Moderné metódy diagnostiky infekcie HIV. Diagnostika ELISA: aká je podstata, stanovenie protilátok, ako sa vykonáva a pri ktorých chorobách je účinná? Polymerická reťazová reakcia

Včasná diagnóza infekcie HIV sa stáva mimoriadne dôležitým opatrením, pretože včasné začatie liečby môže do značnej miery predurčiť ďalší vývoj ochorenia a predĺžiť život pacienta. V posledných rokoch došlo k významnému pokroku pri odhaľovaní tejto hroznej choroby: staré testovacie systémy sa nahrádzajú pokročilejšími, vyšetrovacie metódy sa stávajú dostupnejšími a ich presnosť sa výrazne zvyšuje.

V tomto článku sa budeme baviť o moderných metódach diagnostikovania infekcie HIV, ktoré sú užitočné vedieť o včasnom riešení tohto problému a zachovaní normálnej kvality života chorého.

Diagnostické techniky HIV

V Rusku sa na diagnostiku infekcie HIV vykonáva štandardný postup, ktorý zahŕňa dve úrovne:

• Testovací systém ELISA (skríningová analýza);
• imunitné blotovanie (IB).

Na diagnostiku sa môžu použiť aj iné metódy:

• expresné testy.

Testovacie systémy ELISA

V prvej etape diagnostiky sa na detekciu infekcie HIV používa skríningový test (ELISA), ktorý je založený na proteínoch HIV vytvorených v laboratóriách, ktoré zachytávajú špecifické protilátky produkované v tele v reakcii na infekciu. Po interakcii s činidlami (enzýmami) testovacieho systému sa zmení farba indikátora. Tieto zmeny farby sa ďalej spracúvajú na špeciálnom zariadení, ktoré určuje výsledok vykonanej analýzy.

Takéto testy ELISA sú schopné ukázať výsledky do niekoľkých týždňov po zavedení infekcie HIV. Táto analýza neurčuje prítomnosť vírusu, ale deteguje produkciu protilátok proti nemu. Niekedy v ľudskom tele sa tvorba protilátok proti HIV začína po 2 týždňoch po infekcii, ale u väčšiny ľudí sa vyvinú neskôr, po 3 až 6 týždňoch.

Existujú štyri generácie testov ELISA s rôznou citlivosťou. V posledných rokoch sa častejšie používali testovacie systémy generácií III a IV, ktoré sú vytvorené na báze syntetických peptidov alebo rekombinantných proteínov a majú väčšiu špecificitu a presnosť. Môžu sa použiť na diagnostikovanie infekcie HIV, sledovanie prevalencie HIV a zaistenie bezpečnosti pri skríningu darovanej krvi. Presnosť testovacích systémov ELISA III a IV generácie je 93 - 99% (citlivejšie testy vyrobené v západnej Európe sú 99%).

Na vykonanie testu ELISA sa z žily pacienta odoberie 5 ml krvi. Medzi posledným jedlom a testom by malo uplynúť najmenej 8 hodín (zvyčajne ráno, na lačný žalúdok). Odporúča sa vykonať takýto test najskôr 3 týždne po údajnej infekcii (napríklad po nechránenom styku s novým sexuálnym partnerom).

Výsledky testu ELISA sa získajú za 2-10 dní:

• negatívny výsledok: naznačuje neprítomnosť infekcie HIV a nevyžaduje postúpenie špecialistovi;
• falošne negatívny výsledok: môže sa pozorovať v počiatočných štádiách infekcie (do 3 týždňov), v neskorých štádiách AIDS, so zreteľným potlačením imunity a nesprávnym prípravkom krvi;
• falošne pozitívny výsledok: možno ho pozorovať pri niektorých chorobách a pri nesprávnom vykonaní prípravy krvi;
• pozitívny výsledok: indikuje infekciu HIV, vyžaduje si IB a odporúčanie pacienta špecialistovi v centre AIDS.

Prečo môže test ELISA priniesť falošne pozitívne výsledky?

Falošne pozitívne výsledky testu ELISA na HIV možno pozorovať pri nesprávnom spracovaní krvi alebo u pacientov s nasledujúcimi stavmi a chorobami:

• mnohopočetný myelóm;
• infekčné choroby vyvolané vírusom Epstein-Barrovej;
• stav po;
• autoimunitné ochorenia;
• na pozadí tehotenstva;
• stav po očkovaní.

Z vyššie uvedených dôvodov môžu byť v krvi prítomné nešpecifické skrížene reagujúce protilátky, ktorých produkcia nebola vyvolaná infekciou HIV.

V posledných rokoch sa frekvencia falošne pozitívnych výsledkov významne znížila v dôsledku použitia testovacích systémov tretej a štvrtej generácie, ktoré obsahujú citlivejšie peptidy a rekombinantné proteíny (syntetizujú sa pomocou genetického inžinierstva in vitro). Po začatí používania takýchto testov ELISA sa frekvencia falošne pozitívnych výsledkov významne znížila a predstavuje približne 0,02 - 0,5%.

Zistenie falošne pozitívneho neznamená, že osoba je infikovaná vírusom HIV. V takýchto prípadoch WHO odporúča vykonať ďalší test ELISA (nevyhnutne IV generácia).

Krv pacienta sa odošle do referenčného alebo arbitrážneho laboratória označeného ako „opakovať“ a vyšetrí sa na testovacom systéme ELISA IV generácie. Ak je výsledok novej analýzy negatívny, prvý výsledok sa považuje za chybný (chybný pozitívny) a IB sa nevykoná. V prípade pozitívneho alebo pochybného výsledku počas druhého testu musí byť pacientovi pridelené IB do 4 až 6 týždňov na potvrdenie alebo zamietnutie infekcie HIV.

Imunitné blotovanie

Definitívnu diagnózu infekcie HIV je možné stanoviť až po dosiahnutí pozitívneho výsledku imunitného prenosu (IB). Na jeho implementáciu sa používa nitrocelulózový pás, na ktorý sa aplikujú vírusové proteíny.

Odber krvi pre IB sa uskutočňuje z žily. Potom sa podrobí špeciálnemu spracovaniu a bielkoviny obsiahnuté v sére sa separujú v špeciálnom géli podľa ich náboja a molekulovej hmotnosti (manipulácia sa vykonáva na špeciálnom zariadení pod vplyvom elektrického poľa). Nitrocelulózový pásik sa nanesie na krvný sérový gél a prenos ("prenos") sa uskutoční v špeciálnej komore. Prúžok sa spracúva a pokiaľ sú v použitých materiáloch protilátky proti HIV, potom sa viažu na antigénne pásy na IB a javia sa ako čiary.

IB sa považuje za pozitívny, ak:

• podľa amerických kritérií CDC - na prúžku sú dve alebo tri riadky gp41, p24, gp120 / gp160;
• podľa kritérií amerického FDA - na páse sú dve čiary p24, p31 a čiara gp41 alebo gp120 / gp160.

V 99,9% prípadov znamená pozitívny výsledok IB infekciu HIV.

Pri absencii riadkov je IB negatívny.

Pri identifikácii riadkov s gp160, gp120 a gp41-IB je pochybné. Taký výsledok sa dá zistiť, keď:

• onkologické choroby;
• tehotenstva;
• časté krvné transfúzie.

V takýchto prípadoch sa odporúča vykonať opakované preskúmanie pomocou súpravy od inej spoločnosti. Ak po dodatočnom IB ostane výsledok nejasný, potom je potrebné pozorovanie počas šiestich mesiacov (IB sa vykonáva každé 3 mesiace).

Polymerická reťazová reakcia

Test PCR môže detegovať RNA vírusu. Jeho citlivosť je pomerne vysoká a umožňuje vám zistiť infekciu HIV už 10 dní po infekcii. V niektorých prípadoch môže PCR poskytnúť falošne pozitívne výsledky, pretože jej vysoká citlivosť môže tiež reagovať na protilátky proti iným infekciám.

Táto diagnostická technika je drahá, vyžaduje špeciálne vybavenie a vysokokvalifikovaných odborníkov. Tieto dôvody neumožňujú vykonať to počas hromadného testovania populácie.

