Ce este un test Ifa? Imunotestul enzimatic (EIA). De ce sa faci astfel de teste?

– un test de laborator modern care caută anticorpi specifici în sânge sau antigeni la anumite boli pentru a identifica nu numai etiologia, ci și stadiul bolii. Rezultatele ELISA pot fi date calitativ și cantitativ.

În prezent, ELISA este utilizat în următoarele situații:

1) Căutați anticorpi specifici pentru orice boală infecțioasă;
2) căutarea antigenelor oricăror boli (infecțioase, venerologice);
3) studiul stării hormonale a pacientului;
4) examinarea markerilor tumorali;
5) examinarea prezenței bolilor autoimune.

Avantajele metodei ELISA:

1) Specificitate și sensibilitate ridicată a metodei ELISA (mai mult de 90%).
2) Capacitatea de a determina boala și de a urmări dinamica procesului, adică de a compara numărul de anticorpi în diferite perioade de timp.
3) Disponibilitatea diagnosticelor ELISA în orice instituție medicală.

Dezavantaj relativ:

1) Detectarea răspunsului imun (anticorpi), dar nu a agentului patogen în sine.

Noțiuni de bază

Înainte de a clarifica esența metodei ELISA, să înțelegem pe scurt câteva concepte.
Anticorpi (sau imunoglobuline - Ig) - proteine ​​specifice produse de B -
limfocite (celule imunitare) ca răspuns la orice agent patogen infecțios (viruși, bacterii, ciuperci etc.) care intră în organism. Există imunoglobuline A (IgA), imunoglobuline E (IgE), imunoglobuline M (IgM), imunoglobuline G (IgG), imunoglobuline D (IgD). Ele diferă unele de altele prin forma și greutatea moleculară, timpul de înjumătățire, participarea/neparticiparea la procesele infecțioase și momentul detectării din momentul infecției. Dacă luăm în considerare greutatea moleculară, atunci IgM are cea mai mare greutate - este un pentamer (950.000 daltoni) spre deosebire de alte Ig (de la 150 la 200.000 Da), datorită cărora IgM pur și simplu nu poate trece prin bariera placentară. Prin urmare, detectarea IgM la un copil de 1 an este întotdeauna un semn al prezenței infecției la făt. În serul sanguin, cea mai mare parte a imunoglobulinelor este reprezentată de IgG (75-85%), iar cea mai scăzută este IgE (0,003%). Doar IgA, M, G sunt direct implicate in procesul infectios.IgE este un semn reactii alergiceși boli, iar IgD poate fi detectată numai în țesutul ganglionilor limfatici și amigdalelor, joacă un rol în formarea imunității locale.

Antigene – substanțe cu un nivel molecular înalt de origine organică, în special agenți patogeni ai bolilor infecțioase și a altor boli, precum și substanțe ale diferitelor celule modificate formate în timpul unei anumite boli (boli autoimune, oncologie).

Complex imunitar – un complex antigen-anticorp implicat în procesul imunitar.

Pe ce se bazează metoda ELISA?

Există mai multe tipuri de ELISA (directă, indirectă, metodă de blocare, competitivă), dar în practică se folosește cel mai des testul imunologic în fază solidă heterogen sau ELISA (testul imunosorbent legat de enzime).

Baza imunotestului enzimatic este reacția imună a antigenului și anticorpului cu formarea unui complex imun: antigen-anticorp, care are ca rezultat o modificare a activității enzimatice a semnelor specifice de pe suprafața anticorpilor.

În termeni simpli, acest proces poate fi împărțit în mai multe etape:

1) Pe suprafața godeurilor tabletei medicului care efectuează examinarea, există un antigen purificat al unui anumit agent patogen. Când se adaugă material biologic (ser de sânge) de la pacient, are loc o reacție specifică între acest antigen și anticorpul dorit (imunoglobulină). Acest compus va acționa ca un „antigen special” în următorul pas.

2) În această etapă, are loc formarea IC (complexe imune) - o reacție între un „antigen special” și un conjugat (aceasta este o imunoglobulină marcată cu enzima peroxidază). Se adaugă un cromogen special. Rezultatul acestei reacții enzimatice este formarea unei substanțe colorate în godeul tabletei, a cărei intensitate a culorii depinde de cantitatea de imunoglobuline (anticorpi) conținute în materialul pacientului.

3) În continuare, se evaluează rezultatul: fotometrie folosind un spectrofotometru multicanal, comparație densitate optica a materialului studiat cu densitatea optică a probelor de control, prelucrarea matematică a rezultatelor. Cantitatea de anticorpi la un pacient depinde direct de înălțimea densității optice a unui godeu dat.

În mod obișnuit, în practică sunt utilizate plăci cu 96 de godeuri.

Când se măsoară densitatea optică (OD) a lichidului de testat, se calculează cantitatea (sau concentrația) de anticorpi într-o anumită unitate de volum. Rezultatul este apoi comparat cu o probă martor.

Trebuie să rețineți:Pentru fiecare sistem de testare, sunt dezvoltați indicatori individuali pentru a înregistra rezultatele, indicatorii de normalitate și patologie (adică „valori de referință”). Acest lucru trebuie luat în considerare atunci când se evaluează rezultatele fiecărui studiu specific. Este incorect interpretarea rezultatelor unui laborator pe baza „valorilor de referință” ale altui laborator. De asemenea, este incorect să comparăm rezultatele diferitelor laboratoare între ele.

La efectuarea reacțiilor ELISA, conceptul de aviditate a anticorpilor este de asemenea important.
Aviditatea anticorpilor - aceasta este puterea conexiunii dintre anticorp și antigen și cantitatea de antigen care este în relație cu imunoglobulinele (anticorpi). Aviditatea are mare importanță atunci când se evaluează durata preconizată a infecției, ceea ce este extrem de important la diagnosticarea infecției primare la gravide.

Baza testului de aviditate a anticorpilor constă în tratarea complexului imun (antigen-anticorp) cu o soluție de uree pentru a distruge proteina. Legăturile cu aviditate ridicată rămân intacte, în timp ce legăturile cu aviditate scăzută sunt distruse. Rezultatul este dat ca indice de aviditate exprimat ca procent (%).

Ce boli sunt detectate folosind diagnosticul ELISA?

2. Markeri ai bolilor autoimune și indicatori ai imunității umane(IgE total, IgG total, IgA total, IgM total, IgD total, IgA secretorie, IgG 2, IgG4, complexe imune circulante CEC, IgA și IgG la gliadină și altele)

3. Markeri oncologici(TNF - factor de necroză tumorală, CEA - antigen carcinoembrionar, PSA - antigen specific prostatic, hCG - gonadotropină corionica umană, CA 125, alveomucină și multe altele)

4. Tulburări de reproducere I (estradiol, progesteron, prolactină, testosteron, AFP-alfafetoproteină, FSH - hormon foliculo-stimulator și altele)

5. Boli glanda tiroida (T3 liber și legat, T4, tiroglobulină, peroxidază tiroidiană - TPO, hormon de stimulare a tiroidei - TSH).

Această listă nu reprezintă toate bolile care sunt diagnosticate cu ajutorul imunotestului enzimatic.

Material pentru analiza ELISA și reguli pentru colectarea acestuia

Cel mai comun material pentru reacția ELISA este serul sanguin al pacientului luat pe stomacul gol. Materialul poate fi, de asemenea, lichid cefalorahidian, lichid amniotic, conținut vitros, mucus al canalului cervical și al uretrei, frotiuri.

Pregătirea pacienților pentru a trimite material pentru ELISA

Timp de producție pentru ELISA

Imunotestarea enzimatică a materialului se efectuează rapid, în decurs de 24 de ore. Pot apărea întârzieri în diferite laboratoare din cauza acumulării unei anumite cantități de ser.

Rezultate posibile ale diagnosticului ELISA

Atunci când se evaluează rezultatele pentru infecții specifice, clasa de anticorpi detectați și cantitatea acestora sunt importante. Nu numai problema etiologiei infecției (dacă există sau nu), ci și stadiul așteptat al bolii (acută, cronică), precum și prezența unei infecții active (acută sau exacerbarea cronică) la nivelul timpul examinării depinde de aceasta.

Care este intervalul de timp aproximativ pentru apariția anticorpilor (imunoglobuline - Ig)?

Cei mai timpurii anticorpi sunt IgM. Ele pot fi detectate la 1-3 săptămâni după posibila infecție, care caracterizează faza acută a procesului infecțios. A doua situație pentru apariția anticorpilor IgM este activarea (sau exacerbarea) unui proces cronic. Anticorpii IgM circulă în medie aproximativ 3 luni, apoi numărul lor dispare treptat. Cu toate acestea, la unii pacienți, urme de IgM pot fi detectate în decurs de 1-2 ani de la infecție.

Sistemele moderne de testare sunt foarte sensibile, rezultând nespecifice false pozitive(deseori la femeile însărcinate). Prin urmare, la acest grup de pacienți, IgM pozitiv trebuie reverificat!

Anticorpii IgA apar la 2-4 săptămâni după infectare, dar în cantități suficiente pentru a fi detectați într-o lună. IgA serică este sintetizată de celulele plasmatice ale splinei, ganglionilor limfatici și membranelor mucoase.IgA secretorie este concentrată pe membranele mucoase pentru a-și îndeplini funcția protectoare - acestea participă la imunitatea locală.

Din a 4-a săptămână după infectare, încep să apară anticorpi IgG. În cazul majorității infecțiilor, titrul lor crește treptat cu maximum de termeni diferiți(în medie după 1,5-2 luni), apoi titrul rămâne la un nivel scăzut și indică imunitatea. In unele boli (micoplasmoza, chlamydia, trichomoniaza), nivelul IgG nu este ridicat si scade semnificativ din cauza lipsei de imunitate in aceste infectii.

Opțiuni pentru detectarea anticorpilor de diferite clase:

Detectarea izolată a anticorpilor IgM sugerează prezența unui primar
infecţie.
- Detectare simultană în IgM din sânge iar IgG este tipică pentru infecția primară
în ultimele 2-3 luni, precum și în timpul exacerbării unei boli cronice. Prin urmare, în timpul sarcinii, prezența IgM nu este întotdeauna un semn de infecție primară.
- Detectarea IgG izolate poate indica imunitate la această boală,
cat si pentru infectia cronica. În a doua situație, atât cantitatea de anticorpi (titru) cât și modificarea acestui titru în timp sunt importante. De obicei, studiile sunt efectuate la intervale de 2-4-6 săptămâni.
- Detectarea IgA izolata sau cu IgM indica o infectie primara. La
apariţia IgA împreună cu IgG sugerează activarea infecție cronică(în medie 2 săptămâni de la momentul exacerbării).

