры, недомогание, боль в горле, характерные ВИЧ-инфекции симптомы, человек путает с банальной простудой, а ведь инфекция продолжает прогрессировать. Поэтому специалисты ВИЧ-центров рекомендуют пройти комплексную диагностику в таких случаях:

• если случился незащищенный половой акт с новым партнером;
• если одноразовый медицинский шприц или иглу использовали повторно;
• если недавно была нанесена татуировка или проведен пирсинг;
• если обнаружена другая инфекция, путь передачи которой – половой (например, сифилис, бактериальный вагиноз, гонорея);
• если произошел контакт с инфицированным человеком.

Иммуноблот на ВИЧ проводится с использованием сыворотки или плазмы крови. Исследование на одном стрипе требует 1,5-2 мл крови или 15-25 мкл сыворотки.

Диагностическое мероприятие позволяет выявить антитела не только к вирусу иммунодефицита человека, но и к другим патогенам. В ходе исследования используют специальные наборы, характерные для различных заболеваний, например:

• ВПГ1 и ВПГ2 IgM/IgG (для выявления герпесвирусной инфекции);
• TORCH-профиль IgM (для выявления токсоплазмоза, краснухи, цитомегаловирусной инфекции, ВПГ 1 и ВПГ 2);
• ВЭБ IgMTIgG (для выявления вирусной инфекции Эпштейн-Барр);
• ВГС IgG (для выявления вирусного гепатита типа С).

Результат иммуноблоттинга может быть положительным (когда обнаружены антитела) и отрицательным (когда антитела в биологическом материале отсутствуют), а также неопределенным, ложноположительным и ложноотрицательным.

Где можно провериться на заражение вирусом, и что делать дальше

Каждая поликлиника, частная лаборатория, больница, клиника специализируется на подобном диагностическом мероприятии. Пройти тест можно в центре тестирования ВИЧ. Некоторые частные клиники предлагают услуги по консультированию и тестированию вируса СПИДа и ВИЧ на дому.

ВАЖНО! После получения результатов исследования нужно обратиться к лечащему врачу для назначения соответствующей терапии.

Положительные пробы

Если результаты иммуноблота положительные, это еще не значит, что в организме развивается ВИЧ-инфекция. Для подтверждения диагноза назначают иные исследования, например, непрямую иммунофлюоросценцию.

Хоть метод иммуноблота и обладает высокой чувствительностью, однако, за счет определения иммуноглобулинов класса G возможен ложноположительный результат в первые 3 недели после инфицирования. В таком случае проводится тест повторно спустя определенное время.

Все причины получения ложноположительного результата неизвестны. Наиболее распространенными источниками выступают период беременности и недавнее введение вакцины иммунопрепарата. Если по истечении определенного времени после воздействия подобных факторов иммуноблот на ВИЧ все так же положительный, это означает, что человек инфицирован.

Негативный результат

Иммуноблот может давать отрицательный результат, что сигнализирует об отсутствии в организме антител к ВИЧ-инфекции и, как следствие, – о полном здоровье.

Отрицательный иммуноблот часто наблюдается в «период окна» (в первые 3 месяца между инфицированием и появлением в крови антител). На протяжении данного срока тест не обнаруживает соответствующие антитела, но в иной жидкости (сперме, влагалищном отделяемом) можно выявить таковые и в большом объеме.

Как проводится анализ

Иммуноблот позволяет идентифицировать антитела путем исследования крови и применения гель-электрофореза.

В первую очередь проводится разрушение бактериальных клеток или вирионов ультразвуком, после чего путем электрофореза – разделение всех антигенов вируса или бактериальных клеток. В итоге получается коммерческий реагент, помещаемый на специальную нитроцеллюлозную пленку.

Во время постановки иммуноблоттинга на материал с известным антигеном наносят и исследуемую сыворотку. После того, как провели инкубацию и отмывание несвязавшихся антител, начинают иммуноферментный анализ, наносят на сыворотку иммуноглобулины, которую помечают ферментом, и хромогенный субстрат, меняющий цвет при контакте с ферментом.

Если имеются антитела, на носителе образуются пятна.