PCR sa používa v týchto prípadoch:

• odhaliť HIV u novorodencov narodených matkám infikovaným HIV;
• na detekciu HIV v „okienku“ alebo v prípade pochybných IB;
• na kontrolu koncentrácie HIV v krvi;
• na štúdium darcovskej krvi.

Iba pomocou testu PCR nie je HIV diagnostikovaná, ale vykonáva sa ako dodatočná diagnostická metóda na riešenie sporných situácií.

Expresné metódy

Jednou z inovácií v diagnostike HIV sa stali rýchle testy, ktorých výsledky je možné vyhodnotiť do 10 - 15 minút. Najefektívnejšie a najpresnejšie výsledky sa získajú imunochromatografickými testami založenými na princípe kapilárneho toku. Sú to špeciálne prúžky, na ktoré sa nanáša krv alebo iné skúmané tekutiny (sliny, moč). V prítomnosti protilátok proti HIV sa po 10-15 minútach objaví na teste farebný prúžok a kontrolný prúžok - pozitívny výsledok. Ak je výsledok negatívny, zobrazí sa iba kontrolný prúžok.

Rovnako ako po testoch ELISA, výsledky rýchlych testov musia byť potvrdené analýzou IB. Až potom je možné diagnostikovať infekciu HIV.

Existujú expresné súpravy na domáce testovanie. Test OraSure Technologies1 (USA) je schválený FDA, predáva sa bez lekárskeho predpisu a môže sa použiť na detekciu HIV. Po teste sa pacientovi v prípade pozitívneho výsledku odporúča podrobiť sa vyšetreniu v špecializovanom stredisku na potvrdenie diagnózy.

Zvyšok testov na domáce použitie ešte nebol schválený FDA a ich výsledky môžu byť veľmi sporné.

Napriek tomu, že rýchle testy majú nižšiu presnosť ako testy ELISA IV generácie, bežne sa používajú na ďalšie testovanie populácie.

Môžete vykonať testy na zistenie infekcie HIV v ktorejkoľvek klinike, nemocnici v centrálnej oblasti alebo špecializovaných centrách AIDS. Na území Ruska sa konajú úplne dôverne alebo anonymne. Každý pacient môže očakávať lekársku alebo psychologickú pomoc pred alebo po teste. Za testy na HIV budete musieť platiť iba v komerčných nemocniciach a na verejných klinikách a nemocniciach, ktoré sa vykonávajú bezplatne.

Prečítajte si o spôsoboch, akými sa môžete nakaziť vírusom HIV, a aké mýty existujú o možnostiach nakazenia

popis

výcvik

indikácia

Interpretácia výsledkov

popis

Metóda stanovenia Enzymaticky viazaný imunosorbentový test (ELISA).

Študijný materiál Krvné sérum

K dispozícii je domáca návšteva

Kombinovaná detekcia protilátok proti HIV typu 1 a 2 a antigénu HIV p24, kvalitatívny test.

Pozor. V prípade pozitívnych a pochybných reakcií sa lehota na vydanie výsledku môže predĺžiť až na 10 pracovných dní. HIV (vírus ľudskej imunodeficiencie), ktorý spôsobuje AIDS (syndróm získanej imunodeficiencie), patrí do rodiny retrovírusov. Prenáša sa z človeka na človeka pomocou kontaminovaných ihiel a striekačiek na intravenózne podávanie liekov alebo terapeutických postupov, prostredníctvom pohlavného styku, heterosexuálneho aj homosexuálneho. K prenosu vírusu môže dôjsť transfúziou infikovanej krvi a jej produktov, darovaním orgánov alebo spermy a zdravotníckymi pracovníkmi - ak sú zranení infikovanými ihlami alebo nástrojmi. Infekcia HIV je možná prostredníctvom prenosu z infikovanej matky na dieťa (vertikálna cesta), hoci moderné metódy prevencie pomocou antiretrovírusovej terapie, ak sa dodržiavajú všetky odporúčania, môžu toto riziko znížiť na minimum.

Proces interakcie vírusu s bunkou zahrnuje niekoľko stupňov: väzba vírusu na bunku, jej uvoľnenie z obalu, penetrácia do cytoplazmy, syntéza DNA z vírusovej RNA a inzercia vírusovej DNA do genómu hostiteľskej bunky. Potom začne latentná fáza infekcie. V tomto stave môže provírusová DNA existovať nejaký čas bez prejavenia aktivity a bez ovplyvnenia vitálnej aktivity hostiteľskej bunky. Pokiaľ nedôjde k expresii vírusových proteínov, neexistuje imunitná reakcia na vírus. Protilátky proti HIV, ktoré charakterizujú imunitnú odpoveď tela, sa objavia po aktivácii vírusovej DNA a vírus sa začne aktívne množiť. Trvanie latentného obdobia závisí od mnohých faktorov vrátane individuálnych genetických charakteristík organizmu.

Protilátky proti HIV sa môžu objaviť už druhý týždeň po infekcii; ich obsah sa zvyšuje v priebehu 2 až 4 týždňov a trvá mnoho rokov. U 90 až 95% infikovaných sa objaví v prvých troch mesiacoch po infekcii, v 5 až 9% - v období od troch do šiestich mesiacov, v 0,5 až 1% - neskôr.

V prvých týždňoch infekcie, ešte pred objavením sa protilátok proti vírusu (t. J. Pred sérokonverziou), môže byť vo vzorkách séra alebo plazmy detekovaná prítomnosť antigénov HIV, vrátane jej kapsidového proteínu p24. Neskôr, po sérokonverzii, sa zvyčajne stáva nezistiteľnou.

Kombinované testovacie systémy 4. generácie, ktoré zahŕňajú test HIV Ag / Ab Combo (Architect, Abbott), detekujú protilátky proti HIV typu 1 a 2 a antigén HIV p24, čo umožňuje včasnú detekciu infekcie. Medzi osobitné vlastnosti skríningového testu použitého v laboratóriu INVITRO na zisťovanie infekcie HIV patrí vysoká špecifickosť štúdie (\u003e 99,5%); 100% citlivosť testu na protilátky typické pre obdobie sérokonverzie a citlivosť testu na antigén p24 je približne 18 pg / ml.

Postup laboratórneho testovania na HIV je prísne regulovaný nariadením Ministerstva zdravotníctva Ruskej federácie a zahŕňa fázu skríningovej (skríningovej) štúdie prítomnosti protilátok proti HIV pomocou metód enzýmovej imunoanalýzy (ELISA), ktoré sú schválené na použitie, a štádia overovania (potvrdzujúceho) podrobnejšieho výskumu v laboratóriu centra AIDS mesta. Je potrebné poznamenať, že ani tie najlepšie skríningové systémy ELISA nezaručujú 100% špecificitu, to znamená, že existuje určitá pravdepodobnosť získania nešpecifických, falošne pozitívnych výsledkov spojených s charakteristikami krvného séra pacienta. Pozitívny výsledok skríningového testu ELISA sa preto nemusí potvrdiť v potvrdzujúcich testoch, po ktorých bude pacientovi doručený negatívny alebo neurčitý výsledok. Ak nie je výsledok potvrdzujúcej štúdie nejasný, testovanie by sa malo opakovať v priebehu 2-3 týždňov.

Laboratórna diagnostika infekcie HIV u detí narodených matkám infikovaným HIV má svoje vlastné charakteristiky. Materské protilátky proti HIV (trieda IgG) môžu cirkulovať v krvi až 18 mesiacov od narodenia. Neprítomnosť protilátok proti HIV u novorodencov neznamená, že vírus neprenikol placentárnou bariérou. Deti matiek infikovaných HIV sa podrobia laboratórnemu a diagnostickému vyšetreniu do 36 mesiacov po narodení.

výcvik

Nevyžadujú sa žiadne špeciálne školenia. Odporúča sa odoberať krv najskôr 4 hodiny po poslednom jedle. Všeobecné pokyny na prípravu na výskum možno nájsť. Odporúča sa vykonať štúdiu na detekciu antigénu a protilátok proti HIV najskôr dva týždne po možnej infekcii, s opakovaním po troch a šiestich týždňoch v prípade negatívneho výsledku. Registrácia žiadostí o výskum v spoločnosti INVITRO LLC sa vykonáva na základe pasu alebo dokladu, ktorý ho nahrádza (migračná karta, dočasná registrácia v mieste bydliska, osvedčenie správcu, osvedčenie cestovného úradu v prípade straty cestovného pasu, registračná karta od hotela). Predložený dokument musí obsahovať informácie o dočasnej alebo trvalej registrácii na území Ruskej federácie a fotografiu. V prípade absencie pasu (dokladu, ktorý ho nahrádza) má pacient právo podať anonymnú žiadosť o vydanie biomateriálu. Pri anonymnom vyšetrení sa žiadosti a biomateriálnej vzorke prijatej od klienta pridelí číslo známe iba pacientovi a zdravotníckemu personálu, ktorý vydal objednávku. ! Výsledky anonymne uskutočnených štúdií nemožno predložiť na hospitalizáciu, odborné prehliadky a nepodliehajú registrácii v ORUIB.