Definiție Aviditatea anticorpilor IgG este o etapă complementară excelentă în diagnosticul infecției primare din infecție de lungă durată, care își are semnificația clinică, în primul rând, la evaluarea riscului de infecție intrauterină a fătului. Detectarea IgG cu aviditate scăzută indică o infecție primară și este detectată în medie la 4-6 luni după infectare, rar mai mult. IgG cu aviditate scăzută necesită altele confirmări de laborator infecție primară (IgM). Anticorpii cu aviditate ridicată sunt fie semnul unei boli cronice și exacerbarea acesteia, fie al imunității formate.

Caracteristici la sugari:la copiii de până la un an, și uneori chiar de 1,5 ani, IgG maternă la diferite infecții circulă în sânge (adică au pătruns prin placentă de la mamă la făt în timpul dezvoltării intrauterine). Ele nu sunt în sine un semn al prezenței infecției în prezent. Dacă IgM este detectată la această vârstă (rețineți că IgM maternă nu poate pătrunde în placentă), atunci acesta este un semn de infecție intrauterină sau o infecție dobândită după naștere.

Metoda ELISA cantitativă

Rezultatul diagnosticului ELISA (folosind un analizor imunoenzimatic) este dat în anumite unități de măsură:
- Densitatea optică (OD) a unei probe – concentrația de anticorpi specifici pe unitatea de volum. Cu cât este mai mare DO a probei, cu atât concentrația de anticorpi este mai mare. Unele rezultate se referă la coeficientul de pozitivitate (CP), care este și densitatea optică a probei.
- Unități de concentrație de anticorpi (nanogramă/mililitru sau ng/ml).
- Sub formă de titruri serice: 1:20, 1:40, 1:100, 1:200, 1:400, 1:800, 1:1200 și așa mai departe. Titrurile diagnostice (la care se face diagnosticul bolii și nu faptul infecției) sunt diferite pentru diferite boli.
- Sub formă de simboluri – „+”, „-”, „?” (+, ++, +++, ++++).
- Sub forma unei evaluări calitative după un criteriu dat (pozitiv sau negativ).

Numai un medic poate evalua corect numărul de anticorpi, opțiunea de detectare a clasei de imunoglobuline și, prin urmare, poate stabili stadiul bolii și necesitatea tratamentului.

Nu trebuie să uităm că pentru orice sistem de testare sunt dezvoltate propriile „valori de referință” (variante ale normei), atunci când este depășită, o anumită boală este diagnosticată (variante de patologie). Pentru diferite sisteme de testare, „valorile de referință” sunt diferite.

Compararea corectă a rezultatelor ELISA luate în timp este posibilă numai dacă acestea au fost produse în același laborator.

Medicul boli infecțioase N.I. Bykova

Testul de sânge imunoenzimatic este unul dintre cele mai importante studii efectuate pentru a evalua capacitatea organismului uman de a rezista atacului agenților patogeni. Vă permite să înțelegeți cât de bine se descurcă sistemul imunitar procese infecțioase. Acest lucru, la rândul său, face posibilă ajustarea regimului de tratament, dacă este cazul.

Și acestea nu sunt toate caracteristicile acestui test, așa că haideți să aruncăm o privire detaliată la întrebările despre ce este analiza ELISA, cui este indicată, cum este efectuată și ce pot indica datele obținute.

Ce fel de cercetare este aceasta

Deci, ce este analiza ELISA? Această abreviere înseamnă „enzyme immunoassay”. Se efectuează dacă este necesar să se determine prezența anticorpilor la diferiți antigeni.

Antigenele sunt agenți patogeni care promovează dezvoltarea diverse patologii. Anticorpii sunt substanțe care sunt necesare pentru a distruge celulele străine.

Imunotestarea sângelui are ca scop determinarea nivelurilor de imunoglobuline, care pot fi combinate în imunocomplexe. Ele sunt produse în mod activ de sistemul imunitar ca răspuns la introducerea de antigene în organism.

Notă. Pentru a combate fiecare tip individual de antigen, sunt produși proprii anticorpi specifici. Acesta este ceea ce ajută la identificarea bolii și chiar a stadiului acesteia, folosind imunotestul enzimatic al sângelui.

Când un antigen străin intră în corpul uman, anticorpii „se leagă” de el și apoi îi neutralizează efectul. Acest lucru se întâmplă din cauza reacțiilor de liză enzimatică și fagocitoză. Datorită acestui proces, antigenele sunt îndepărtate din sânge.

Când este programat testul?

După ce am înțeles ce este un imunotest enzimatic, vom înțelege situațiile în care este indicat. Deci, cercetarea este necesară atunci când:

• boli oncologice;
• hepatita virala;
• erupții cutanate herpetice pe piele sau mucoase;
• salmoneloză;
• pojar;
• encefalită;
• sifilis;
• dizenterie;
• Dermatita atopica sau manifestări atipice ale reacţiilor alergice.

În plus, metoda ELISA este utilizată pentru a identifica și identifica agenții patogeni:

• boli cu transmitere sexuala;
• infecție cu citomegalovirus;
• helmintiazele.

Imunotestul enzimatic este un studiu care ajută la determinarea naturii bolilor endocrine, precum și la identificarea prezenței imunodeficienței și a infertilității la bărbați și femei. Cu ajutorul lui, se fac prognoze pentru evoluția ulterioară a atacurilor de cord, a accidentelor vasculare cerebrale, a bolilor neurologice și renale.

Se efectuează analiza ELISA și în scop preventiv. Este obligatorie efectuarea acestuia în timpul sarcinii, precum și pentru pacientele care au suferit anterior de bolile descrise mai sus. Persoanele cu risc de a dezvolta bolile menționate anterior, de asemenea, donează în mod regulat sânge pentru ELISA.

Caracteristici ale testării și decodării

În cele mai multe cazuri, sângele pacientului este luat pentru imunotest enzimatic. Dar, în anumite circumstanțe, țesutul poate fi colectat de pe suprafața corpului vitros. La femeile însărcinate, diagnosticul ELISA poate fi efectuat prin studierea compoziției lichidului amniotic.

Prelevarea de sânge se efectuează cu o seringă, iar materialul pentru cercetare este prelevat, de regulă, dintr-o venă similară cu interiorîndoirea cotului. Pacientul trebuie să fie într-o stare relaxată, în poziție șezând.

Important! Rezultatele testului, interpretarea și decodificarea datelor depind de metoda de manipulare a diagnosticului și de echipamentul utilizat. De regulă, fiecare laborator indică norma nivelurilor de imunoglobuline pe formular.

Caracteristicile pregătirii

Un test de sânge pentru ELISA necesită anumite proceduri pregătitoare:

• sari peste micul dejun in ziua testului;
• oprirea diluanților de sânge și a altor medicamente agenţi farmacologici care pot afecta rezultatele (după consultarea preliminară cu medicul curant);
• abținerea de la fumat în ziua studiului;
• evitați consumul de alcool cu ​​o zi înainte de prelevarea de sânge;
• excluzând utilizarea substanțelor stupefiante (inclusiv medicamentele care le conțin).

Respectarea acestor reguli pentru pregătirea pentru un test de sânge imunochimic elimină posibilitatea distorsionării datelor.

Interpretarea datelor

Rezultatele studiului sunt date pacientului, după care acesta este supus unui al doilea consult cu un specialist. Decodificarea datelor ELISA poate fi pozitivă sau negativă. În acest caz, se iau în considerare și numerele care indică (dacă au fost găsite).

Dacă ELISA este negativă, aceasta poate indica absența proceselor patologice sau faza inițială a dezvoltării lor. De asemenea, se observă un rezultat „minus” al studiului atunci când pacientul își revine după terminarea cursului de terapie. Dar astfel de date pot fi obținute numai după o anumită perioadă de timp (1 - 2 luni).

Dacă nu există IgM în sânge, iar analiza IF a arătat rezultat pozitiv Cu toate acestea, acest lucru poate indica faptul că pacientul a dezvoltat o imunitate puternică la un anumit tip de antigen. Asta se întâmplă cu imunizarea.

Cu o concentrație mare de IgM în absența IgG și IgA, putem vorbi despre proces inflamator care apar în faza acută.

Ce înseamnă dacă ELISA este pozitiv pentru toate tipurile de imunoglobuline? În astfel de cazuri, este posibil să vorbim despre o recidivă a patologiei infecțioase. În acest caz, apariția anticorpilor este înregistrată numai în faza acută boala cronica.

Când boala intră în faza de atenuare, rezultatele vor fi negative. Dar ELISA pentru IgG și IgA va fi pozitiv.

Avantajele și dezavantajele testului

Testele de sânge folosind ELISA au punctele sale forte și punctele slabe. Avantajele includ:

• cost relativ scăzut;
• precizie;
• posibilitatea de testare regulată pentru a evalua eficacitatea tratamentului;
• viteza de executie;
• utilizarea tehnologiilor de înaltă precizie și de înaltă informare pentru a obține rezultate fiabile;
• posibilitatea de a efectua mai multe studii în zona aceluiași focus al procesului patologic;
• lipsă de durere absolută;
• absența oricăror riscuri pentru sănătatea pacientului;
• relativă ușurință de cercetare.

Testul de sânge ELISA, datorită avantajelor descrise mai sus, a devenit larg răspândit și joacă un rol important în diagnosticarea diferitelor boli.

Defecte

Un dezavantaj semnificativ al ELISA de sânge este probabilitatea de a obține rezultate fals pozitive sau fals negative. Dar în majoritatea cazurilor acest lucru nu se datorează metodei de cercetare în sine, ci factorului uman.

O altă nuanță care poate afecta datele finale sunt medicamentele utilizate în timpul testului. Cu ei abuz, sau în cazul unui defect, interpretarea testelor ELISA va fi nesigură. Prin urmare, studiul va trebui repetat.

Important! Datele de testare pot fi afectate de o încălcare procesele metaboliceîn corpul pacientului. În plus, prezența mai multor focare de boli infecțioase (cronice!) simultan poate afecta rezultatele.

Se efectuează un test de sânge folosind ELISA pentru a identifica:

• ascariaza;
• opistorhiază - acută sau cronică;
• giardioza;
• toxoplasmoza.

De asemenea, în timpul studiului, în corpul pacientului pot fi detectați oxiuri sau amibe. Diagnosticul de „leishmanioză” și „trichineloză” este adesea pus la pacienți pe baza datelor testelor de sânge ELISA.

Să rezumam

Desigur, este foarte dificil să înțelegeți singur datele de testare, deoarece în timpul acestui proces trebuie luați în considerare numeroși factori. Obiceiuri proaste, prezența bolilor concomitente, utilizarea anumitor grupe de medicamente - toate acestea joacă un rol important și pot afecta rezultatele, ceea ce iau în considerare medicii atunci când interpretează rezultatele ELISA.