Для проведения иммуноблоттинга на ВИЧ используется забор крови

Линейный метод

Линейный блот на ВИЧ – непрямое иммунологическое исследование, методом которого получают качественный показатель аутоантител класса IgG.

В ходе иммунологического исследования используют вирусное вещество ВИЧ-формата или антигены. В лабораторных условиях соединяют белки ВИЧ и отдельные антитела, которые были получены из сыворотки крови. Далее проводится инкубация путем добавления меченых антител и человеческого иммуноглобулина.

Диагностика ВИЧ у новорожденных

В организме ребенка до 9 месяцев, рожденного от инфицированной женщины, присутствуют антитела к ВИЧ матери, что становится причиной получения ложноположительного результата ИФА. По этой причине предпочтение отдают вирусологическим тестам – количественному анализу РНК и ДНК ПЦР. Более чувствителен культуральный метод диагностики инфекции.

ВАЖНО! Показаниями к проведению диагностических мероприятий по выявлению ВИЧ-инфекции у новорожденных выступают: рождение от инфицированной женщины, получение сомнительного результата ранее осуществимого анализа.

Исследование при беременности

Так как ВИЧ-инфекция, развивающаяся у беременной женщины, может передаться будущему ребенку, требуется ранняя диагностика на вирус иммунодефицита.

В первую очередь проводится иммуноферментный анализ, применяемый в качестве скрининга. Диагностическое мероприятие помогает обнаружить в сыворотке крови антитела к инфекции. Несмотря на точные результаты анализа в период беременности, требуется повторное проведение исследования.

Разновидность ИФА – иммунный блоттинг, который часто используют в период беременности. По результатам диагностики можно выявить антитела к определенным антигенам, которые распределены по молекулярному весу методом электрофореза.

Как правильно пройти тест

Иммунный блоттинг на ВИЧ требует специальной подготовки, как и другие методы диагностики заболевания. Если провести некоторые исследования и получить результаты определенных показателей можно на протяжении всего дня (например, ответ на аллерген), то сдавать кровь на иммунологический анализ нужно только в утреннее время.

Расшифровка результатов

Расшифровку результатов иммуноблотта проводит лабораторный работник. Если обнаружили 2 из 3 протеинов ВИЧ-1 или ВИЧ-2, это указывает на присутствие в организме соответствующей инфекции. Исследование проводится для подтверждения положительного иммуноферментного анализа. Поэтому реакция проверяется и на такие протеины, как gp120/160, gp41 в сочетании с р24. Последние – это часть трех генов СПИДа – gag pol and env.

Схематическое отображение результатов иммуноблоттинга на ВИЧ

Первичная диагностика предполагает исследование белков р25, gp110/120 и gp160, указывающих на раннюю стадию развития заболевания. При положительном результате, который дал второй серологический иммуноферментный анализ, проводится иммуноблот. Если и последний дал положительный результат, диагноз ВИЧ подтверждают.

Вероятность положительного результата зависит от периода, который прошел от момента инфицирования до проведения диагностики:

• спустя 28 дней – 60-65%;
• спустя 42 дня – 80%;
• спустя 56 дней – 90%;
• спустя 84 дня – 95%.

Ложноположительный результат возможен, если забор биологического материала для дальнейшей диагностики проводился в период беременности, при нарушении гормонального фона, продолжительном подавлении иммунной функции определенными препаратами, которые принимает человек.

Критерии оценки анализа

Результаты анализа ИФА и иммуноблоттинга должны соответствовать следующим критериям:

• блот исследуемого биологического материала совпадает с блотом образца сравнения;
• молекулярная масса основного выявленного компонента соответствует требованиям спецификации.

Результаты полученные в специализированной лаборатории будут наиболее точными

Выявляемая примесь и ее содержание должны отвечать требованиям свидетельства на стандартный образец.

Неинтерпретируемые результаты

В некоторых случаях иммуноблоттинг на ВИЧ и СПИД не соответствует отрицательному и положительному результату, причем врач не может определить истинную причину сомнительных сведений. Часто причиной неправильной интерпретации выступает инфицирование, вызванное другим серотипом.

Для устранения сомнений ПЦР и ИФА проводятся в динамике. При отсутствии характерной заболеванию симптоматики на протяжении полугода и факторов риска говорят о полном здоровье. На этом этапе диагностические мероприятия оканчивают.