Indikácie pre vymenovanie

• Opuchnuté lymfatické uzliny vo viac ako dvoch oblastiach.
• Leukopénia s lymfopéniou.
• Nočné potenie.
• Dramatická strata hmotnosti z nejasného dôvodu.
• Hnačka nejasnej príčiny trvajúca dlhšie ako tri týždne.
• Horúčka neznámej príčiny.
• Plánovanie tehotenstva.
• Predoperačná príprava, hospitalizácia.
• Identifikácia nasledujúcich infekcií alebo ich kombinácií: tuberkulóza, zjavná toxoplazmóza, často sa opakujúca herpetická vírusová infekcia, kandidóza vnútorných orgánov, opakovaná herpes zoster neuralgia spôsobená mykoplazmami, pneumocystou alebo legionelskou pneumóniou.
• Kaposiho sarkóm v mladom veku.
• Príležitostný sex.

Interpretácia výsledkov

Interpretácia výsledkov testu obsahuje informácie pre ošetrujúceho lekára a nepredstavuje diagnózu. Informácie v tejto časti nemožno použiť na autodiagnostiku a samoliečbu. Presnú diagnózu stanoví lekár, pričom použije výsledky tohto vyšetrenia a potrebné informácie z iných zdrojov: anamnéza, výsledky iných vyšetrení atď.

Merné jednotky v nezávislom laboratóriu INVITRO: kvalitatívny test. Forma prezentácie výsledkov: v neprítomnosti protilátok proti HIV 1 a 2 a antigénu p24 je odpoveď „negatívna“. V prípade detekcie protilátok proti HIV alebo antigénu pri skríningovom enzýmovom imunoanalýze sa vzorka séra odošle na výskum potvrdzujúcou imunoblotovou metódou do centra AIDS mesta, ktoré overí pozitívne a neisté výsledky.

Pozitívny výsledok:

1. Infekcia HIV;
2. falošne pozitívny výsledok, ktorý si vyžaduje opakované alebo dodatočné štúdie *);
3. štúdia nie je poučná u detí mladších ako 18 mesiacov, ktoré sa narodili matkám infikovaným HIV.

* Špecifickosť skríningového testovacieho systému na protilátky proti HIV 1 a 2 a antigénu HIV 1 a 2 (HIV Ag / Ab Combo, Abbott) je podľa odhadov poskytnutých výrobcom reagencie asi 99,6% v bežnej populácii aj v skupine pacientky s možnými interferenciami (infekcie HBV, HCV, rubeola, HAV, EBV, HNLV-I, HTLV-II, E. coli, Chl.trach., atď., autoimunitné patológie (vrátane reumatoidnej artritídy, prítomnosť antinukleárnych protilátok), gravidita, zvýšené hladiny IgG, IgM, monoklonálnych gamapatií, hemodialýzy, viacnásobných krvných transfúzií).

Infekcia HIV je klasifikovaná ako nekontrolované ochorenie z dôvodu nedostatku metód na jej špecifickú prevenciu a nedostatočnej účinnosti liečby. Na kontrolu epidemiologickej situácie pri infekcii HIV sa preto v súčasnosti používajú najmä skríningové diagnostické štúdie. Popredné miesto v metódach diagnostikovania infekcie HIV je na imunosorbentovom teste s enzýmom (ELISA), ktorý umožňuje identifikovať sérologické markéry pôvodcu tohto ochorenia u skúmaných jedincov.

Táto správa predstavuje výsledky stanovenia protilátok proti HIV v krvnom sére 40 823 ľudí vrátane pacientov na prenatálnych klinikách, poliklinikách, mestských nemocniciach, ako aj na lekárskych strediskách špecializovaných na vyšetrenie a liečbu rizikových pacientov (drogovo závislí, pacienti s vírusovou hepatitídou B). , C a pohlavné choroby). Štúdie sa uskutočnili v roku 2005 v laboratóriu imunológie Výskumného ústavu pôrodníctva a gynekológie. PRED. Ott Ruská akadémia lekárskych vied, ktorá má viac ako 15 rokov skúseností s používaním metód ELISA na diagnostikovanie rôznych infekčných chorôb.

Na primárne vyšetrenie vzoriek krvného séra sme použili testovací systém CombiBest anti-HIV-1 + 2 (Vector-Best, Novosibirsk), ktorý detekuje celkové špecifické protilátky proti HIV-1 a HIV- 2 (imunoglobulíny tried A, G a M). V tejto diagnostickej súprave sa rekombinantné proteíny HIV používajú ako na imobilizáciu v jamkách doštičiek, tak aj vo forme konjugátu s chrenovou peroxidázou. Vyhodnotenie výsledkov analýzy séra sa uskutočnilo v súlade s odporúčaniami pokynov pre testovací systém: negatívne (neobsahujúce protilátky proti HIV-1 a HIV-2) boli považované za testované vzorky, ktorých optická hustota (OD) v ELISA neprekročila hodnotu ODcrit.

Pri skríningu v laboratóriu na 40222 (98,5%) 40823 vzoriek séra sa získal negatívny výsledok testu ELISA a 601 (1,5%) testovanej vzorky sa považovalo za primárne pozitívne. Výsledkom opakovanej analýzy každého zo 601 sér v duplikátoch (dve jamky platne) nasledujúci deň bolo 440 (73,2%) vzoriek pozitívnych a 161 (26,8%) negatívnych. V súlade s odporúčaniami ministerstva zdravotníctva a sociálneho rozvoja bolo zmrazených 440 pozitívnych sér pri skríningu a odovzdaných na ďalšie konfirmačné štúdie do konzultačnej a diagnostickej miestnosti referenčného laboratória nemocnice č. VVS Bot-kín. Tieto štúdie sa uskutočňovali s použitím imunosorbentových testovacích systémov EKOlab-Vironostika HIV 1,2 Ag / At (EKOlab, Elektrogorsk), Genscreen Plus HIV Ag-Ab "(" BioRad ", USA), ako aj súpravy na imunoblot. Výsledky analýzy 440 sér v potvrdzujúcich testoch viedli k záveru, že 323 (73,4%) vzoriek je pozitívnych a 102 (23,2%) negatívnych. Neurčený analytický výsledok sa získal pre 15 skúmaných vzoriek (3,4%).

Je potrebné poznamenať, že hodnoty OD získané v našom laboratóriu počas počiatočného testovania s použitím testovacieho systému proti HIV-1 + 2 CombiBest pre 314 (97,2%) z týchto 323 pozitívnych sér sa pohybovali od 0,900 do 1,780, a pre 9 (2,8%) vzoriek - 0,500 - 0,900. Hodnoty OD získané skríningom 102 negatívnych sér pre 52 vzoriek (51%) sa pohybovali od 0,195 do 0,400; pre 40 (39,2%) vzoriek - 0,401 - 0,800; 10 (9,8%) vzoriek - viac ako 0,800.

V dôsledku vykonanej práce sa teda ukázalo, že primárne vyšetrenie krvného séra na prítomnosť sérologických markerov infekcie HIV pomocou testovacieho systému CombiBest anti-HIV-1 + 2 je vysoko účinné. Pozitívne výsledky skríningu boli potvrdené počas ďalších štúdií v referenčnom laboratóriu v 73% prípadov a falošne pozitívne výsledky boli zaznamenané iba pre 0,25% zo 40 823 analyzovaných sér.