Cu toate acestea, „conștient înseamnă că este înarmat”, deci este important ca fiecare persoană să cunoască specificul efectuării și interpretării datelor acelor teste de laborator pe care i le prescrie medicul curant. Și metoda ELISA nu face excepție!

(ELISA) este o metodă de testare a sângelui în laborator, bazată pe căutarea unor celule speciale - anticorpi împotriva diverse boli. Metoda permite nu numai identificarea agentului patogen, ci și determinarea în ce stadiu se află procesul patologic. Acesta din urmă este foarte important pentru prognostic și tratament suplimentar rabdator.

Avantajele și dezavantajele metodei

Printre toate metode moderne ELISA de diagnostic este cel mai inovator și mai precis din punct de vedere tehnic. Principalele sale avantaje sunt:

1. Capacitatea de a căuta toți anticorpii existenți împotriva bolilor infecțioase în sângele pacientului.
2. Accesibilitate ridicată a metodei de cercetare. Astăzi, testele ELISA pot fi efectuate de orice laborator de dimensiuni medii.
3. Aproape 100% specificitatea și sensibilitatea metodei.
4. Capacitatea de a căuta anticorpi și antigene, precum și de a stabili stadiul procesului patologic și de a urmări dinamica acestuia, datorită comparării cantităților.

Acest număr de avantaje față de alte teste umbrește complet singurul și singurul dezavantaj al testului: este capabil să detecteze anticorpi, dar nu și agentul patogen în sine.

Termeni cheie pentru evaluarea analizei

Pentru a înțelege ce este analiza ELISA, ce este și cum se efectuează, trebuie să vă familiarizați cu termenii de bază folosiți de specialiști.

1. Anticorp- o proteină care este produsă de celulele sistemului imunitar uman (limfocitele de tip B). Ei răspund cu o reacție specifică la intrarea unui agent străin sau a unei substanțe în organism. Un alt nume pentru anticorpi este imunoglobulinele, aparțin unor clase diferite: A, E, M, G. Ele diferă între ele în masă, viteza de reacție, timpul de înjumătățire și o serie de alte caracteristici. În mod normal, sângele uman conține în principal imunoglobuline din clasa G. Dacă apare orice infecție, cantitatea de imunoglobuline A și M crește brusc. Imunoglobulinele E participă la reacțiile alergice.
2. Antigenul- un agent străin de origine organică și greutate moleculară mare. Cel mai adesea reprezintă agenți patogeni sau biologici ai acestora substanțe active.
3. Complexul antigen-anticorp, sau complexul imun, este combinația directă a unei substanțe străine și imunoglobulină, care dă naștere la dezvoltarea unei reacții imune.

Esența și domeniul de aplicare al metodei

Pacienții au adesea o întrebare: analiza ELISA, ce este, cum se efectuează și pentru ce este? Puteți vorbi despre metodă într-un mod accesibil, descriind pe scurt etapele acesteia.

Etapa pregătitoare. Medicul de laborator folosește o placă specială cu 96 de godeuri. Antigenul unui agent patogen specific este aplicat pe suprafața fiecărui godeu.

Etapa 1. Se extrage sânge, care este apoi aplicat picătură cu picătură în fântână. Sonda inițiază o reacție între antigen și anticorpul din sânge.

Etapa 2. Reacția cu formarea complexelor imune este în plină desfășurare în gaură. Ca rezultat, se formează o substanță de o anumită culoare. Intensitatea culorii depinde de cantitatea de anticorpi din sângele pacientului pentru fiecare agent patogen specific.

Etapa 3. Evaluarea rezultatului prin fotometrie. În acest scop, se folosește un dispozitiv special numit spectrofotometru. Este folosit pentru a compara densitatea materialului din gaură și proba de control. Apoi, dispozitivul generează un rezultat prin analiză matematică.

Evaluarea rezultatelor și scopul ELISA

Interpretarea rezultatului depinde de mai multe nuanțe importante:

1. Densitatea optică a puțului.
2. Producator placi cu puturi (sisteme de testare).
3. Laboratorul în care a fost efectuat studiul.

Având în vedere aceste nuanțe, nu ar trebui să comparați niciodată două rezultate de la sisteme de testare diferite sau de la laboratoare diferite.

Un alt punct important care afectează analiza ELISA este așa-numita aviditate la anticorpi. Acest parametru caracterizează cantitatea de antigen și puterea legăturii în complexul antigen-anticorp. Definiția sa se bazează pe tratamentul complexului imun cu uree pentru a rezolva structurile proteice. Acest lucru vă permite să distrugeți legăturile slabe dintre antigen și anticorp și să lăsați doar cele puternice. Semnificația studiului avidității este că poate fi folosit pentru a determina durata infecției. Aceste informații sunt extrem de importante pentru stabilirea unui diagnostic la femeile însărcinate.

Un test de sânge folosind metoda ELISA servește:

1. Pentru a căuta diverși antigeni patogeni.
2. Pentru a studia nivelurile hormonale.
3. Pentru examinarea prezenței patologiei autoimune.
4. Pentru a detecta markerii cancerului.

Varietăți de ELISA

Analiza ELISA are următoarele tipuri:

1. Indirect.
2. Drept.
3. Competitiv.
4. Metoda de blocare.

Dar, de fapt, astăzi este folosită doar o metodă numită ELISA (enzyme linked immunosorbent assay). Se bazează pe reacția descrisă mai sus de formare a unui complex antigen-anticorp cu o schimbare a culorii pe suprafața godeului.

Testul cantitativ de sânge ELISA în sine merită o atenție specială. Acesta nu este un tip de analiză, ci o modalitate de evaluare a rezultatelor. Datorită acesteia, se calculează numărul de anticorpi și se determină clasele acestora. Rezultatul depinde de densitatea optică a probei, de sistemul de testare pe care a fost efectuată analiza ELISA, precum și de laborator.

Boli detectate prin ELISA

ELISA este un test de sânge care detectează o cantitate mare diverse boli infecțioase. Mai mult, atât infecțiile virale, cât și cele virale sunt detectate cu aceeași acuratețe. boli bacteriene. De exemplu, folosind formarea complexelor imune, se poate dovedi prezența antigenelor agenților patogeni ai următoarelor boli:

În plus, ELISA vă permite să detectați:

1. Markeri de cancer - TNF (factor de necroză tumorală), PSA (antigen specific prostatei), CEA (antigen carcinoembrionar), CA-125 (marker tumoral ovarian)
2. Hormonul sarcinii este hCG (gonadotropina corionică umană).
3. Tulburări ale sistemului reproducător: hormoni ai sistemului reproducător feminin și masculin.
4. Patologia glandei tiroide.

Este important de menționat că testul ELISA pentru HIV este astăzi principalul mod de a diagnostica această boală periculoasă.

Material pentru ELISA și tehnica de eșantionare

Pentru a efectua ELISA, sângele este extras de la pacient pe stomacul gol. În continuare, se obține ser din sânge, care este utilizat direct pentru analiză. În plus, ELISA poate fi efectuată pe lichidul cefalorahidian (LCR), mucusul canalului cervical (colul uterin), lichid amnioticși chiar lichid vitros (globul ocular).

Înainte de a dona sânge, pacientul este avertizat că nu trebuie să ia medicamente, iar tratamentul cu antibiotice și medicamente antivirale se recomandă să fie finalizat cu cel puțin două săptămâni înainte de prelevarea de sânge.

Termenele limită pentru primirea și decodarea rezultatelor

Timpul necesar pentru a primi un răspuns de la laborator nu depinde de viteza de lucru, ci de stadiul în care se află boala și ce anticorpi au apărut deja în sânge. Deci, de exemplu: imunoglobulinele M apar la aproximativ 2 săptămâni de la prelevarea sângelui pentru analiză și înseamnă că procesul este în stadiul infecției primare sau a avut loc o exacerbare a infecției cronice. În același timp, în timpul infecției primare apar anticorpi din clasele M și G. Mai mult, acesta din urmă poate fi detectat după 4 săptămâni.

IgA apare după 2-3 săptămâni, fie singură, fie împreună cu M, indicând o infecție acută, fie împreună cu G, indicând un proces cronic.

Perioade atât de diferite pentru apariția anticorpilor în sânge vor forța pacientul să aștepte mult timp pentru rezultat. Este acceptabil să așteptați mai mult de o lună după efectuarea testului ELISA. Descifrarea și interpretarea de către un medic necesită, de asemenea, o anumită perioadă de timp.

Samoilikov Pavel Vladimirovici stagiar al Departamentului de clinică diagnostic de laborator»

Universitatea Medicală de Stat din Rusia

Metodele de imunotestare sunt utilizate pe scară largă în practică medicală. În toate domeniile medicinei moderne, imunotestele sunt utilizate, în principal în scopuri de diagnostic și analitice. Este deosebit de important ca acestea să permită identificarea componentelor biologice (hormoni, enzime, neuropeptide, produse ale sistemului imunitar, antigene etc.) în concentrații scăzute și foarte scăzute. Toate produsele împotriva cărora se pot obține anticorpi sunt detectate prin aceste metode.

Imunotestul se bazează pe interacțiunea dintre un antigen (AG) și un anticorp (AT) folosind diferite opțiuni pentru marcarea uneia dintre componente (enzimă, radionuclid, colorant fluorescent etc.). Reacția este evaluată automat folosind echipamente speciale, ceea ce face posibilă standardizarea acestor metode.

În funcție de tipul de etichetă utilizat și de condițiile testului, imunotestul este desemnat ca test imunosorbent legat de enzime (ELISA), radioimunotest (RIA), imunofluorescent și altele. Când reacțiile sunt etape în una sau mai multe etape, ele sunt desemnate ca directe sau indirecte. Mediul în care se desfășoară reacția contează. Dacă reacția este efectuată cu reactivi fixați pe suprafață, atunci testul este desemnat ca fază solidă, de exemplu ELISA (testul imunosorbent legat de enzime).

În această lucrare, va fi luată în considerare doar imunotestul enzimatic - o metodă utilizată pe scară largă în biologie și medicină, atât practică, cât și fundamentală.

ELISA a apărut la mijlocul anilor '60 și a fost dezvoltat inițial ca metodă de identificare a antigenului într-un eșantion histologic, precum și pentru vizualizarea liniilor de precipitare în testele de imunodifuzie și imunoelectroforeză, iar apoi a început să fie utilizat pentru determinarea cantitativă a antigenelor și anticorpilor în fluide biologice. La dezvoltarea metodei au luat parte E. Engvall și R. Pählman, precum și, în mod independent, W. Van Weeman și R. Schurs.

Figura 1. Principiul de bază al ELISA.

1) Pentru a identifica antigenele. 2) Pentru a detecta anticorpi.