Сомнительный результат также можно получить при развитии в организме иного инфекционного заболевания, ракового новообразования, аллергической реакции.

Важно! При сомнительном результате человек не может быть донором крови и другого биологического материала.

Типичные ошибки при диагностике ВИЧ инфекции

Забор биологического материала, доставка и оформление материалов, используемых при проведении лабораторной диагностики, должны соответствовать следующим правилам:

1. Сопроводительная документация оформляется с указанием наименования тест-системы, ее срока годности и серии.
2. Полностью указаны паспортные данные обследуемого, дата, место забора биологического материала.
3. Сыворотка хранится не дольше установленного срока, для исследования берется допустимый объем биоптатат – не меньше 2-5 мл.
4. Номер на флаконе соответствует указанному номеру в направлении.
5. Забор биологического материала происходит по установленным правилам, а именно, из локтевой вены. В составе исследуемой крови не должно быть сгустков.

Для забора материала используется сухая пробирка. У новорожденных часто берут пуповинную кровь, указывая о таком факте в направлении.

Типичная ошибка врачей – хранение полученного материала дольше 12 часов при комнатной температуре и дольше 1 дня при температуре 4-8 градусов выше по Цельсию. За счет наступающего гемолиза искажаются результаты диагностического мероприятия.

Итак, к типичным ошибкам во время проведения диагностики ВИЧ-инфекции относят:

• неправильный забор биологического материала;
• неправильное хранение биоптата;
• неправильная транспортировка диагностических систем;
• длительное хранение тест-системы.

На результат влияет даже качество воды, используемой для промывания тары, в которую помещают биологический материал.

После получения результатов исследования лабораторный работник должен выдать для врача заключение. Если диагностика проводилась в «период окна», он назначает повторное проведение диагностики спустя определенное время. В любом случае, чтобы поставить диагноз «ВИЧ-инфекция», одного иммуноблота недостаточно. Необходима комплексная диагностика.

В практике лабораторной диагностики ин­фекционных заболеваний существует иногда не­обходимость определять антитела не вообще к патогену, а к определенным его белкам (антиге­нам), то есть спектр специфических антител. Если с этой целью использовать метод твердо­фазного иммуноферментного анализа, то в таком случае приходится предварительно из культуры патогена выделять и очищать необходимые анти­гены. Полученные белки наносят отдельно на твердую фазу. В случае использования 96-лу-ночного планшета - в каждую лунку по одному виду антигена. Затем определяют специфичес­кие антитела непрямым методом.

По наличию положительной реакции в лунке с тем или иным антигеном, можно судить о на­личии соответствующих специфических антител. Такого рода иммуноферментные тест-системы предлагаются фирмами-производителями, одна­ко широкое распространение, благодаря боль­шей информативности и простоте исполнения самого исследования, получил метод иммунного блотинга (Western blot).

Иммунный блотинг позволяет определять в сыворотке крови антитела одномоментно и в то же время дифференцированно ко всем диагнос­тически значимым белкам патогена. Перевод с английского Western blot означает западный перенос (дословно - промакивание). История этого необычного термина следующая.

Ученый по фамилии Саузерн (Е. Southern) в 1975 году впервые предложил метод переноса электрофорети чески разделенных фрагментов ДНК из геля на мембрану. По автору метод и был назван Southern blot, что в переводе оз­начает «южный перенос». Метод переноса моле­кул РНК в свою очередь был специалистами прозван Northern blot - «северный перенос». Поначалу в шутку, а затем это название закре­пилось и в официальной научной литературе.

Г. Тоубин в 1979 году опубликовал результа­ты первых опытов по белковому блотингу. В продолжение традиций «географических» на­именований методов переноса биологических макромолекул данный метод стал именоваться «западным» переносом -Western blot.

На первом этапе этого метода осуществляют электрофоретическое разделение смеси белков патогена в полиакриламидном геле в присутст­вии додецилсульфата натрия (ДСН). ДСН, яв­ляясь поверхностно активным веществом, равно­мерно обволакивает молекулы белка и придает всем им отрицательный заряд приблизительно равной величины. Поэтому молекулы движутся в электрическом поле в одном направлении, а скорость продвижения зависит только от разме­ров молекулы (молекулярной массы) белка.