Držitelia patentu RU 2283497:

Vynález sa týka oblasti biotechnológie a medicíny. Imunosorbčný systém spojený s enzýmami na identifikáciu spektra protilátok proti vírusu ľudskej imunodeficiencie (HIV) prvého a druhého typu, prvého typu skupiny O a detekciu antigénu proti vírusu ľudskej imunodeficiencie prvého typu p24 obsahuje imunosorbent založený na antigénoch vírusu ľudskej imunodeficiencie, ktoré sú gp41 (env HIV-1) a HIV-2 skupina O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (HIV-2 env), protilátky proti antigénu HIV 1 p24 a detekčné činidlá, zatiaľ čo vyššie uvedené antigény HIV a protilátky HIV sú sorbované v rôznych jamkách doštičiek na enzýmovo viazaný imunosorbentový test a na sorpciu sa používajú 96-jamkové polystyrénové skladacie alebo ne-skladacie platne. ÚČINOK: zvýšená citlivosť, zjednodušenie, eliminácia subjektivity hodnotenia výsledkov. 1 wp f-kryštály, 10 tabliet, 1 dwg

Vynález sa týka oblasti biotechnológie a medicíny. Použitie: diferencovaná detekcia všetkých tried špecifických protilátok proti proteínom vírusu ľudskej imunodeficiencie 1 a 2, vírusu HIV 1 skupiny O a antigénu p24 HIV 1.

Podstata: získanie enzýmovo viazaného imunosorbentového systému na identifikáciu spektra protilátok všetkých tried na jednotlivé proteíny a HIV 1 a 2, antigénu HIV 1 skupiny O a HIV 1 p24 v krvnom sére (plazme), imunoglobulínov a prípravkov ľudskej krvi na identifikáciu spektra protilátok proti HIV 1 a 2, HIV 1 skupina O, detekcia antigénu HIV 1 p24 a potvrdenie pozitívnych alebo pochybných výsledkov skríningu protilátok proti HIV 1 a 2, HIV 1 skupiny O a HIV 1 p24 antigénu.

OPIS VYNÁLEZU

Laboratórna diagnostika infekcie HIV je založená na troch oblastiach: a) indikácia HIV a jeho zložiek; b) detekcia protilátok proti HIV; c) stanovenie zmien v imunitnom systéme. Medzi existujúce metódy laboratórnej diagnostiky patria najbežnejšie sérologické nálezy - detekcia protilátok proti antigénom vírusu.

Na detekciu protilátok pri infekcii HIV sa používajú hlavne enzýmové imunotesty (ELISA) a imunoblotting (IB). ELISA je založená na imobilizácii vírusových antigénov na doštičkách, na ktoré sa viažu protilátky pacienta, a komplex antigén-protilátka sa deteguje pomocou monoklonálnych protilátok konjugovaných s chrenovou peroxidázou z myší proti ľudským imunoglobulínom G a M. Táto metóda je pomerne špecifická a citlivá a umožňuje detekciu vírusovo špecifických protilátok u 95% pacientov. Zostávajúcich 5% prípadov sa vyskytuje v skorých štádiách infekcie, keď je stále málo protilátok v krvnom sére alebo v terminálnych fázach choroby, keď telo už nie je schopné syntetizovať protilátky v dôsledku prudkého vyčerpania imunitného systému. Falošne pozitívne výsledky testu ELISA sú možné najmä u pacientov s autoimunitnými a onkologickými ochoreniami, ako aj s infekciou spôsobenou vírusom Eshptein-Barr. V tomto prípade dochádza ku krížovej reakcii protilátok proti reumatoidnému faktoru, vírusu Epstein-Barrovej alebo antigénnych determinantov podobných proteínom hlavného histokompatibilného komplexu triedy 1 a 2 (HLA-4 a DQW3), ktoré majú schopnosť viazať sa na antigény HIV. Falošne pozitívne výsledky sa často vyskytujú u tehotných žien a starších ľudí. Hemolýza, lipémia, bakteriálna kontaminácia séra môže tiež spôsobiť nespoľahlivé výsledky.

V tomto ohľade bolo navrhnutých a použitých niekoľko metód na testovanie špecifickosti výsledkov detekcie protilátok. Z týchto metód sa najčastejšie používa modifikácia Western Blot imunitného prenosu. Podstata metódy je nasledovná: v prvom štádiu sa proteíny HIV separujú molekulovou hmotnosťou pomocou elektroforézy na polyakrylamidovom géli. Potom dochádza k elektroforetickému prenosu z polyakrylamidového gélu na povrch nitrocelulózovej membrány. Antigény prenesené týmto spôsobom sa detegujú na membráne pomocou nepriamej analýzy: membrána sa inkubuje s testovaným materiálom; obsiahnuté protilátky sa viažu na antigény HIV prenesené na nitrocelulózovú membránu, potom sa prúžky membrány inkubujú s konjugátom; keď sa vytvorí komplex antigén-protilátka, konjugát sa k nemu pripojí, po premytí z konjugátu a inkubácii so substrátom dôjde k zafarbeniu tých oblastí nitrocelulózy, kde sa vytvorí komplex konjugát antigén-protilátka-protilátka. Výkres ukazuje príklady pozitívnych, slabo pozitívnych a negatívnych výsledkov imunoblotu.

V sére osôb infikovaných HIV-1 a HIV-2 sa detegujú protilátky proti nasledujúcim proteínom (p) a glykoproteínom (gp): Tabuľka A.

Tabuľka B uvádza kritériá na vyhodnotenie výsledkov imunitného prenosu, ktoré odporúča WHO a Ruské centrum pre prevenciu a kontrolu AIDS.

Na základe kritérií WHO sa séra považujú za pozitívne, ak sa pomocou IB zistia protilátky proti akýmkoľvek dvom obalovým proteínom HIV-1. Ak dôjde k reakcii iba s jedným z obalových proteínov (gp160, gp120, gp41) v kombinácii s reakciou s inými proteínmi alebo bez nich, výsledok sa považuje za sporný. Podľa Federálneho vedeckého a metodického centra Ministerstva zdravotníctva Ruskej federácie na prevenciu a kontrolu AIDS je možné séra interpretovať ako pozitívne av prítomnosti protilátok iba na jeden obalový proteín.

Detekcia protilátok proti antigénu p24 môže naznačovať obdobie nástupu sérokonverzie, pretože protilátky proti tomuto konkrétnemu proteínu sa objavujú ako prvé. Pozitívne reakcie s proteínmi gag a pol bez reakcie s env proteínmi môžu odrážať rané štádium sérokonverzie a môžu naznačovať prítomnosť infekcie HIV-2 alebo nešpecifickú reakciu.

Použitie imunoblottingových reakcií v diagnostike HIV ako expertnej metódy má množstvo významných nevýhod:

1. Nemožnosť potvrdiť detekciu antigénu HIV 1 p24 v prípade použitia testov, ktoré súčasne určujú antigén a protilátky proti HIV, čo znemožňuje (nemá zmysel) použitie ako skríningových testov na simultánnu detekciu antigénu a protilátok proti HIV (nariadenie Ministerstva zdravotníctva Ruskej federácie č. 292 zo dňa 30.07.). 2001: „na vyšetrenie darcov v transfúznych staniciach krvi je potrebné použiť testovacie systémy, ktoré súčasne detekujú antigén a protilátky proti HIV“).

2. Detekcia protilátok iba triedy IgG. Nie je možné úplne potvrdiť pozitívne výsledky získané pomocou testov 3. a 4. generácie (detekcia protilátok IgG a IgM).

3. Subjektivita interpretácie skóre testu, najmä v prípadoch „pochybných“ a „neistých“ výsledkov a v počiatočných fázach sérokonverzie (detekovateľné pásy na nitrocelulózových membránach sú v týchto prípadoch nezistiteľné, sotva viditeľné voľným okom a pri hodnotení rôznymi osobami sa často vyskytujú nezhody).

4. Nemožnosť automatizovaného kvantitatívneho hodnotenia výsledkov analýzy.

5. Nižšia citlivosť v porovnaní s testom ELISA.

6. Krehkosť uchovávania (počas skladovania prúžky nitrocelulózovej membrány vyblednú a nemôžu byť objektívnym potvrdením detekcie alebo nezistenia HIV v sporných prípadoch).

7. Ťažkosti s nastavením reakcie a skladovania (prúžky nitrocelulózovej membrány sú veľmi krehké a často sa zlomia).