Metoda se bazează pe legarea specifică a unui anticorp la un antigen, cu unul dintre componente conjugat la o enzimă; ca rezultat al reacției cu substratul cromogen corespunzător, se formează un produs colorat, a cărui cantitate poate fi determinată. spectrofotometric (Fig. 1).

Descoperirea posibilității de a imobiliza antigenul și anticorpul pe diferiți purtători, menținând în același timp activitatea lor de legare, a făcut posibilă extinderea utilizării ELISA în diferite domenii ale biologiei și medicinei.

Apariția anticorpilor monoclonali a contribuit la dezvoltarea ulterioară a ELISA, ceea ce a făcut posibilă creșterea sensibilității, specificității și reproductibilității rezultatelor.

Teoretic, ELISA se bazează pe date din imunochimia modernă și enzimologia chimică, cunoașterea legilor fizico-chimice ale reacției antigen-anticorp, precum și pe principiile principale ale chimiei analitice. Sensibilitatea ELISA și timpul necesar sunt determinate de mai mulți factori principali: caracteristicile cinetice și termodinamice ale reacției antigen-anticorp, raportul de reactivi, activitatea enzimei și rezoluția metodelor sale de detectare. ÎN vedere generala Reacția antigen-anticorp poate fi descrisă printr-o schemă simplă:

+[AG]↔[ATAG]

Varietatea obiectelor de cercetare, de la compuși cu molecule scăzute până la viruși și bacterii, precum și o gamă neobișnuit de largă de sarcini asociate cu varietatea de condiții pentru utilizarea ELISA, determină dezvoltarea unui cantitate mare variante ale acestei metode.

Orice versiune de ELISA conține 3 etape obligatorii:

1. stadiul recunoașterii compusului de testat de către un anticorp specific acestuia, care duce la formarea unui complex imun;

2. etapa de formare a legăturii conjugatului cu complexul imun sau cu situsuri de legare libere;

3. etapa de conversie a etichetei enzimatice într-un semnal înregistrat.

Clasificarea metodelor ELISA se bazează pe mai multe abordări:

1. Pe baza tipului de reactivi prezenți în prima etapă a ELISA, se disting metodele competitive și necompetitive.

A) Într-un ELISA competitiv, în prima etapă, sistemul conține atât compusul analizat, cât și analogul său, marcat cu o enzimă și concurând cu aceasta pentru situsuri de legare specifice.

B) Metodele necompetitive se caracterizează prin prezența în sistem la prima etapă a doar compusului analizat și a centrilor de legare specifici acestuia.

2. Toate metodele ELISA sunt împărțite în omogene și eterogene.

Dacă toate cele trei etape ale ELISA au loc în soluție și între etapele principale nu există etape suplimentare pentru separarea complexelor imune formate de componentele nereacționate, metoda aparține grupului celor omogene.

Baza ELISA omogenă, utilizată, de regulă, pentru determinarea substanțelor cu molecul scăzut, este inhibarea activității enzimei atunci când se combină cu un antigen sau anticorp. Activitatea enzimatică este restabilită ca rezultat al reacției antigen-anticorp.

Când un anticorp se leagă la un antigen care conține o etichetă enzimatică, activitatea enzimatică este inhibată cu 95% în raport cu substratul cu greutate moleculară mare, ceea ce se datorează excluderii sterice a substratului din centrul activ al enzimei. Pe măsură ce concentrația de antigen crește, se leagă mai mulți anticorpi și rămân mai mulți conjugați antigen-enzimă liberi, capabili să hidrolice substratul cu greutate moleculară mare. Analiza se efectuează foarte rapid, o determinare necesită 1 minut. Sensibilitatea metodei este destul de mare. Poate fi folosit pentru a determina o substanță la nivel de picomol.

Metodele eterogene se caracterizează prin analiza într-un sistem în două faze cu participarea unei faze de purtător solid și o etapă obligatorie de separare a complexelor imune de componentele nereacționate (spălare), care se află în faze diferite (complecșii imuni formați sunt pe faza solidă și complecșii nereacționați sunt în soluție). Metodele eterogene în care formarea complexelor imune în prima etapă are loc pe faza solidă se numesc metode în fază solidă.

Metodele sunt clasificate ca omogen-eterogene dacă etapa 1 - formarea de complexe specifice are loc în soluție, iar apoi se folosește o fază solidă cu un reactiv imobilizat pentru a separa componentele.

3. Conform principiului determinării substanței de testat:

A) Definiție directă concentrația unei substanțe (antigen sau anticorp) în funcție de numărul de centri de legare care interacționează cu aceasta. În acest caz, eticheta enzimatică va fi localizată în complexul specific AG-AT format. Concentrația analitului va fi direct proporțională cu semnalul înregistrat.

B) Determinarea concentrației unei substanțe prin diferența dintre numărul total de situsuri de legare și locurile de legare libere rămase. În acest caz, concentrația analitului va crește, iar semnalul înregistrat va scădea; prin urmare, în acest caz există o dependență inversă de mărimea semnalului înregistrat.

Enzime.

Etichetele enzimatice au un efect catalitic extrem de puternic; cu o moleculă de enzimă poate reacționa o cantitate mare moleculele substratului. Astfel, o enzimă prezentă în cantități mici poate fi identificată și cuantificată prin formarea produselor și reacția pe care o catalizează. Un alt avantaj al utilizării enzimelor ca marcaje se datorează prezenței în moleculă a numeroase grupări funcționale (residuuri sulfhidril, carboxil, tirazină etc.), prin care moleculele de ligand pot fi atașate covalent.

Markerii enzimatici utilizați în ELISA trebuie să aibă următoarele proprietăți:

– activitate ridicată și stabilitate a enzimei în condiții analitice, atunci când este modificată și în conjugare cu anticorpi sau alte proteine;

– prezența substraturilor sensibile și simplitatea metodei de determinare a produselor sau substraturilor reacției enzimatice;

– capacitatea de a adapta sistemele de substrat la consolidarea ulterioară;

– absența enzimei și a inhibitorilor săi în fluidul biologic studiat.

Cel puțin 15 enzime diferite pot fi utilizate în ELISA. Cele mai multe aplicații, în conformitate cu cerințele de mai sus, am găsit peroxidază de hrean (HRP), fosfatază alcalină (ALP) și β-D-galactozidază (Tabelul 1). Toate trei sunt stabile și catalizează reacții extrem de sensibile. În plus, produsele rezultate din reacțiile catalizate de aceste enzime, în funcție de substratul utilizat, pot fi detectate nu numai prin metode colorimetrice, ci și prin metode fluorescente. Alte enzime sunt folosite mult mai rar. Acest lucru se explică prin activitatea lor specifică mai mică în comparație cu PC și AP.

Substraturi.

Alegerea substratului este determinată în primul rând de enzima utilizată ca etichetă, deoarece reacția enzimă-substrat este foarte specifică.

Cerințe de bază pentru substrat:

– asigurarea unei sensibilități ridicate a metodei în depistarea enzimei din conjugat;

– formarea de produși de reacție enzimă-substrat bine recunoscuți (de exemplu, colorați);

– substratul trebuie să fie sigur, ieftin, accesibil și convenabil de utilizat.

Tabelul 1.

Enzimele și substraturile lor sunt cele mai utilizate pe scară largă în ELISA.

Mai des, se folosesc substraturi cromogene care, atunci când sunt distruse, formează o substanță colorată. Utilizarea substraturilor de înaltă energie – fluorescente, chemiluminiscente – este promițătoare. Utilizarea unor astfel de substraturi face posibilă creșterea teoretică a sensibilității ELISA cu două ordine de mărime.

Antigeni și anticorpi.

AG și AT utilizate în ELISA trebuie să fie foarte purificate și foarte active. În plus, antigenele trebuie să aibă antigenicitate ridicată, densitate optimă și număr de determinanți antigenici, străinătate și omogenitate. Mulți antigeni sintetici și recombinanți ai virusurilor și bacteriilor s-au dovedit bine atunci când sunt utilizați în ELISA. Acest lucru a crescut semnificativ specificitatea și reproductibilitatea metodei prin reducerea la minimum a reacțiilor încrucișate.

Unul dintre cei mai importanți reactivi în ELISA sunt anticorpii. Sensibilitatea ELISA depinde de concentrația, activitatea și specificitatea anticorpilor utilizați. Anticorpii utilizați pot fi poli- sau monoclonali, de diferite clase (IgG sau IgM) și subclase (IgGl, IgG2), anti-alotipii sau anti-idiotipici. La afinitatea AT scăzută, defalcarea complexului AG-AT duce la eliminarea AG legat din sistem. Sensibilitatea și specificitatea metodei crește atunci când se utilizează anticorpi monoclonali. În acest caz, devine posibil să se detecteze concentrații scăzute de AG (AT) în probele de testat.

Formarea conjugatului

Un conjugat este un antigen sau anticorp marcat cu o etichetă enzimatică. Formarea unui conjugat este una dintre etape importante efectuarea ELISA.

La formarea unui conjugat, metoda optimă de introducere a unei etichete enzimatice este selectată astfel încât ambele componente ale conjugatului să-și păstreze activitatea biologică: enzima - capacitatea de a interacționa cu substratul și antigenul sau anticorpul - antigenitatea și activitatea de legare a antigenului. , respectiv. Prezența unui antigen marcat, înalt purificat permite utilizarea metodelor competitive. În acest caz, în etapa finală este posibilă măsurarea activității conjugatului care nu este asociat cu anticorpii imobilizați, ceea ce evită procedura de spălare și face analiza mai convenabilă. Cu toate acestea, antigenele sunt diverse în ceea ce privește proprietati fizice si chimiceși structura, ceea ce înseamnă că este imposibil să se dezvolte metode universale pentru obținerea unui conjugat cu un antigen. În acest caz, obținerea unui conjugat antigen-enzimă este o sarcină complexă separată. Prepararea anticorpilor marcați pentru ELISA este metodic mai accesibilă.

Conjugarea enzimei cu proteine ​​active imunochimic se realizează prin diferite metode: reticulare chimică, legarea covalentă a moleculei de enzimă la Ag sau AT și formarea de compuși prin legături necovalente, de exemplu, atunci când conexiunea dintre enzimă şi Ag sau AT este efectuată imunologic, prin interacţiunea antigen-anticorp.

Cele mai utilizate sunt metodele covalente de preparare a conjugatelor. Alegerea reacției de legare este determinată de tipul de grupări funcționale disponibile în moleculele de proteine ​​date. Glutaraldehida, periodatul de sodiu etc. sunt utilizate ca reactivi utilizați pentru a introduce enzima în moleculele de antigen și anticorp.