В результате электрофоретической процеду­ры получают гелевую пластину, в толщине ко­торой в виде отдельных тонких линейных зон располагаются белки. По направлению движе­ния они разделяются в следующем порядке: ближе к старту находятся белки большой моле­кулярной массы, порядка 120-150 кДа, а к фи­нишу далее всех продвинулись протеины массой 5-10 кДа. На втором этапе гелевую пластину накладывают на лист нитроцеллюлозы и поме­шают эту конструкцию между электродами ис­точника постоянного тока. Под дей­ствием электрического поля белки перетекают из пористого геля на более плотную мембрану, где достаточно прочно закрепляются.

Полученный блот обрабатывается блокирую­щим раствором, содержащим индифферентные в антигенном отношении белки и/или неионные детергенты (Твин 20), которые блокируют на мембране свободные от антигена места. Затем лист-мембрану разрезают на узкие полоски таким образом, чтобы каждая полоска содержа­ла все антигенные фракции. Описанные этапы выполняются фирмой-производителем.

В коммерческих тест-системах для определе­ния антител методом иммунного блотинга содер­жатся уже готовые к исследованию блоты (по­лоски, или стрипы). Пользователь проводит оп­ределение всего спектра специфических антител к белкам патогена по схеме непрямого метода. В качестве хромогена для проведения цветной (ферментативной) реакции используют раство­римое бесцветное вещество, продукт которого приобретает окраску, становится нераствори­мым и оседает (преципитирует) на нитроцеллю­лозе.

В результате последовательного проведения иммунных и ферментативной реакции при нали­чии в исследуемой пробе антител к белкам пато­гена на блоте появляются темные поперечные по­лоски, расположение которых находится в зоне оп­ределенных белков патогена. Каждая такая полоса свидетельствует о наличии специфических антител к соответствующему антигену. Результат исследования, проведенного методом иммунного блотинга, выдается в виде перечисления антител к конкретным белкам патогена. Например: «выяв­лены антитела к белкам р17 и р24».

Нитроцеллюлозные блоты после проявления могут долго храниться в высушенном виде. Од­нако интенсивность окраски при этом значитель­но ослабевает. Влажные блоты можно фотогра­фировать или с помощью сканеров вводить их графическое изображение в память персональ­ных компьютеров. Специальные компьютерные программы позволяют обрабатывать получен­ные результаты и оперативно отслеживать дина­мику спектра антител при динамическом наблю­дении

Иммуноблоттинг (иммуноблот) – высокоспецифичный и высокочувствительный референтный метод, подтверждающий диагноз для пациентов с положительными или неопределенными результатами анализов, полученных в т.ч. при помощи РПГА или ИФА.

Этот метод выявления антител к отдельным антигенам возбудителя основан на постановке ИФА на нитроцеллюлозных мембранах, на которые в виде отдельных полос нанесены специфические белки, разделенные гель-электрофорезом. Если имеются антитела против определенных антигенов – появляется темная линия в соответствующем локусе стрипа. Уникальность иммуноблота заключается в его высокой информативности и достоверности получаемых результатов.

Материалом для исследования является сыворотка или плазма крови человека. Для исследования на одном стрипе необходимо 1,5-2 мл крови или 15-25 мкл сыворотки.

По рекомендации ВОЗ иммуноблотинг (вестерн-блот) используется при диагностике ВИЧ-инфекции в качестве дополнительного экспертного метода, который должен подтверждать результаты ИФА. Обычно этим методом перепроверяют положительный результат при ИФА, поскольку он считается более чувствительным и специфичным, хотя более сложным и дорогим.

Иммунный блоттинг сочетает в себе иммуноферментный анализ (ИФА) с предварительным электрофоретическим разделением белков вируса в геле и их переносом на нитроцеллюлозную мембрану. Процедура иммуноблота состоит из нескольких стадий. Сначала предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов ВИЧ подвергается электрофорезу, при этом все входящие в состав вируса антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга антигены переносят из геля на полоску нитроцеллюлозы или нейлонового фильтра, которые отныне содержат невидимый пока глазом спектр белков, характерный для ВИЧ. Далее на стрип наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т.п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им полосками белков-антигенов. В результате последующих манипуляций (подобных ИФА) результат этого взаимодействия визуализируется – делается видимым. Наличие полос на определённых участках стрипа подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ.