8. Vysoké náklady na súbory informačnej bezpečnosti.

Známe činidlo, ktoré je súpravou na súčasné stanovenie antigénov a protilátok proti rovnakému patogénu vrátane HIV (DE 4236189 F1, 28.04.1994). Nie je však opísaný testovací systém, ktorý by umožňoval diagnostikovať infekciu HIV v rôznych štádiách.

Cieľom tohto vynálezu je poskytnúť testovací systém, pomocou ktorého je možné potvrdiť pozitívne alebo pochybné výsledky skríningových štúdií na protilátky proti HIV 1 a 2, HIV 1 skupiny O a HIV 1 p24 antigénu pomocou testov na simultánnu detekciu antigénov a protilátok.

Navrhované technické riešenie sa dosiahne pomocou enzýmového imunotestovacieho systému na identifikáciu spektra protilátok proti vírusu ľudskej imunodeficiencie (HIV) prvého a druhého typu, prvého typu skupiny O a detekciou antigénu p24 proti vírusu ľudskej imunodeficiencie prvého typu p24, ktorý sa vyznačuje tým, že obsahuje imunosorbent založený na antigénoch. vírus ľudskej imunodeficiencie, ktorým sú gp41 (HIV-1 a HIV-2 env skupiny O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (HIV-2 env), protilátky proti antigénu HIV 1 p24, a detekčné činidlá, kde vyššie uvedené antigény HIV a protilátky HIV sú sorbované v rôznych jamkách doštičiek ELISA.

Okrem toho sa na sorpciu používajú 96-jamkové polystyrénové skladacie alebo ne-skladacie platne pre enzýmový imunotest.

Technický výsledok dosiahnutý týmto vynálezom spočíva v možnosti potvrdenia pozitívnych výsledkov na protilátky proti HIV 1 a 2, HIV 1 skupiny O a HIV 1 p24 antigénu, vysokej citlivosti, možnosti automatizovanej interpretácie výsledkov, ktorá vylučuje subjektivitu hodnotenia, ľahkosť vykonania testu je menšia ako s existujúcimi sadami nákladov na bezpečnosť informácií.

Toto technické riešenie sa líši od známych:

1. Použitie doštičky na imunologické reakcie ako nosiča v tuhej fáze.

2. Súčasné použitie protilátok proti p24 HIV a súboru antigénov HIV ako sorbentu.

Vynález je ilustrovaný nasledujúcim príkladom.

Súčasný princíp vyvinutého testovacieho systému „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AG p24 HIV 1“ je:

Imunosorbent - rekombinantné antigény podobné štruktúrnym proteínom HIV-1: gp41 (env HIV-1 a HIV 1 skupina O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), HIV-2: gp36 (env) a monoklonálne myšie protilátky proti HIV 1 antigénu (p24), zvlášť sorbované na prúžkoch polystyrénovej sklopnej doštičky.

Na prípravu imunosorbentu použite:

1. HIV-1 gp41 je proteín produkovaný kmeňom E. coli č. AHIV 103.

2. HIV-1 gpl20 je proteín produkovaný kmeňom E. coli č. AHIV 109.

3. HIV-1 p24 je proteín produkovaný kmeňom E. coli č. AHIV 105.

4. HIV-1 p31 je proteín produkovaný kmeňom E. coli č. AHIV 108.

5. HIV-2 p36 je proteín produkovaný kmeňom E. coli č. AHIV 106.

Konjugát 1, lyofilizovaný alebo tekutý, je myšacia monoklonálna protilátka proti HIV1 p24 antigénu konjugovaná s biotínom.

1. Konjugát 2, lyofilizovaný alebo kvapalný, je zmesou rekombinantných antigénov podobných štruktúrnym proteínom HIV-1: gp41 (env HIV-1 a HIV 1 skupina O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol); HIV-2: gp36 (env) konjugovaný s biotínom;

2. konjugáty 3, 4 - lyofilizované alebo tekuté - streptavidín značený chrenovou peroxidázou;

V priebehu predbežných štúdií bol zvolený návrh testovacieho systému, bola vyvinutá technológia na prípravu jeho zložiek, optimalizované podmienky pre imunoanalýzu enzýmu.

Pri stanovení ELISA v testovacom systéme „DS - ELISA - ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + Ag p24 HIV 1“ sa do jamiek platne s adsorbovanými protilátkami proti p24 a do jamiek s adsorbovanými antigénmi pridá 25 μl konjugátu-1. 25 μl konjugátu-2. Nastavenie reakcie je uvedené nižšie. Ďalej sa do každej jamky pridá 25 μl testovanej vzorky. Zároveň sa v jamkách s antigénmi zmení farba z oranžovej na ružovú a v jamkách s protilátkami - zo zelenej na sivú. Zmes sa inkubuje 45 minút pri 37 ° C na trepačke (alebo 1 hodinu pri 37 ° C v termostatu). Potom sa bez premytia pridá 50 ul konjugátu-3 do jamiek doštičky na stanovenie antigénu p24 a do jamiek sa pridá 50 ul konjugátu-4 na stanovenie protilátok. Po inkubácii počas 20 minút pri 37 ° C na trepačke (alebo 30 minút pri 37 ° C v termostatu) sa doštička premyje a vyvolá zmes substrátov. Celkový reakčný čas je 1 hodina 25 minút (alebo 1 hodina 50 minút). Antigén p24 prítomný v testovanej vzorke sa viaže na monoklonálne protilátky proti p24 a špecifické protilátky tvoria komplex s rekombinantnými antigénmi na doštičke. Výsledný imunitný komplex anti-p24 s p24 sa deteguje pomocou konjugátov anti-p24-biotínu, potom streptavidín-peroxidázy a imunitných komplexov Ag-HIV s Ab-HIV - konjugovaným Ar-biotínom, potom streptavidín-peroxidázou.

Schéma nastavenia reakcie.

Výsledky sa berú do úvahy spektrofotometricky pri dvoch vlnových dĺžkach: 450/620 - 680 nm s nastavením zariadenia "vzduchom". Zoberme do úvahy výsledky pri jednej vlnovej dĺžke 450 nm.

Výsledky analýzy sa zohľadňujú, ak priemerná optická hustota (OD) v jamkách s K- nie je vyššia ako 0,2, v jamkách s K + - nie menšia ako 1,0. OP krit. vypočítané podľa vzorca:

OP krit. gp41 \u003d porovnaj význam OP K- (gp41) +0,15

OP krit. gp120 \u003d porovnaj význam OP K- (gp120) +0,15

OP krit. p24 \u003d porovnaj význam OP K- (p24) +0,15

OP krit. p31 \u003d porovnaj význam OP K- (p31) +0,15

OP krit. gp36 \u003d porovnaj význam OP K- (gp36) +0,15

OP krit. Ag p24 \u003d porovnaj význam OP k- (Ag p24) +0,04

kde 0,15 a 0,04 sú koeficienty stanovené metódou štatistického spracovania u výrobcu. Pri vývoji testovacích systémov sa použili tieto prvky:

1. Vzorky krvného séra od zdravých darcov (n \u003d 610).

2. Vzorky krvného séra od pacientov s rôznymi infekčnými chorobami, ktoré nesúvisia s HIV (akútne infekcie dýchacích ciest, pneumónia, angína, herpetické a cytomegalovírusové infekcie, syfilis, chlamydia, vírusová hepatitída A, B a C (n \u003d 224)).

3. Vzorky krvného séra od pacientov s rôznymi neinfekčnými chorobami - trauma, ochorenia kardiovaskulárneho systému, onkológia (n \u003d 35).

4. Vzorky krvného séra od tehotných žien (n \u003d 40).

5. Vzorky krvného séra, séropozitívne v teste ELISA a potvrdené imunoblotom (n \u003d 428).

6. Vzorky séra s pozitívnym výsledkom získaným v enzýmových imunosorbentových testovacích systémoch na súčasné stanovenie protilátok HIV 1,2 a antigénu p24 a neurčitý výsledok imunoblotom (n \u003d 123).

7. Vnútorný panel séra, ktorý neobsahuje a neobsahuje protilátky proti HIV 1,2, testovaný na enzýmových imunoanalýznych testovacích systémoch a imunoblote zaregistrovanom ministerstvom zdravotníctva RF (n \u003d 21).