Există metode într-o etapă și în două etape pentru obținerea conjugatelor folosind glutaraldehidă. Se pot forma conjugate de diferite dimensiuni cu activitate enzimatică redusă (15 - 60% din enzima liberă). Conjugatul rezultat dimensiuni mari poate împiedica steric determinarea substanței de testat. Conjugatele cu o greutate moleculară relativ mică constau dintr-un fragment Fab și o moleculă de enzimă.

Ca rezultat al sintezei în două etape, care constă în producerea pas cu pas a unei enzime modificată mai întâi cu un agent de reticulare, izolarea acesteia și apoi interacțiunea ulterioară cu un antigen (anticorp), moleculele unui se formează o compoziție omogenă, care conține 1-2 molecule de enzime per moleculă de imunoglobulină și menținând o activitate enzimatică și imunologică ridicată. Cu toate acestea, numărul de astfel de conjugați formați este mic (pentru peroxidaza de hrean este de 5-10%).

Cel mai grozav uz practic a găsit o metodă de producere a conjugatelor de imunoperoxidază bazată pe oxidarea componentei glucide a enzimei cu periodat de sodiu (legarea peroxidazei în conjugat atinge 70-90% din cantitatea inițială de enzimă).

Un conjugat de încredere trebuie să aibă următoarele proprietăți:

Rezistență ridicată a anticorpilor și afinitate mare pentru antigen, astfel încât acesta să poată fi utilizat în diluție mare și astfel să reducă legarea nespecifică;

Specificitate suficientă în diluția de lucru;

Predominanţa formelor monomerice asupra celor polimerice, deoarece formele polimerice tind să adere nespecific la plastic, rezultând un nivel de fond ridicat de reacție;

Raportul molar optim între enzimă și anticorpi (raportul optim este de aproximativ 1:1);

Activitate enzimatică suficientă a conjugatului. Această proprietate este determinată în principal de condițiile de conjugare și de raportul dintre moleculele de enzimă și anticorpii din conjugat.

fază solidă

Ca fază solidă pentru ELISA pot fi utilizate diferite materiale: polistiren, clorură de polivinil, polipropilenă și alte substanțe. Faza solidă poate fi pereții unei eprubete, 96 de godeuri și alte plăci, bile, margele, precum și nitroceluloză și alte membrane care absorb activ proteinele.

Imobilizarea antigenului sau a anticorpilor pe faza solidă este posibilă în trei moduri:

– adsorbție pasivă, bazată pe interacțiuni hidrofobe puternice între proteine ​​și suprafața sintetică;

– atașarea covalentă la faza solidă;

– imunochimice etc. (adăugare non-covalentă și fără adsorbție).

Adsorbția pasivă de proteine ​​este utilizată pe scară largă atunci când se efectuează ELISA pe plăci de titrare și membrane de nitroceluloză. Adsorbția pasivă urmează principiul saturației și se corelează cu greutatea moleculară a substanței adsorbite. Suprafața de adsorbție a membranelor tipuri variate(nitroceluloză, nailon etc.) este de 100-1000 de ori mai mare decât cea a plasticului.

Polizaharidele și proteinele puternic glicozilate au adesea afinitate scăzută pentru polistiren. Sunt necesare alte metode pentru a le imobiliza, cum ar fi atașarea covalentă folosind glutaraldehidă. Atașarea covalentă este eficientă atunci când sferele hidrofile (agaroză) și sferele de polistiren sunt utilizate ca fază solidă.

Metodele imunochimice se bazează pe utilizarea anticorpilor „capcană” pre-adsorbiți pentru a imobiliza antigenul sau anticorpii. Un antigen imobilizat imunochimic este de 10 ori mai activ decât un antigen adsorbit pasiv. Se pot folosi lectine sau proteine ​​care leagă imunoglobulinele din bacterii care se adsorb ușor pe plastic sau pe alte suprafețe hidrofobe, cum ar fi concanavalina A (Con A) sau proteina stafilococică A. Con A este capabilă să imobilizeze gp 120, o proteină a virusului HIV.

Locurile libere de pe suprafața fazei solide care nu sunt legate de agentul sorbit pot fixa alte molecule, inclusiv conjugate, în timpul testului, ceea ce duce la o creștere a semnalului de fundal. Pentru a preveni legarea nespecifică, după imobilizare, faza solidă a materialului de bază este tratată cu substanțe care sunt neutre pentru test. Cei mai populari agenți de blocare sunt albumina serică bovină (BSA), cazeina etc. Alegerea agentului de blocare și condițiile pentru această etapă depind de tipul de fază solidă și de sensibilitatea sistemului.

În prezent, se utilizează un număr mare de varietăți și modificări ale ELISA. Diverse variante ale testului imunosorbent legat de enzime (ELISA) au devenit larg răspândite.

ELISA în fază solidă a fost propus în 1971. Principiile de bază ale ELISA în fază solidă, indiferent de modificare, sunt următoarele:

1. În etapa 1 a reacției, antigenii sau anticorpii sunt adsorbiți pe faza solidă. În acest caz, reactivii care nu sunt legați de faza solidă sunt îndepărtați ușor prin spălare.

2. Proba de testat este incubată în godeurile sensibilizate. Godeurile de control pozitiv conțin reactivi standard. În acest caz, pe suprafața fazei solide se formează complexe imune. Componentele nelegate sunt îndepărtate prin spălare.

3. Când un conjugat anticorp-enzimă sau antigen-enzimă este adăugat și legat de complexul imun imobilizat, locul activ al enzimei rămâne disponibil pentru interacțiunea ulterioară cu substratul. Incubarea substratului în godeuri cu conjugatul imobilizat duce la dezvoltarea unei reacții de culoare. Această reacție poate fi oprită în stadiul dorit, severitatea colorării poate fi evaluată vizual sau prin densitate optică.

O etapă importantă a oricărei variante de analiză în fază solidă este procedura de spălare din reactivii nelegați. Este important nu doar să clătiți componentele fixate în faza solidă, ci să îndepărtați reactivii de pe toată adâncimea stratului. Acestea sunt etapele de analiză care necesită cel mai mult timp și mai multă muncă. Probele pot fi spălate automat folosind un dispozitiv special - o mașină de spălat sau manual folosind o pipetă multicanal. Pentru a efectua ELISA aveți nevoie de:

– tabletă din polistiren sau alte opțiuni în fază solidă utilizate;

– solutie de spalare;

– conjugat (antigeni sau anticorpi marcați cu enzime);

– amestec de substraturi utilizate;

– soluție de oprire (Stop reagent – ​​​​soluție pentru oprirea reacției);

– probe utilizate pentru control pozitiv și/sau negativ;

– antigen standard (pentru construirea unei curbe de calibrare);

– pipete monocanal și multicanal;

– mașină de spălat (șaibă);

– un dispozitiv optic pentru determinarea densității optice a soluției de testat (cititor ELISA, cititor care fotometrează secvenţial toate godeurile);

– 5-100 µl din materialul biologic studiat.

ELISA directă

1. Antigenii sau anticorpii (materialul de testat) sunt adsorbiți în godeurile panourilor. S-a remarcat mai sus că antigenele diferă semnificativ în capacitatea lor de a fi adsorbite pe diferite tipuri de plastic, în funcție de ce clasă de substanțe (proteine, carbohidrați sau lipoproteine) aparțin. Adesea, în ELISA directă, antigenul imobilizat pe faza solidă este celulele și alți antigeni corpusculari.

Control. Ca martor, godeurile sunt utilizate cu o probă de control pozitiv adsorbită, care conține în mod necesar antigenul dorit și o probă de control negativ, care în mod evident nu conține antigenul studiat. Dacă este disponibil un antigen standard purificat, reacția este efectuată în mai multe diluții, astfel încât să se poată construi o curbă de calibrare.

2. „Blocați locurile de legare libere care rămân pe faza solidă folosind cazeina BSA și altele (pentru a preveni sorbția nespecifică a conjugatului pe faza solidă).

3. Anticorpii sau antigenii marcați cu enzime (conjugați) sunt adăugați în godeuri și incubați. Legarea conjugatului de faza solidă va avea loc numai dacă ambele componente ale sistemului sunt complementare. După incubarea cu conjugatul, godeurile sunt spălate, îndepărtându-se astfel porţiunea nelegată a conjugatului.

4. Substratul specific pentru enzima utilizată este apoi adăugat în godeuri și incubat. Odată ce nivelul optim de colorare este atins în godeurile de control pozitiv, reacția enzimatică este oprită.

5. Contabilizarea reacției. În primul rând, rezultatele reacției sunt luate în considerare vizual. Pentru o înregistrare mai precisă a rezultatelor, intensitatea colorării este evaluată folosind un cititor ELISA cu un filtru de lumină adecvat. Pe baza rezultatelor analizei, se construiește un grafic al dependenței densității optice de concentrație (Fig. 2).

Figura 2. ELISA directă.

a) să identifice antigenul; b) pentru a detecta anticorpi.

Această versiune de ELISA este de obicei utilizată pentru a detecta anticorpi specifici. Un antigen standard este adsorbit în godeurile panourilor și incubat cu probe de ser sau alt material biologic obținut de la pacient (lichidul cefalorahidian, saliva etc.). Anticorpii specifici legați de antigen pe faza solidă sunt detectați folosind un conjugat antiglobulină. În funcție de scopul analizei, se folosesc diferiți reactivi antiglobuline, care detectează anticorpi de toate izotipurile, sau specifici claselor și subclaselor individuale de imunoglobuline. Principalul avantaj al metodei este versatilitatea conjugatului. Același conjugat poate fi utilizat pentru a detecta anticorpi umani la o mare varietate de antigeni din orice probă. Reacția este simplă metodologic.

Principalele etape ale ELISA indirecte pentru determinarea anticorpilor:

1. Antigenul este adsorbit pe faza solidă, apoi spălat pentru a îndepărta componentele nelegate.

2. Blocați site-urile de legare gratuite. Spălat.

3. Materialul de testat este adăugat în godeuri, incubat și apoi se efectuează procedura de spălare. În paralel, sunt plasate probe cu martori pozitivi și negativi.

4. Adăugați conjugatul de antiglobulină în diluția de lucru, incubați și spălați componentele nelegate.

5. Substratul este adăugat și incubat. Odată ce nivelul optim de colorare este atins în godeurile de control pozitiv, reacția este oprită prin adăugarea de soluție de oprire.

6. Măsurați cantitatea de produs de reacție folosind un cititor ELISA (Fig. 3).

În condiții optime de analiză, metoda este foarte specifică și sensibilă. Face posibilă detectarea cantităților de nanograme de anticorpi în serurile pacienților studiați. Pentru a obține rezultate satisfăcătoare este necesară standardizarea reactivilor și a tehnicilor metodologice. Această versiune a ELISA poate fi folosită și pentru a testa anticorpii monoclonali.