Иммунный блоттинг чаще всего используют для подтверждения диагноза ВИЧ-инфекции. ВОЗ считает положительными сыворотки, в которых методом иммунного блотинга обнаруживаются антитела к каким-либо двум белкам оболочки ВИЧ. Согласно этим рекомендациям, при наличии реакции только с одним из белков оболочки (gp160, gp120, gp41) в сочетании или без реакции с другими белками, результат считается сомнительным и рекомендуется повторное исследование, с использованием набора другой серии или другой фирмы. Если и после этого результат остается сомнительным, исследования продолжаются через каждые 3 месяца.

Особенности

Иммуноблот анализ – достоверный метод, который позволяет определить наличие антител к антигенам ВИЧ первого и второго типа. Если человек инфицирован, уже через две недели появляются антитела, которые могут обнаруживаться и намного позднее. Особенность ВИЧ в том, что количество антител быстро увеличивается и сохраняется в крови больного. Даже если они присутствуют, болезнь может не проявлять себя в течение двух и более лет. Метод ИФА не всегда точно определяет наличие заболевания, поэтому требуется подтверждение результатов с помощью иммуноблоттинга и ПЦР, если иммуноферментный анализ показал положительный результат.

Показания к назначению

Что это такое «иммуноблот» уже выяснили, но кому назначают данное исследование? Поводом сдать анализы на вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) методом иммуноблоттинга становится положительный результат ИФА. Необходимо пройти через иммуноферментный анализ пациентам, которые будут оперироваться. Кроме этого, следует сделать анализ женщинам, планирующим беременность, а также всем, кто ведет беспорядочную половую жизнь. Назначают иммуноблоттинг пациентам с ВИЧ, если результаты ИФА вызывают сомнения.

Поводом для обращения к врачу могут стать следующие тревожные симптомы:

• резкое похудение;
• слабость, потеря работоспособности;
• расстройство кишечника (диарея), которое продолжается в течение трех недель;
• обезвоживание организма;
• лихорадка;
• увеличение лимфатических узлов на теле;
• развитие кандидоза, туберкулеза, пневмонии, токсоплазмоза, обострение герпеса.

Пациенту не нужно подготавливаться перед сдачей венозной крови. За 8-10 часов до исследования нельзя принимать пищу. Не рекомендуется за сутки до сдачи крови употреблять алкогольные и кофейные напитки, заниматься тяжелыми физическими упражнениями, испытывать волнение.

Как проводится исследование?

С точки зрения пациента иммуноблот никак не отличается от любого другого анализа: берется венозная кровь, исследуется и получается результат. Но если вдаться немного подробнее методику, то она очень не простая, но все же попробуем разобраться.

Вначале, на заводе-производителе реактивов, берется «эталонный» вирус иммунодефицита человека. Затем при помощи специальной процедуры (электрофореза) в гелевой среде вирус разрушается до его мельчайших составляющих: белков (антигенов вируса). Затем при помощи самого блоттинга (от англ. промокания) частицы располагают на специальном материале – нитроцеллюлозе или нейлоновом фильтре, получается готовый к использованию индикатор, так называемый стрип. Стрип – это полоска, в которой антигены распределены в зависимости от своей молекулярной массы, в четкой последовательности, то есть каждому миллиметру бумаги соответствует определенный белок.

Как вы, возможно, знаете если в крови человека присутствуют вирусы, то организм начинает вырабатывать против их оболочек (определенных белков) антитела, при чем для каждого вируса имеется свой индивидуальный набор белков-антигенов. Выявление антител к белкам-антигенам в крови есть основа метода иммуноблот. Ведь если антитело сталкивается с антигеном, то они непременно взаимодействуют друг с другом – «прилипают».

Так вот, антигены находятся на стрип-полоске и в случае наличия в крови исследуемого подходящих антигенов они обязательно взаимодействуют друг с другом а в этом месте, на стрип полоске, проявится индикатор – появится плоска (как тест на беременность). Причем в конкретном месте полоски, таким образом врач поймет есть ли в крови набор белков характерных для того или иного вируса.