8. Štandardný štandard „HIV 1 ANTIGEN STANDARD“, „BIO RAD“, Francúzsko, kat. 72217, čo je antigén získaný z vírusového lyzátu.

9. Vnútorný štandard podniku. Vzorka obsahujúca antigén p24 v koncentrácii 200 pg / ml, získaná z vírusového lyzátu a titrovaná podľa spoločnosti „BIO RAD“ HIV 1 ANTIGEN STANDARD, Francúzsko, kat. Č. 72217.

10. Štandardný panel sér obsahujúcich protilátky proti vírusu ľudskej imunodeficiencie typu 1 (HIV 1) - OSO 42-28-212-93-02P, „Medico-Biological Union“, Novosibirsk.

11. Štandardný panel sér obsahujúcich protilátky proti vírusu ľudskej imunodeficiencie typu II (HIV 2) - OSO-42-28-216-02P, „Medico-Biological Union“, Novosibirsk.

12. Štandardný panel séra, ktoré neobsahuje protilátky proti vírusu ľudskej imunodeficiencie typu 1 a typu 2 (HIV 1, 2) - OSO-42-28-214-94-02P, „Medico-Biological Union“, Novosibirsk.

Vyhodnotenie citlivosti testovacieho systému na detekciu antigénu p24 sa uskutočnilo pomocou štandardu „HIV I ANTIGEN STANDARD“, „BIO RAD“, vnútorného podnikového štandardu. S použitím vnútorného štandardu sa pripravili 4 po sebe nasledujúce dvojnásobné riedenia od 40 pg / ml do 5 pg / ml s normálnou darcovskou plazmou bez protilátok proti HIV 1, 2 ako riedidla. Ako kritérium citlivosti sa použilo najmenšie množstvo detegovaného antigénu. Získané údaje sú uvedené v tabuľke 1.

Na vyhodnotenie citlivosti testovacieho systému na detekciu špecifických protilátok sme použili štandardné panely vzoriek obsahujúce protilátky proti vírusu ľudskej imunodeficiencie (HIV 1, 2) (OSO 42-28-212-93-02P s.012, OSO 42-28-216- 02P (HIV 2), str.

Získané údaje sú uvedené v tabuľkách 3, 4.

Bolo uskutočnené porovnanie diagnostickej účinnosti testovacieho systému "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AHr24 HIV 1" s testovacími systémami "Jenscreen-HIV-Ag / Ab" (Bio-Rad), "DIA-HIV 1". / 2 "(Diaprof-Med)," Vironostika HIV Uni-forma II Ag / Ab "(Biomerioux)," Rekombinantný HIV1,2 DSM "(MBS)," Amercard Anti-HIV-1,2 K "(Amercard) "HIV-1, HIV-2-ELISA-Avicenna" (Avicenna). Preto boli vo všetkých týchto testoch testované vzorky séra z vnútorného panelu. Výsledky uvedené v tabuľke 5 naznačujú vysokú diagnostickú účinnosť "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AGr24 HIV 1".

Štúdie citlivosti testovacieho systému „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AGr24 HIV 1“ sa vykonali aj s krvnými sérami pacientov potvrdenými v imunoblote ako HIV pozitívni. Celkovo bolo testovaných 428 vzoriek takýchto sér. Získalo sa niekoľko variantov detekcie protilátok proti rôznym HIV proteínom a antigénu p24. Výsledky sú uvedené v tabuľke 6.

Tabuľka 6. Výsledky detegovania protilátok na rôzne proteíny HIV 1 a p24 antigénu pri testovaní HIV 1 pozitívnych sér (n \u003d 428)
% detekcie	Proteínový profil
	anti-gp41	anti-gp120	anti-p24	anti-P31	p24
51,1%	+	+	+	+	-
35,3%	+	-	+	+	-
4%	+	-	+	-	-
3,3%	+	-	-	+	-
1,4%	+	-	-	+	+
1,2%	+	+	+	+	+
1,2%	+	+	-	+	+
0,9%	+	-	+	+	+
0,7%	+	-	+	-	+
0,5%	+	-	-	-	+
0,2%	+	+	-	-	+
0,2%	+	+	-	-	-
% detekcie protilátok na jednotlivé proteíny alebo Ag p24	100%	53,9%	93,2%	94,4%	6,1%

Pri testovaní na HIV 1 pozitívne vzorky vykazovali 3% séra pozitívnu reakciu s gp36 (HIV 2 env). OP / OP krit. v týchto vzorkách nepresiahla 2,0. Naše údaje o skríženej reaktivite proteínov vonkajšieho obalu HIV 1 (gp41) a HIV 2 (gp36) sa zhodujú s údajmi z literatúry.

Interpretácia výsledkov

Analýza testovania séra pozitívneho na HIV a vzoriek zo štandardných a vnútorných panelov v „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AGr24 HIV 1“ umožnila vývoj kritérií na interpretáciu výsledkov tohto testu. Odporúčané kritériá sú uvedené v tabuľke 7.

Na základe týchto kritérií boli všetky vzorky HIV pozitívnych sér (n \u003d 428) definované ako pozitívne v „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AGr24 HIV1“. Zo 16 vzoriek štandardného panelu obsahujúceho protilátky proti HIV bolo 1, 14 identifikovaných ako pozitívne a 2 ako neurčité. Všetkých 8 vzoriek zo štandardného panelu obsahujúceho protilátky proti HIV 2 sa určilo ako pozitívne. Z 10 vzoriek vnútorného panelu obsahujúcich protilátky proti HIV bolo 1, 7 identifikovaných ako pozitívnych a 3 ako neurčitých.

Štúdie citlivosti testovacieho systému „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AGr24 HIV 1“ sa vykonali aj s krvnými sérami pacientov s pozitívnym výsledkom v enzýmovo-imunoanalýzach, súčasne s detekciou protilátok a antigénu p24 a nedefinovaných v imunoblote. ... Celkovo bolo testovaných 123 takýchto vzoriek. Údaje sú uvedené v tabuľke 8.

Pri testovaní séra s neurčeným výsledkom imunoblotu (n \u003d 123) vo vzorkách „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AGr24 HIV 1“ 72 (58,5%) sa zistil pozitívny výsledok. Z toho 26 sér (21,1%) je pozitívnych iba na p24, 20 (16,3%) - iba na protilátky, 16 (13%) - na p24 s protilátkami na jeden z proteínov, 10 (8,1%) - p24 s protilátkami na dva alebo viac proteínov. Testovanie iba na protilátky (bez detegovania p24) by teda umožnilo identifikáciu 30 vzoriek (24,4%) ako pozitívnych. Detekcia antigénu p24 v teste umožnila stanovenie ďalších 42 vzoriek (34,1%) ako pozitívnych.

Na posúdenie špecifickosti testovacieho systému sa použil štandardný panel séra neobsahujúcich protilátky proti HIV 1, 2 (n \u003d 20); vzorky krvného séra od zdravých darcov (n \u003d 610), vzorky krvného séra od pacientov s rôznymi infekčnými chorobami (n \u003d 224), ktoré nesúvisia s HIV; vzorky krvného séra od pacientov s rôznymi neinfekčnými chorobami - trauma, ochorenia kardiovaskulárneho systému, onkológia (n \u003d 35); vzorky krvného séra od tehotných žien (n \u003d 40). Celkovo bolo testovaných 929 vzoriek. Jedna vzorka z krvných sér od zdravých darcov vykázala falošne pozitívny výsledok - detegovali sa protilátky proti gp41 a p24. 7 vzoriek krvného séra od zdravých darcov a 2 vzorky krvného séra od pacientov s infekčnými chorobami nesúvisiacimi s HIV vykázali falošne pozitívny výsledok pre p24.

Na vyhodnotenie špecifickosti testovacieho systému sa použil štandardný panel negatívnych vzoriek (OSO 42-28-214-94-02p, str. 49). Špecifickosť bola 100%.

Štúdie teda ukázali, že špecifickosť testovacieho systému „DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AGr24 HIV 1“ je 99% v štúdii vzoriek krvného séra od normálnych darcov a pacientov s rôznymi infekčnými a somatickými ochoreniami.