Antigenele detectate utilizând această variantă ELISA trebuie să aibă epitopi multipli capabili să lege anticorpi sau să aibă epitopi repetați, separați spațial, de aceeași specificitate.

Când se efectuează această versiune de ELISA, anticorpii poli- sau monoclonali foarte specifici adsorbiți pe faza solidă sunt incubați cu proba de testat. După procedura de spălare, anticorpii marcați cu enzimă (conjugați) la același antigen sunt adăugați în godeuri și apoi sunt efectuate toate celelalte etape ale reacției. Eficiența formării unui complex specific în fiecare etapă a analizei depinde de constanta de legare a reacției antigen-anticorp.

Etapele principale ale analizei:

1. Anticorpii monoclonali sau anticorpii policlonali purificați prin afinitate sunt imobilizați pe faza solidă.

2. Proba de testat este adăugată în godeurile panourilor, iar o probă de control pozitivă și o probă de control negativ în diferite diluții sunt plasate în paralel. Se incubează și se spală.

3. În godeuri se adaugă anticorpi monoclonali sau policlonali marcați cu enzime – conjugați. După incubare, se efectuează spălarea.

4. Substratul este adăugat și incubat. Reacția este oprită atunci când se obține o colorare optimă în godeurile de control pozitiv.

5. Înregistrarea rezultatelor pe cititorul ELISA.

Principalul avantaj al metodei este sensibilitatea sa ridicată, care depășește capacitățile altor scheme ELISA (Fig. 4).

Figura 3. ELISA indirectă pentru detectarea anticorpilor.

Acest test se bazează pe competiția dintre anticorpi marcați (conjugați) și nemarcați (test) pentru legarea la un antigen adsorbit pe faza solidă. Cantitatea de enzimă atașată la faza solidă va scădea proporțional cu conținutul de anticorpi liberi din amestec. Pentru a determina un antigen, se folosește aceeași opțiune, dar în acest caz antigenul dorit concurează cu un antigen standard marcat pentru legarea la anticorpii imobilizați pe suprafața fazei solide.

Metoda competitivă necesită un număr minim de operații, un consum redus de reactivi și poate fi ușor automatizată. Când se efectuează un ELISA competitiv pentru detectarea anticorpilor, este mai bine să se utilizeze anticorpi monoclonali marcați, apoi conjugatul concurează cu proba de testat pentru un singur epitop al antigenului adsorbit pe faza solidă. Această versiune de ELISA este utilizată pentru a determina diferiți compuși, cum ar fi imunoglobuline umane, antigen carcinoembrionar, insulină etc. Permite detectarea anticorpilor la epitopii semnificativi din punct de vedere diagnostic ai agenților infecțioși.

Principalele etape ale analizei pentru identificarea antigenului (Fig. 5):

1. Anticorpii monoclonali specifici pentru antigenul detectat sunt imobilizați pe faza solidă.

2. Un antigen marcat cu o enzimă și proba de testat sunt adăugate în godeurile panourilor într-o concentrație cunoscută. Se efectuează incubarea și spălarea. În paralel, controalele pozitive și negative sunt plasate în puțurile adiacente. Pentru a construi o calibrare, este utilizat un antigen standard nemarcat în diferite diluții.

3. Adăugați substrat, incubați, opriți reacția atunci când se dezvoltă o colorare optimă în godeurile de control pozitiv.

4. Contabilizarea reacției pe cititorul ELISA.

În acest caz, cantitatea de antigen din proba de testat este invers proporțională cu activitatea enzimatică asupra fazei solide.

În această versiune de ELISA, antigenul prezent în proba de testat se leagă de anticorpi monoclonali marcați cu enzimă și inhibă interacțiunea acestora cu antigenul standard imobilizat pe faza solidă. Prezența chiar și a unor urme de antigen specific conjugat într-o probă va inhiba legarea anticorpilor marcați la antigenul imobilizat. Gradul de inhibiție este direct proporțional cu conținutul de antigen din soluție. Pentru analiza cantitativă, se construiește o curbă de calibrare folosind diluții în serie ale antigenului standard. Principalele etape ale ELISA inhibitor pentru detectarea antigenului (Fig. 6).

1. Antigenul standard este adsorbit în godeurile panourilor. Diluția de lucru a anticorpilor marcați este selectată prin titrare.

Figura 4. Versiunea „sandwich” a ELISA.

2. Preincubarea conjugatului se realizează într-o diluție anterioară celei de lucru, cu diluții ale probei de testat, antigenului standard și probelor martor pozitiv.

3. Amestecul este transferat în godeurile panourilor. Pentru a controla legarea 100%, în mai multe godeuri sunt adăugați numai anticorpi marcați, fără antigenul inhibitor. Panourile sunt incubate și apoi spălate.

4. Adăugați substrat.

5. Înregistrați rezultatele.

Concentrația antigenului care se determină în proba de testat este invers proporțională cu activitatea enzimatică asupra fazei solide.

ELISA poate fi utilizat nu numai pentru a determina antigenul sau anticorpul solubil, ci și celulele care produc diferite proteine.

În 1983, tehnologia ELISA a fost adaptată pentru a detecta celulele limfoide care secretă anticorpi sau antigene (de exemplu, citokine) in vitro. Metoda se numește ELISPOT (metoda spotului imunospot legat de enzime). Principiul de bază al metodei:

1. Pe suprafața unui godeu de polistiren (pentru cultura celulară se folosesc panouri cu 24 de godeuri), sunt absorbiți antigeni sau anticorpi, care servesc drept reactivi „capcană”.

2. Celulele limfoide care urmează a fi studiate sunt adăugate și cultivate timp de câteva ore la 37°C, oferindu-le posibilitatea de a ocupa un anumit loc și de a efectua funcția secretorie. Anticorpii sau antigenii secretați de astfel de celule sunt captați de reactivi adsorbiți pe faza solidă.

3. Celulele sunt îndepărtate folosind o soluție de spălare cu un detergent care lizează celulele.

4. Zonele de acumulare a produșilor secretori sunt relevate prin adăugarea de anticorpi legați de enzime (reactiv antiglobulină).

5. Se adaugă un amestec de substrat și agaroză (substraturile folosite trebuie să se dizolve în agaroză și să formeze produse de reacție insolubile), pe suprafața fazei solide se formează pete maronii sau albastre (în funcție de enzimele și substraturile folosite), dezvăluind zone în care celulele au fost localizate.

Petele rezultate sunt numărate la microscop, acesta va fi numărul de celule secretoare.

O membrană de nitroceluloză poate fi utilizată ca fază solidă.În acest caz, există o serie de avantaje: datorită capacității mari de adsorbție a NCM, este necesară o cantitate semnificativ mai mică de antigen, folosit ca reactiv „capcană”; , nu este necesară includerea agarozei în substrat.

Prin determinarea simultană a numărului de celule secretoare și a cantității totale de antigen sau anticorp secretat în godeu, ceea ce este posibil atunci când se utilizează un substrat diferit, este posibil să se determine cantitatea de substanță secretată de către o singură celulă.

Această metodă este utilizată pe scară largă pentru a estima numărul de celule care secretă antigen capturat de anticorpii adsorbiți; este utilizată pentru a determina numărul de celule care secretă citokine (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IFN-γ, TNF-a).

Atunci când se folosesc anticorpi cu afinitate mare, sensibilitatea variantelor individuale de ELISA este foarte mare și teoretic permite detectarea moleculelor de un singur antigen, dar în practică sensibilitatea este limitată de o serie de factori: activitatea enzimatică, intensitatea semnalului și metodele de înregistrare a semnalului. Sistemele de amplificare a semnalului fac posibilă creșterea sensibilității diferitelor opțiuni ELISA. Să ne uităm la câteva dintre aceste sisteme:

Pe baza interacțiunii avidină-biotină.

Moleculele de coenzimă de biotină (mw 244 Da) sunt conjugate cu anticorpi folosind biotinil-N-hidroxisuccimidă. O moleculă mică de biotină este mai ușor de atașat la imunoglobulină sau la altă proteină fără a-i perturba proprietățile imune sau enzimatice. În acest caz, enzima este asociată cu glicoproteina albușului de ou avidina. Afinitatea de legare a avidinei la biotină este foarte mare (constanta de disociere a complexului este de 10-15 mol), conjugatul avidină-enzimă este fixat ferm de complexul antigen-anticorp-biotină. După adăugarea substratului corespunzător, produsul de reacție este determinat spectrofotometric sau prin intensitatea luminiscenței.

O moleculă de avidină constă din patru subunități identice și este capabilă să interacționeze cu patru molecule de biotină, ceea ce îi permite să fie utilizată ca moleculă de legătură între doi compuși care conțin biotină. În acest caz, enzima este, de asemenea, biotinilată, iar avidina acționează ca o punte, conectând două molecule care conțin reziduuri de biotină. Avidina liberă și apoi o enzimă biotinilată sunt adăugate la complexul antigen-anticorp-biotină rezultat. Se ia in considerare reactia.

Proteina avidină poate fi adsorbită nespecific pe alte molecule, astfel încât o altă proteină care leagă biotina, streptavidina, găsită în bacteriile Streptomyces avidinii, este din ce în ce mai utilizată. Streptavidina formează, de asemenea, un complex puternic cu biotina și constă din patru subunități identice.

Utilizarea unui complex avidină-biotină poate crește semnificativ sensibilitatea ELISA, deoarece la sintetizarea unui conjugat cu o moleculă AT, pot fi legate zeci de molecule de biotină. Obținerea conjugaților (anticorpi și enzime cu biotină) este destul de ușoară și este însoțită de modificări minime activitatea lor imunologică și enzimatică. Conjugații enzimatici cu biotină pot fi utilizați ca reactivi universali.

Utilizarea reacțiilor chemiluminiscente.

Reacțiile chemiluminiscente pot fi utilizate pentru a obține un semnal în ELISA, care crește sensibilitatea metodei și reduce timpul de analiză. Peroxidaza de hrean este utilizată pe scară largă ca etichetă în ELISA; diferite reacții chemiluminiscente pot fi utilizate pentru a o detecta. Reacțiile chemiluminiscente se bazează pe capacitatea luminolului de a străluci atunci când este oxidat cu peroxid de hidrogen. În analiza directă, o reacție enzimatică produce peroxid de hidrogen și oxidează luminol; această reacție este catalizată de peroxidaza de hrean. Pentru a spori semnalul, se folosesc diverși compuși, de exemplu, luciferină, fenoli, în acest caz intensitatea luminiscenței este mărită de 10-100 de ori, în unele cazuri de 500 de ori (analiza chemiluminiscentă îmbunătățită). Semnalul luminiscent este foarte stabil, nivelul său atinge un maxim în 30 s (pentru comparație: reacția de culoare cu OFD ca indicator se dezvoltă complet doar în 30 min).