Так, к примеру, при наличии на полоске потемнения в местах локализации белков gp160, gp120, gp41 диагностируется ВИЧ, для других вирусов это будут совсем другой набор белков.

Нужно отметь, что иммуноблот позволяет точно установить наличие вируса только в том случае, если набор антител в крови является полным, то есть если белки gp160, gp120, gp41 присутствуют одновременно, то это 100% ВИЧ инфекция. А вот если хотя бы одного нет, к примеру: gp41 отсутствует, а есть только gp160, gp120, то тест расценивается как сомнительный и требует повторения.

Частые вопросы

Какие стадии включает иммуноблот?

1. Подготовка стрипа. Предварительно очищенный и разрушенный до составных компонентов вирус иммунодефицита (ВИЧ) подвергается электрофорезу, при этом входящие в состав ВИЧ антигены разделяются по молекулярному весу. Затем методом блоттинга (аналог выдавливания на «промокашку» избытка чернил) антигены переносят на полоску нитроцеллюлозы, которая отныне содержит невидимый пока глазом спектр антигенных полос, характерный для ВИЧ.
2. Исследование пробы. На нитроцеллюлозную полоску наносится исследуемый материал (сыворотка, плазма крови пациента и т.п.), и если в пробе есть специфические антитела, то они связываются со строго соответствующими им (комплиментарными) антигенными полосами. В результате последующих манипуляций результат этого взаимодействия визуализируется – делается видимым.
3. Трактовка результата. Наличие полос в на определённых участках нитроцеллюлозной пластины подтверждает присутствие в исследованной сыворотке антител к строго определённым антигенам ВИЧ.

• Полоска А – Положительный контроль
• Полоска В – Слабоположительный контроль
• Полоска С – Отрицательный контроль
• Полоска D – Положительный образец (обнаружено присутствие антител к ВИЧ-1)

Как расшифровать анализ?

Если ИФА показал наличие всех или почти всех антител к антигенам согласно данной тест-системы, это обозначает положительный анализ на ВИЧ. Если ответ после проведения второго серологического иммуноферментного анализа положительный, то необходимо провести иммуноблот. Расшифровка результатов его будет более верной. Если иммуноферментный анализ дал положительный результат, следующий анализ иммуноблота так же показал наличие ВИЧ, то ставится заключительный результат.

Когда расшифровываются анализы, то надо знать, что положительный тест на ВИЧ определяется:

• от 60% до 65% через 28 дней после заражения;
• в 80% – через 42 дня;
• в 90% – через 56 дней;
• в 95% – через 84 дня.

Если получен ответ на ВИЧ положительный, то это будет означать, что выявлены антитела к вирусу. Чтобы избежать ложноположительного ответа, надо сдать повторно анализы, желательно два раза. Если антитела к иммунодефициту выявлены при сдаче двух анализов из двух либо при сдаче 3-х анализов в 2-х из них, то считается, что результат положительный.

Антиген р 24 можно выявить в крови уже через 14 дней со дня заражения. С помощью метода иммуноферментного анализа этот антиген выявляется от 14 до 56 дней. По прошествии 60 дней его в крови уже нет. Только когда в организме формируется СПИД, происходит повторно рост этого белка р24 в крови. Поэтому тест-системы иммуноферментного анализа используются, чтобы обнаружить ВИЧ в первые дни заражения либо для того, чтобы определить, как протекает заболевание и контролировать процесс лечения. Высокая аналитическая чувствительность иммуноферментного анализа обнаруживает антиген р24 в биологическом материале при ВИЧ первого подтипа в концентрации от 5 до 10 пкг/мл, при ВИЧ второго подтипа от 0,5 нг/мл и меньше.

Под сомнительным результатом иммуноферментного анализа подразумевается, что при диагностировании где-то ошиблись, как правило, что-то перепутали медицинские работники, или у человека есть признаки инфицирования, а результат отрицательный, что вызывает подозрение, человека направляют на повторную сдачу анализа.