Získané údaje ukazujú vysokú diagnostickú účinnosť vyvinutého testovacieho systému "DS-ELISA-ANTI-HIV 1,2-SPECTRUM + AGr24 HIV 1". Testovací systém sa môže použiť na detekciu protilátok proti jednotlivým proteínom HIV 1 a 2 a antigénu HIV1 p24, aby sa potvrdil pozitívny výsledok skríningu pomocou testovacích systémov, ktoré detekujú protilátky, alebo testovacích systémov, ktoré súčasne detekujú protilátky a antigén HIV1 p24. Testovací systém sa môže použiť ako alternatíva imunoblotového testu na potvrdenie pozitívnych výsledkov, ako aj na štúdium dynamiky protilátok proti antigénu HIV a p24 v rôznych štádiách infekcie.

VÝHODY SKÚŠKY

1. Potvrdzovací test enzýmovej imunoanalýzy na doštičke

2. Potvrdzovací test kombinujúci stanovenie spektra protilátok HIV 1, 2 a antigénu p24 HIV 1

3. Detekcia protilátok všetkých tried Ig

4. Citlivosť na detekciu p24 nie je menšia ako 5 pg / ml

5. Umožňuje znížiť počet neistých výsledkov v porovnaní s imunoblotom

6. Čas analýzy - 1 hodina 25 min (imunoblot - od 3 do 20 hodín)

7. Vizuálne hodnotenie použitia všetkých komponentov a vzoriek.

1. Imunosorbčný systém spojený s enzýmami na identifikáciu spektra protilátok proti vírusu ľudskej imunodeficiencie (HIV) prvého a druhého typu, prvého typu skupiny O a detekciu antigénu p24 proti vírusu ľudskej imunodeficiencie prvého typu p24, vyznačujúci sa tým, že obsahuje imunosorbent založený na antigénoch vírusu imunodeficiencie. človek, predstavujúci gp41 (env HIV-1 a HIV-2 skupiny O), gp120 (env), p24 (gag), p31 (pol), gp36 (HIV-2 env), protilátky proti antigénu HIV 1 p24 a detekciu reagencie, zatiaľ čo vyššie uvedené antigény HIV a protilátky HIV sú sorbované v rôznych jamkách doštičiek pre enzýmový imunotest.

2. Enzymaticky viazaný imunosorbentový testovací systém podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že na sorpciu sa používa 96-jamková polystyrénová skladacia alebo nezložiteľná platnička pre enzýmovú imunoanalýzu.

ELISA (enzýmový imunosorbentový test, ELISA - angl.) Do života praktického lekárstva vstúpil niekde v 60. rokoch minulého storočia. Jeho pôvodnou úlohou bol histologický výskum na vedecké účely, ktorý sa obmedzil na hľadanie a identifikáciu antigénnej štruktúry buniek živého organizmu.

Metóda ELISA je založená na interakcii špecifických (AT) a príbuzných antigénov (AG) s tvorbou komplexu antigén-protilátka, ktorá sa deteguje pomocou enzýmu. Táto skutočnosť viedla vedcov k presvedčeniu, že táto metóda sa môže použiť na diagnostické účely na identifikáciu špecifických imunoglobulínov rôznych tried zapojených do imunitnej odpovede na konkrétnu infekciu. A to bol prielom v diagnostike klinických laboratórií!

Metóda sa začala aktívne používať až na začiatku 80. rokov a najmä v špecializovaných inštitúciách. Prvé enzýmové imunotestovacie analyzátory boli vybavené krvnými transfúznymi centrami a stanicami, infekčnými a pohlavnými nemocnicami, pretože muž narodený na africkom kontinente, hrozivý AIDS, ktorý sa objavil na obzore a okamžite sa pripojil k „starým“ infekciám, vyžadoval okamžité diagnostické opatrenia a hľadanie liekov ovplyvňujúcich ho.

Oblasť použitia metódy ELISA

Možnosti enzýmového imunotestu sú skutočne rozsiahle. Teraz je ťažké si predstaviť, ako to urobiť bez takýchto štúdií, ktoré sa používajú doslova vo všetkých odboroch medicíny. Zdá sa, čo môže ELISA urobiť v onkológii? Ukazuje sa, že môže. A veľa. Schopnosť analýzy nájsť markery charakteristické pre niektoré typy zhubných novotvarov je základom včasnej detekcie nádoru, keď to ešte nie je určené inou metódou z dôvodu jeho malej veľkosti.

Moderná klinická laboratórna diagnostika (CDL) má okrem nádorových markerov významný arzenál panelov ELISA a používa ich na diagnostikovanie rôznych patologických stavov (infekčné procesy, hormonálne poruchy) a na sledovanie farmaceutických liečivých prípravkov s cieľom identifikovať ich vplyv na telo pacienta a mimochodom iba osoba. Enzýmový imunotest sa v súčasnosti vo veterinárnej službe vo veľkej miere používa, pretože „naši menší bratia“ sú tiež vnímaví na mnohé choroby, ktoré občas veľmi trpia.

To znamená, ELISA môže vďaka svojej citlivosti a špecifickosti zo vzorky krvi odobratej z žily určiť:

• Hormonálny stav (hormóny štítnej žľazy a nadobličiek, pohlavné hormóny);
• Prítomnosť vírusových a bakteriálnych infekcií (HIV, B a C, chlamydia, syfilis a, ako aj mnoho ďalších chorôb spôsobených patogénnymi mikroorganizmami);
• Stopy životne dôležitej činnosti mikroorganizmov, ktoré iniciovali infekčný proces, ktorý šťastne skončil a prešiel do štádia tvorby imunitnej reakcie na tento patogén. Takéto stopy, to znamená protilátky, v mnohých prípadoch zostávajú cirkulujúce v krvi po celý život, čím chránia osobu pred opätovnou infekciou.

Čo je podstatou testu ELISA?

Enzýmový imunotest umožňuje určiť nielen prítomnosť patogénu samotného (kvalitatívna analýza), ale aj jeho kvantitatívny obsah v krvnom sére pacienta.

Vírusová alebo bakteriálna dávka významne ovplyvňuje priebeh infekčného procesu a jeho výsledok, preto kvantitatívna analýza hrá dôležitú úlohu pri diagnostike a liečbe chorôb v rôznych formách a štádiách.

Keďže však vieme, že imunologický test s enzýmami je metódou ELISA, ani neuvažujeme o tom, ako dokáže pokryť také široké spektrum mikroorganizmov, ktoré obývajú našu planétu, z ktorých mnohé predstavujú priame ohrozenie zdravia a života ľudí a zvierat. Faktom je, že ELISA má veľa možností (nekonkurenčných a konkurencieschopných - priamych a nepriamych), z ktorých každá rieši svoj vlastný problém, a teda umožňuje cielené vyhľadávanie.

Na detekciu imunoglobulínov jednej alebo druhej triedy sa používa tradičný 96-jamkový polystyrénový panel (doštička), v jamkách ktorých sú sorbované rekombinantné proteíny koncentrované v tuhej fáze. Protilátky alebo antigény zachytené v jamke krvným sérom nachádzajú „známy“ objekt a tvoria s ním komplex (AG - AT), ktorý sa po fixácii s enzýmovým konjugátom prejaví zmenou farby jamky pri čítaní výsledkov.

Enzymatická imunotest sa vykonáva na testovacích systémoch s určitou špecifickosťou, vyrába sa v špeciálnych laboratóriách a je vybavená všetkými potrebnými reaktívnymi zložkami. Výskum sa môže vykonávať pomocou podložiek („podložiek“) a odčítania spektrofotometrov, ktoré väčšinou zahŕňajú manuálnu prácu. Je samozrejme rýchlejšie a pohodlnejšie pracovať na plne automatických strojoch, ktoré zbavujú laboratórneho asistenta monotónneho zakopávania, umývania a iných rutinných úloh, ale nie všetky laboratóriá si môžu dovoliť taký luxus a naďalej pracovať staromódnym spôsobom - na poloautomatických strojoch.

Interpretácia výsledkov testu ELISA je v kompetencii laboratórneho diagnostika, zatiaľ čo vlastnosť spojená so takmer všetkými imunochemickými reakciami na poskytnutie falošne pozitívnych alebo falošne negatívnych reakcií sa nevyhnutne berie do úvahy.