La analiza indirectă Anticorpul este marcat cu luminol sau derivații săi. O astfel de etichetă în stare liberă poate fi oxidată de peroxid de hidrogen, eliberând lumină. Dacă a format un complex, își pierde capacitatea de a se oxida.

Bazat pe sisteme în cascadă.

Sistemele în cascadă de enzime pot fi utilizate pentru a crește sensibilitatea ELISA. În acest caz, prima enzimă legată de anticorp produce un substrat reducabil pentru cel de-al doilea sistem enzimatic. Al doilea sistem enzimatic poate fi substrat-ciclic sau redoxiciclic. În acest caz, fosfo-glucoizomeraza, aldolaza și fosfataza alcalină pot servi ca etichete enzimatice. Produsul final de reacție este determinat vizual sau spectrofotometric.

Sistemele de amplificare ELISA pot atinge sensibilitate ridicată. Astfel de sisteme ELISA sunt utilizate pentru determinarea nivelului de hormoni (tiroidi-stimulatori, progesteron etc.).

ELISA și-a găsit o aplicație largă în diverse domenii ale medicinei și biologiei datorită simplității relative și sensibilității ridicate a metodei. ELISA a fost utilizat cu succes pentru:

Diagnosticarea în masă a bolilor infecțioase (detecția diferitelor antigene sau anticorpi specifici la acestea);

Detectarea și determinarea nivelului de hormoni și medicamente din probele biologice;

Determinarea izotipurilor (IgG, IgM și altele) ale anticorpilor împotriva unui antigen specific;

Identificarea complexelor imune;

Identificarea markerilor tumorali;

Determinarea proteinelor serice (feritină, fibronectină etc.);

Determinarea anticorpilor IgE totale și IgE specifici;

Screening pentru anticorpi mioclonali;

Determinarea citokinelor în fluide biologice.

Sensibilitatea metodei

ELISA a înlocuit metodele de aglutinare, precipitare și RIA utilizate anterior pe scară largă în practica clinică. În comparație cu metodele de mai sus, ELISA necesită mai puțină muncă și consumă mai puțin timp și este convenabil pentru efectuarea unui număr mare de teste similare.

ELISA combină specificitatea unică a unei analize imunochimice cu sensibilitatea ridicată a determinării etichetei enzimatice. Sensibilitatea metodei (prin sensibilitate se înțelege cantitatea minimă detectabilă de anticorpi sau antigen) este determinată de următorii factori: afinitatea anticorpilor, este de preferat utilizarea anticorpilor monoclonali; activitate specifică a enzimei; intensitatea semnalului; sensibilitatea de măsurare a semnalului. Diverse opțiuni ELISA variază în ceea ce privește sensibilitatea lor. Anumite variante ale ELISA în fază solidă fac posibilă detectarea unor molecule individuale într-o probă. Sensibilitatea medie a ELISA este de 10-9 – 10-12 mol.

Galaktionov V.G. Imunologie. Editura Universității din Moscova, 1998

Kishkun A.A. Studii și metode imunologice de diagnosticare a bolilor infecțioase în practica clinică. Medical Agenția de informații, 2009

Kondratyeva I.A. Atelier de imunologie. Manual pentru universități. Academia, 2004

Lefkovits I., Pernis B. Metode de cercetare imunologică. Lumea, 1988

Royt A., Brostoff D., Meil ​​​​D. Imunologie. Lumea, 2000

Sokolov E.I. Imunologie clinică. Medicină, 1998

Frimel G. Metode imunologice. Medicină, 1987

Khaitov R. M. Imunologie. Medicină, 2000

Shigina Yu.V. Imunologie: manual. Editura RIOR, 2007

Yarilin A.A. Fundamentele imunologiei. Medicină, 1999

În legătură cu dezvoltarea tehnologiilor celulare, biologie moleculară, genetică, fizică, chimie și o serie de alte discipline de înaltă tehnologie în practica zilnică Sunt introduse noi metode de înaltă precizie și de înaltă tehnologie. Aceste tendințe interdisciplinare afectează atât domeniul cunoștințelor medicale, cât și domeniile conexe ale problemelor biologice și biochimice. În ultimii zece ani, o metodă de diagnostic de laborator clinic numită imunotest enzimatic a devenit larg răspândită și introdusă în practica de masă.

În general, tehnologiile de reacții enzimatice și radiologice imunologice au fost utilizate pe scară largă în tiparea celulelor, culturilor celulare și diferitelor țesuturi încă de la începutul anilor 80 ai secolului XX. Cu toate acestea, aceste metode au fost foarte laborioase, nu unificate, nestandardizate, ceea ce a împiedicat utilizarea lor în scopuri de diagnostic și tratament la scară de masă. Astfel de metode au fost folosite doar de laboratoare înguste, cu o mare intensitate de cunoștințe și foarte specializate.

Cu toate acestea, odată cu dezvoltarea tehnologiei, microtehnologiei și producerea diferitelor materiale biopolimerice, a devenit posibil să se producă truse de diagnostic imunosorbente legate de enzime gata făcute, care pot fi utilizate de laboratoarele instituțiilor medicale generale. ELISA este utilizat pe scară largă pentru a diagnostica toate tipurile de infecții (chlamydia, sifilis, citomegalovirus, toxoplasmoză, herpes etc.), atât acute, cât și cronice, precum și forme latente care apar fără simptome clinice.Această metodă este folosită și pentru controlul bolilor cronice. . Să încercăm să ne dăm seama ce fel de metodă este aceasta și ce principii stau la baza ei?

Componentele imunotestului enzimatic - reacție imună și reacție enzimatică

Imunotestul enzimatic, după cum sugerează și numele, constă din două componente diferite - o reacție imună și o reacție enzimatică. Reacția imună produce legarea de molecule biologice, elemente ale unei celule sau microorganism, pe care de fapt încearcă să le detecteze, iar reacția enzimatică vă permite să vedeți și să măsurați rezultatul reacției imunologice. Adică, reacția imună face parte dintr-o tehnică complexă care detectează efectiv microbul dorit. Și reacția enzimatică este acea parte a tehnicii complexe care vă permite să traduceți rezultatul reacției imune în formă vizibil pentru ochi, și accesibil pentru măsurare folosind tehnici chimice de rutină. Pe baza acestei structuri a metodei imunologice enzimatice, vom analiza ambele părți separat.

Reacția imună, ce este? Ce este un anticorp sau un antigen?

Ce este un răspuns imun? Ce este un antigen?
În primul rând, să ne uităm la ce sunt reacțiile imune. Reacții imune– acestea sunt reacții specifice de legare a unui antigen la un anticorp cu formarea unui complex imun. Ce înseamnă? Pe suprafața fiecărei celule a oricărui organism există structuri speciale numite antigene. Antigenele în general sunt molecule care transportă informații despre o celulă (similar cu informațiile de pe ecusonul unei persoane, care indică datele de bază ale acelei persoane).

Antigenele individuale și ale speciilor – ce sunt acestea? De ce sunt necesare aceste antigene?

Disponibil antigene individuale, adică inerent numai acestui organism particular. Acești antigeni individuali sunt diferiți pentru toți oamenii; există unii care sunt similari între ei, dar totuși diferiți. Nu există două copii identice ale antigenelor individuale în natură!

Al doilea tip principal de antigen este antigene ale speciilor, adică inerente oricărui tip specific de ființe vii. De exemplu, oamenii au propriul antigen de specie, comun tuturor oamenilor, șoarecii au propriul antigen de specie de șoarece etc. Pe suprafața fiecărei celule este în mod necesar prezent un antigen specific și individual.

Antigenul speciei este folosit de celulele sistemului imunitar pentru a recunoaște „prietenul sau dușmanul”.

Cum are loc recunoașterea antigenului?

Celula imunitară contactează celula suspectă și face o identificare pe baza antigenului individual. În memoria celulei imune, este „înregistrat” cum arată „antigenul său”. Astfel, dacă antigenul unei celule suspecte se potrivește cu descrierea „auto-antigen”, atunci această celulă proprie a corpului nu reprezintă un pericol. Apoi, celula imunitară „se dezleagă” și pleacă. Și dacă antigenul nu se potrivește cu descrierea „sinelui”, atunci celula imunitară identifică această celulă ca fiind „străină” și, prin urmare, potențial periculoasă pentru întregul organism. În acest caz, celula imunitară nu „se slăbește”, ci începe să se distrugă obiect periculos. Precizia unei astfel de recunoașteri imunologice este uimitoare - 99,97%. Practic nu există greșeli!

Ce este un anticorp, complex imun?
Ce este un anticorp?

Un anticorp este o moleculă specială situată pe suprafața unei celule imunitare. Este anticorpul care se leagă de antigenele celulei suspecte. Apoi, anticorpul transmite informații în interiorul celulei, unde are loc recunoașterea, și primește un semnal de întoarcere de două tipuri, „sine” sau „străin”. Când primește un semnal „auto”, anticorpul rupe legătura cu antigenul și eliberează celula.

Ce este un complex imunitar?
Când semnalul este „străin”, situația se desfășoară diferit. Anticorpul nu rupe legătura cu antigenul, ci, dimpotrivă, prin trimiterea de semnale specifice, provoacă „întărire”. Din punct de vedere biologic, aceasta înseamnă că alți anticorpi localizați într-o altă parte a celulei încep să se deplaseze către locul de unde vine semnalul de pericol și, de asemenea, formează o legătură între ei și antigenul capturat. În cele din urmă, antigenul se dovedește a fi înconjurat pe toate părțile și ferm atașat.Acest complex antigen + anticorp se numește complex imun. Din acest moment începe utilizarea antigenului. Dar acum nu ne interesează detaliile procesului de neutralizare a antigenului.

Tipuri de anticorpi (IgA, IgM, IgG, IgD, IgE)
Anticorpii sunt structuri proteice care, în consecință, au o denumire chimică, care este folosită ca sinonim pentru cuvântul anticorp. Asa de, anticorpi = imunoglobuline.

Există 5 tipuri de imunoglobuline (Ig), care se leagă de diferite tipuri de antigene în locuri diferite corpul uman(de exemplu, pe piele, pe mucoase, în sânge etc.). Adică, anticorpii au o diviziune a muncii. Aceste imunoglobuline sunt denumite prin litere alfabet latin– A, M, G, D, E și sunt desemnate după cum urmează – IgA, IgM, IgG, IgD, IgE.

În diagnostic, se utilizează un singur tip de anticorp, care este cel mai specific pentru microbul detectat. Adică, legarea acestui tip de anticorp la antigenul detectat are loc întotdeauna. Cele mai frecvent utilizate sunt IgG și IgM.