Под ложноположительным результатом понимается результат, когда сдача анализов крови была сделана при следующих состояниях больного:

• беременность;
• если у человека нарушен гормональный фон;
• при продолжительной иммунодепрессии.

Как расшифровать анализ в этом случае? Ложноположительный результат ставится, если выявляется хотя бы один белок. Из-за того, что антиген р24 очень зависит от индивидуальных вариаций, то, используя этот метод, в первый период заражения выявляется от 20% до 30% больных.

Насколько достоверен положительный результат теста?

Иногда у ИФА бывают ложноположительные результаты (примерно в 1% случаев), причиной подобного результата может быть беременность, различные вирусные инфекции, а также простая случайность. После получения положительного результата необходим более точный тест – иммуноблот, по результатам которого и ставится диагноз. Положительный результат иммуноблота после положительного ИФА достоверен на 99,9% – это максимальная точность для любого медицинского теста. Если иммуноблот отрицательный, значит, первый тест был ложноположительным, и на самом деле ВИЧ у человека нет.

Что такое неопределенный (сомнительный) результат?

Если ИФА бывает положительным или отрицательным, то иммуноблот может быть положительным, отрицательным или неопределенным. Неопределенный результат иммуноблота, т.е. наличие в иммуноблоте хотя бы одного белка к вирусу, может наблюдаться, если заражение произошло недавно и в крови еще мало антител к ВИЧ, в этом случае иммуноблот станет положительным через некоторое время. Также неопределенный результат может появиться при отсутствии ВИЧ-инфекции при гепатите, некоторых хронических заболеваниях обменного характера, или при беременности. В этом случае, либо иммуноблот станет отрицательным, либо будет обнаружена причина неопределенного результата.

Сколько стоит анализ?

Иммуноблот на ВИЧ не относится к дешевым исследованиям. В среднем, скрининговое обследование иммуноферментными методами стоит от 500 до 900 рублей. Иммуноблоттинг – это верификационное исследование, стоимость которого составляет от трех до пяти тысяч рублей. Более сложные методы стоят намного дороже. Например, за анализ полимеразной цепной реакции (ПЦР) нужно будет заплатить около 12000 рублей.

Где сделать анализ?

Где можно сдать анализ на ВИЧ? ИФА, иммуноблот исследования проводят в городских частных клиниках, результаты выдают в течение суток. Возможна и срочная диагностика. В государственных медицинских учреждениях анализы ИФА и иммуноблоттинг проводят бесплатно, согласно законодательству РФ. В обязательном порядке проверку на инфекционные заболевания проходят беременные женщины, а также пациенты, которым предстоит госпитализация или оперативное вмешательство.

Твердофазный ИФА - вариант теста, когда один из компо­нентов иммунной реакции (антиген или антитело) сорбирован на твердом носителе, напр., в лунках планшеток из полистирола. Компоненты выявляют добавлением меченых антител или анти­генов. При положительном результате изменяется цвет хромоге­на. Каждый раз после добавления очередного компонента из лунок удаляют несвязавшиеся реагенты путем промывания,

При определении антител (левый рисунок) в лунки планшеток с сорбированным антигеном последовательно добавляют сы­воротку крови больного, антиглобулиновую сыворотку, ме­ченную ферментом, и субстрат/хромоген для фермента.

II. При определении антигена (правый рисунок) в лунки с сорби­рованными антителами вносят антиген (напр. сыворотку кро­ви с искомым антигеном), добавляют диагностическую сыво­ротку против него и вторичные антитела (против диагностиче­ской сыворотки), меченные ферментом, а затем субстрат/хро­моген для фермента.

Конкурентный ИФА для определения антигенов: искомый антиген и меченный ферментом антиген конкурируют друг с другом за связывание ограниченного количества антител иммунной сыворотки.

Другой тест - конкурентный ИФА для определения антител: искомые анти­тела и меченные ферментом антитела конкурируют друг с дру­гом за антигены, сорбированные на твердой фазе.

Иммуноблоттинг - высокочувстви­тельный метод выявления белков, основанный на сочетании электрофореза и ИФА или РИА. Иммуноблоттинг ис­пользуют как диагностический метод при ВИЧ-инфекции и др.