Video: moderný enzýmový imunotest

Výsledky testu ELISA pre syfilis

Enzýmový imunotest je vhodný na detekciu všetkých foriema navyše sa používa pri skríningových štúdiách. Na analýzu sa používa žilová krv pacienta odobratá na lačný žalúdok. Práca využíva platne s určitou špecifickosťou (AT triedy A, M, G) alebo protilátky celkom.

Vzhľadom na to, že protilátky v syfilis sú produkované v špecifickej sekvencii, môže ELISA ľahko odpovedať na otázku, kedy došlo k infekcii a v akom štádiu je proces, a interpretácia získaných výsledkov sa môže uviesť takto:

• IgM indikujú trvanie infekčného procesu (môže sa objaviť so zhoršením chronických zápalových ochorení);
• IgA uvádza, že k infekcii došlo pred viac ako mesiacom;
• IgG znamená, že infekcia je v plnom prúde alebo v poslednom období, čo sa dá ľahko zistiť anamnézou.

Pri testovaní na syfilis zostanú jamky s negatívnou reakciou (a negatívnou kontrolou) bezfarebné, zatiaľ čo pozitívny výsledok (ako pozitívna kontrola) poskytne jasne žlté sfarbenie v dôsledku odfarbenia chromogénu pridaného počas štúdie. Intenzita farieb sa však vždy nezhoduje s kontrolou, to znamená, že môže byť mierne bledšia alebo mierne žltkastá. Toto sú pochybné výsledky, ktoré sa spravidla musia opätovne preskúmať s povinným prihliadnutím na kvantitatívne ukazovatele získané na spektrofotometri, ale vo všeobecnosti je farba priamo úmerná počtu imunitných komplexov (vzájomne prepojené medzi AG a AT).

Najzaujímavejšie z imunotestov enzýmov - ELISA na HIV

Analýza, možno viac ako iné, je zaujímavá pre široké spektrum obyvateľstva, pretože stále nie je možné s istotou povedať, že mnoho sociálnych problémov vymizlo (prostitúcia, drogové závislosti atď.). Bohužiaľ, HIV neovplyvňuje len tieto vrstvy ľudskej spoločnosti, je možné nakaziť sa za rôznych okolností, ktoré nesúvisia so sexuálnou promiskuitou alebo užívaním drog. Ale akonáhle sa objaví potreba testovania na HIV, potom by sa človek nemal báť, že sa všetci okolo budú učiť o návšteve takéhoto laboratória. Ľudia infikovaní vírusom HIV sú teraz chránení zákonom a pochybovatelia sa môžu obrátiť na anonymné úrady, kde môžu problém vyriešiť bez obáv z publicity a odsúdenia.

Enzymaticky viazaný imunosorbentový test používaný na diagnostikovanie infekcie HIV je jedným z primárnych štandardných testov, ktoré si však vyžadujú osobitné podmienky, pretože téma je veľmi chúlostivá.

Je rozumné vykonávať ELISA na HIV po pohlavnom styku, transfúzii krvi, iných lekárskych manipuláciách, ktoré naznačujú infekciu, a na konci inkubačnej doby („séronegatívne okno“), je však potrebné mať na pamäti, že toto obdobie nie je konštantné. Môže uplynúť 14 až 30 dní a môže trvať až šesť mesiacov, takže priemerná hodnota sa považuje za interval od 45 do 90 dní. V prípade HIV sa krv daruje rovnakým spôsobom ako pri iných infekciách - zo žily na lačný žalúdok. Výsledky budú pripravené v závislosti od akumulácie materiálu v laboratóriu a jeho pracovného zaťaženia (od 2 do 10 dní), aj keď laboratóriá najčastejšie poskytujú odpoveď v ten istý deň alebo nasledujúci deň.

Čo môžete očakávať od výsledkov HIV?

ELISA na infekciu HIV zisťuje protilátky proti dvom typom vírusu: HIV-1 (častejšie v Rusku a ďalších krajinách Európy a Ázie) a HIV-2 (častejšie sa vyskytujú v západnej Afrike).

Úlohou HIV ELISA je hľadať protilátky triedy G, ktoré sú detekované vo všetkých testovacích systémoch, ale v neskoršom období, a protilátky triedy A a M, detekované v rekombinantných testovacích súpravách novej generácie, ktoré umožňujú nájsť protilátky v najskorších štádiách (inkubačná doba - „Seronegatívne okno“). Od IFA možno očakávať tieto možnosti odpovede:

1. Primárny pozitívny výsledok: krv sa musí opätovne skontrolovať na testovacom systéme toho istého typu, ale pokiaľ je to možné, na inej šarži a inou osobou (laboratórny asistent);
2. Opakovaný (+) predpokladá nový odber krvi od pacienta s vyšetrením podobným primárnej analýze;
3. Ďalší pozitívny výsledok je predmetom referenčnej analýzy, pri ktorej sa používajú vysoko špecifické testovacie súpravy (2 - 3 ks);
4. Pozitívny výsledok v obidvoch (alebo troch) systémoch je odoslaný na imunoblotovanie (rovnaká ELISA, ale vykonáva sa individuálne na testovacích súpravách zvlášť vysokej špecificity).

Záver o infekcii HIV sa robí iba na základe imunoblottingu. Rozhovor s infikovanou osobou prebieha v úplnej dôvernosti. Odhaľovanie lekárskych tajomstiev v Rusku, ako aj v iných krajinách, podlieha trestnému stíhaniu.

Analýzy na chlamýdie a cytomegalovírusy pomocou enzýmového imunotestu si tiež získali osobitnú obľubu v dôsledku skutočnosti, že môžu určiť čas infekcie, štádium choroby a účinnosť terapeutických opatrení.

Po zavedení je možné pozorovať aj výskyt protilátok rôznych tried v rôznych fázach patologického stavu spôsobeného infekčným činiteľom:

• IgM je možné zistiť už sedem dní po infekcii;
• IgA znamená, že infekcia v tele žije už viac ako mesiac;
• IgG potvrdzuje diagnózu chlamydií, pomáha monitorovať liečbu a určovať jej účinnosť. Malo by sa poznamenať, že protilátky triedy G zostávajú a cirkulujú v tele bez ohľadu na vek choroby, a preto je potrebné správne rozložiť analýzu na zohľadnenie referenčných hodnôt (noriem), ktoré sa, samozrejme, líšia pre každú CDL: berúc do úvahy značku testovacieho systému a špecifickosť reagencií zahrnuté v sade. Hodnoty noriem sa zadávajú do formulára vedľa výsledku testu ELISA.

Pokiaľ ide o, tu je to trochu iné: protilátky triedy M sa objavia približne za mesiac a pol, to znamená, že pozitívny výsledok (IgM +) sa stane vo fáze primárnej infekcie alebo po reaktivácii latentnej infekcie a zostáva tak od 4 mesiacov do 6 mesiacov.

Prítomnosť protilátok triedy G je charakteristická pre vznik primárnej akútnej infekcie alebo reinfekcie. Analýza uvádza, že vírus existuje, ale neposkytuje informácie o štádiu infekčného procesu. Medzitým stanovenie normy titra IgG tiež spôsobuje ťažkosti, pretože úplne závisí od imunitného stavu konkrétnej osoby, ktorá je však stanovená detekciou imunoglobulínov triedy G. Vzhľadom na toto správanie sa protilátok pri diagnostike CMVI je potrebné posúdiť schopnosť protilátok triedy G interagovať s CMV, aby sa „neutralizoval“ neskôr (AT avidita). V počiatočnom štádiu ochorenia sa IgG veľmi zle viaže na antigény vírusu (nízka avidita) a až potom začnú vykazovať aktivitu, preto môžeme hovoriť o zvýšení avidity protilátok.

Dá sa hovoriť dlho a veľa o výhodách enzýmového imunotestu, pretože táto metóda dokázala vyriešiť mnoho diagnostických problémov iba pomocou žilovej krvi. Nie je potrebné dlho čakať, starosti a problémy so zberom materiálu na výskum. Testovacie systémy pre ELISA sa ďalej zdokonaľujú a deň nie je ďaleko, keď test poskytne 100% spoľahlivosť výsledku.

Video: vzdelávací film Moskovskej štátnej lekárskej univerzity. Sechenov na základoch ELISA