Acest principiu al reacției imune (se determină acuratețea și specificitatea unică a recunoașterii obiectului biologic) este cel care stă la baza imunotestului enzimatic Datorită preciziei ridicate a anticorpilor în recunoașterea antigenelor, acuratețea întregii metode de imunotest enzimatic este, de asemenea, cel mai inalt.

Reacție enzimatică

Care reacție este enzimatică? Ce sunt afinitatea, substratul și produsul unei reacții?
Să trecem la luarea în considerare a reacției enzimatice în activitatea metodei imunotestare enzimatică.

Ce este o reacție enzimatică?

O reacție enzimatică este reactie chimica, în care o substanță este transformată în alta prin acțiunea unei enzime. Substanța asupra căreia acționează enzima se numește substrat. Și substanța care se obține ca urmare a acțiunii unei enzime se numește produs de reacție. Mai mult, particularitatea reacției enzimatice este de așa natură încât o anumită enzimă acționează numai pe un anumit substrat. Această proprietate a unei enzime de a-și recunoaște substratul se numește afinitate.

Astfel, fiecare enzimă realizează o singură reacție specifică acesteia. Există o mulțime de enzime cunoscute în lumea biologică, precum și reacții enzimatice. În diagnosticul imunosorbent legat de enzime, sunt utilizate doar câteva reacții enzimatice - nu mai mult de 10. În același timp, au fost alese astfel de reacții enzimatice, al căror produs este substanțele colorate. De ce ar trebui colorați produsele unei reacții enzimatice? Deoarece pentru a calcula concentrația unei substanțe dintr-o soluție colorată, există o metodă chimică simplă - colorimetrie.

Metoda colorimetriei - esență și principiu

Colorimetrie folosește măsurarea densității de culoare a unei soluții, iar concentrația substanței este calculată din densitatea culorii.În acest caz, un dispozitiv special - un colorimetru măsoară densitatea de culoare a soluției. În colorimetrie, există două opțiuni posibile pentru dependența densității culorii de concentrația unei substanțe - o dependență direct proporțională sau o dependență invers proporțională. Cu o relație direct proporțională, cu cât concentrația substanței este mai mare, cu atât densitatea de culoare a soluției este mai intensă. Cu o relație invers proporțională, cu cât concentrația substanței este mai mare, cu atât densitatea de culoare a soluției este mai mică. Din punct de vedere tehnic, acest lucru se întâmplă astfel: se iau mai multe soluții cu o concentrație cunoscută a unei substanțe, se măsoară densitatea acestor soluții și se construiește un grafic al dependenței concentrației de densitatea culorii ( diagrama de calibrare).

În continuare, se măsoară densitatea de culoare a soluției, a cărei concentrație este determinată, iar din graficul de calibrare se găsește valoarea concentrației corespunzătoare nivelului densității de culoare măsurată a soluției.În colorimetrele automate moderne, calibrarea este efectuată o singură dată, apoi dispozitivul în sine construiește o curbă de calibrare, care rămâne în memoria dispozitivului, iar măsurarea are loc automat.

Următoarele enzime sunt cel mai des utilizate în imunotestul enzimatic: peroxidază, fosfatază alcalină, avidină.

Cum sunt combinate reacțiile imunologice și enzimatice într-un imunotest enzimatic? Acum vom trece la considerarea imunotestului enzimatic în sine. Ce etape include și ce se întâmplă în timpul acestor reacții? Imunotestul enzimatic poate fi directe și indirecte.

Imunotestul enzimatic direct - etape de implementare

Într-un imunotest enzimatic direct, sunt utilizați anticorpi la antigenul detectat, combinați cu o etichetă specifică. Această etichetă specifică este substratul reacției enzimatice.

Atașarea antigenelor la suprafața godeului și combinarea antigenului cu anticorpul

Cum se efectuează imunotestul enzimatic direct? Materialul biologic este prelevat (sânge, răzuire de pe mucoase, frotiuri) și plasat în găuri speciale. Materialul biologic este lăsat în godeuri timp de 15-30 de minute, astfel încât antigenele să poată adera la suprafața godeurilor. Apoi, anticorpii la antigenul detectat sunt adăugați în aceste godeuri. Aceasta înseamnă că la detectarea antigenelor, de exemplu, sifilisul, se adaugă anticorpi împotriva antigenelor sifilisului. Acești anticorpi sunt obținuți industrial, iar laboratoarele cumpără truse gata făcute.Acest amestec de material de testat și anticorpi este lăsat ceva timp (de la 30 de minute la 4-5 ore) pentru ca anticorpii să găsească și să contacteze antigenul „lor”. Cu cât eșantionul biologic de antigeni este mai mult, cu atât mai mulți anticorpi se vor lega de ei.

Eliminarea anticorpilor „în plus”.

După cum sa indicat, anticorpii sunt, de asemenea, asociați cu o etichetă specifică. Deoarece anticorpii sunt adăugați în exces, nu toți se vor lega de antigene și, dacă nu există antigen în probă, atunci, în consecință, nici un singur anticorp nu se va lega de antigenul dorit. Pentru a elimina anticorpii „în plus”, conținutul din godeuri este pur și simplu turnat. Ca urmare, toți anticorpii „în plus” sunt îndepărtați, iar cei care s-au legat de antigene rămân, deoarece antigenii sunt „lipiți” de suprafața godeurilor. Sondele sunt clătite de mai multe ori cu o soluție specială, care vă permite să spălați toți anticorpii „în plus”.

În continuare, începe a doua etapă - reacția enzimatică. O soluție cu enzimă se adaugă în godeurile spălate și se lasă timp de 30-60 de minute. Această enzimă are afinitate pentru substanța (marca specifică) de care sunt legați anticorpii. Enzima efectuează o reacție care transformă această etichetă specifică (substrat) într-o substanță (produs) colorată. Apoi, folosind colorimetrie, se găsește concentrația acestei substanțe colorate. Deoarece această etichetă specifică este asociată cu anticorpi, înseamnă că concentrația produsului de reacție colorat este egală cu concentrația de anticorpi. Și concentrația de anticorpi este egală cu concentrația de antigene. Astfel, în urma analizei, primim un răspuns cu privire la concentrația microbului sau hormonului detectat.

Exact așa funcționează imunotestul enzimatic direct. Cu toate acestea, astăzi imunotestul enzimatic indirect este mai des utilizat, deoarece sensibilitatea și acuratețea indirectă este mai mare decât cea directă. Deci, să trecem la imunotestul enzimatic indirect.

Imunotestul enzimatic indirect - etape de implementare

Există două etape în imunotestul enzimatic indirect. În timpul primei etape, sunt utilizați anticorpi nemarcați la antigenii detectați, iar în a doua etapă, anticorpi marcați sunt utilizați pentru primii anticorpi nemarcați. Adică, nu este legarea directă a unui anticorp la un antigen, ci un control dublu: legarea anticorpilor la un antigen, urmată de legarea anticorpilor secunde la complexul anticorp + antigen. De regulă, anticorpii pentru prima etapă sunt șoarecele, iar pentru a doua - capră.

Fixarea antigenelor pe suprafața godeului și legarea antigenului la un anticorp nemarcat
La fel ca în cazul imunotestului enzimatic direct, se colectează material biologic - sânge, răzuire, frotiuri. Materialul biologic studiat este introdus în godeuri și lăsat timp de 15-30 minute pentru ca antigenele să adere la suprafața godeurilor. Apoi anticorpii nemarcați la antigeni sunt adăugați în godeuri și lăsați pentru o perioadă de timp (1-5 ore), astfel încât anticorpii să se lege de antigenele „lor” și să formeze un complex imun ( Primul pas). După aceea, anticorpii „extra” nelegați sunt îndepărtați prin turnarea conținutului godeurilor. Se spala cu o solutie speciala pt îndepărtarea completă toți anticorpii nelegați.

Legarea anticorpului marcat la complexul antigen + anticorp nemarcat
După care iau al doilea anticorpi marcați, îi adaugă în godeuri și se lasă din nou timp - 15-30 minute ( a doua fază). În acest timp, anticorpii marcați se leagă de primii - cei nemarcați - și formează un complex - anticorp + anticorp + antigen. Cu toate acestea, atât anticorpii marcați, cât și cei nemarcați sunt adăugați în godeuri în exces. Prin urmare, este necesar să se elimine din nou anticorpii „extra” deja marcați care nu s-au legat de anticorpi nemarcați. Pentru a face acest lucru, repetați procedura de turnare a conținutului godeurilor și spălare cu o soluție specială.

Reacție enzimatică - formarea unui compus colorat
După aceea, se adaugă o enzimă care realizează reacția de transformare a „etichetei” într-o substanță colorată. Culoarea se dezvoltă în 5-30 de minute. Apoi se efectuează colorimetria și se calculează concentrația substanței colorate. Deoarece concentrația substanței colorate este egală cu concentrația de anticorpi marcați, iar concentrația de anticorpi marcați este egală cu concentrația de anticorpi nemarcați, care, la rândul său, este egală cu concentrația de antigen. Astfel, obținem concentrația antigenului detectat.
Acest dublu control sub forma utilizării a două tipuri de anticorpi a făcut posibilă creșterea sensibilității și specificității metodei de imunotest enzimatic. În ciuda prelungirii timpului de analiză și a includerii unor etape suplimentare, aceste pierderi sunt compensate de acuratețea rezultatului. De aceea, în prezent, marea majoritate a metodelor de imunotestare enzimatică sunt imunotestele enzimatice indirecte.

Ce boli sunt detectate prin imunotestul enzimatic?

Să trecem la considerarea ce boli și ce substanțe biologic active sunt detectate prin imunotestul enzimatic. Substanțele detectate prin imunotestul enzimatic sunt prezentate în tabel.

Hormoni și markeri ai bolii tiroidiene	peroxidaza tiroidiană (TPO)
	Tiroglobulina (TG)
	Hormonul de stimulare a tiroidei (TSH)
	Tiroxina (T4)
	Triiodotironina (T3)
	Tiroxină liberă(T4)
	Triiodotironina liberă (T3)
Diagnosticare funcția de reproducere	Hormonul luteinizant (LH)
	Hormonul foliculostimulant (FSH)
	Prolactina
	Progesteron
	Estradiol
	Testosteron
	cortizolul
	Globulina care leagă steroizii (SBG)
	Alfafetoproteina (AFP)
Markeri tumorali	Gonadotropină corionică (CG)
	Antigenul specific prostatic (PSA)
	SA – 125
	SA – 19.9
	CYFRA-21-1
	M – 12 (SA – 15,3)
	MUC – 1 (M – 22)
	MUC1 (M – 20)
	Alveomucină
	K – lanț
	L – lanț
	Factorul de necroză tumorală (TNFα)
	γ – interferon
	Antigenul carcinoembrionar (CEA)
Diagnosticul bolilor infecțioase