Антигены возбудителя разделяют с помощью электрофоре­за в полиакриламидном геле, затем переносят их из геля на активированную бумагуили нитроцеллюлозную мембрану и проявляют с помощью ИФА. Фирмы выпускают такие полоски с «блотами» антиге­нов. На эти полоски наносят сыворотку больного. Затем, после инкубации, отмывают от несвязавшихся антител боль­ного и наносят сыворотку против иммуноглобулинов челове­ка, меченную ферментом. Образовавшийся на полоске комплекс [антиген + антитело больного + антитело против Ig человека] выявляют добавлением хромогенного субстрата, изменяющего окраску под действием фермента.

52. Интерфероны, природа. Способы получения и применения.

Интерферон относится к важным защитным белкам иммунной системы. Открыт при изучении интерференции вирусов, т. е. явления, когда животные или культуры клеток, инфициро­ванные одним вирусом, становились нечувствительными к заражению другим вирусом. Оказалось, что интерференция обусловлена образующимся при этом белком, обладаю­щим защитным противовирусным свойством. Этот белок назвали интерфероном.

Интерферон представляет собой семейство белков-гликопротеидов, которые синтезируются клетками иммунной системы и соединительной ткани. В зависимости от того, какими клетками синтезируется интерферон, выделяют три типа: α, β и γ-интерфероны.

Альфа-интерферон вырабатывается лейкоцитами, и он получил название лейкоцитарного;бета-интерферон называют фибробластным, поскольку он синтезируется фибробластами - клетками соединительной ткани, агамма-интерферон - иммунным, так как он вырабатывается активированными Т-лимфоцитами, макрофагами, естественными киллерами, т. е. иммунными клетками.

Интерферон синтезируется в организме постоянно, и его концентрация в крови де­ржится на уровне примерно 2 МЕ/мл (1 международная единица - ME - это количество интерферона, защищающее культуру клеток от 1 ЦПД 50 вируса). Выработка интерферона резко возрастает при инфицировании вирусами, а также при воздействии индукторов интерферона, например РНК, ДНК, сложных полимеров. Такие индукторы интерферона получили названиеинтерфероногенов.

Помимо противовирусного действия интерферон обладает противоопухолевой защитой, так как задерживает пролиферацию (размножение) опухолевых клеток, а также иммуномодулирующей активностью, стимулируя фагоцитоз, естественные киллеры, регулируя антителообразование В-клетками, активируя экспрессию главного комплекса гистосовместимости.

Механизм действия интерферона сложен. Интерферон непосредственно на вирус вне клетки не действует, а связывается со специальными рецепторами клеток и оказывает влияние на процесс репродукции вируса внутри клетки на стадии синтеза белков.

Применение интерферона . Действие интерферона тем эффективнее, чем раньше он начинает синтезироваться или поступать в организм извне. Поэтому его используют с профилактической целью при многих вирусных инфекциях, например гриппе, а также с лечебной целью при хронических вирусных инфекциях, таких как парентеральные гепатиты (В, С, D), герпес, рассеянный склероз и др. Интерферон дает положительные результаты при лечении злокачественных опухолей и заболеваний, связанных с иммунодефицитами.

Интерфероны обладают видоспецифичностью, т. е. интерферон человека менее эффективен для животных и наоборот. Однако эта видоспецифичность относительна.

Получение интерферона . Получают интерферон двумя способами: а) путем инфицирования лейкоцитов или лимфоцитов кро­ви человека безопасным вирусом, в результате чего инфицированные клетки синтезируют интерферон, который затем выделяют и конструируют из него препараты интерферона; б) генно-инженерным способом - путем выращивания в производственных условиях рекомбинантных штаммов бактерий, способных продуцировать интерферон. Обычно используют рекомбинантные штаммы псевдомонад, кишечной палочки со встроенными в их ДНК генами интерферона. Интерферон, полученный генно-инженерным способом, носит название рекомбинантного. В нашей стране рекомбинантный интерферон получил официальное название «Реаферон». Производство этого препарата во многом эффективнее и дешевле, чем лейкоцитарного.

Рекомбинантный интерферон нашел широкое применение в медицине как профилактическое и лечебное средство при вирусных инфекциях, новообразованиях и при иммунодефицитах.