Имунно блотиране при диагностициране на ХИВ. Имунно попиване Механизъм за имунно попиване практическа употреба

Имуноблотинг -(от английското "blot" - петно) - метод за идентифициране на антигени (или антитела) с помощта на известни серуми (или антигени). Това е комбинация от гел електрофореза с ELISA. Първоначално бактериалните клетки или вириони се унищожават с ултразвук, а след това всички антигени на вируса или бактериалните клетки се разделят чрез електрофореза и се получава търговски реагент върху специален нитроцелулозен филм. При настройване на имуноблотинг, серумът на пациента се прилага върху филма с известни антигени. След инкубиране и промиване на несвързаните антитела, те започват ELISA - върху филма се прилага антисерум срещу човешки имуноглобулини, белязани с ензим и хромогенен субстрат, който променя цвета си при взаимодействие с ензима. В присъствието на комплекси антиген-антитяло-антисерум към имуноглобулин-ензим се появяват цветни петна върху носителя. Методът на имуноблотинг ви позволява да откривате отделно антитела срещу различни антигени на патогена (например при HIV инфекция имуноблотингът открива антитела срещу gp120, gp24 и други антигени на вируса).

Радиоимуноанализ (RIA)

Методът се основава на реакцията антиген-антитяло, като се използва антиген или антитяло етикет с радионуклид. Като етикет се използват 125I, 14C, 3H, 51Cr и други радионуклиди. Получените имунни комплекси се изолират от системата и радиоактивността им се определя на броячи (β-лъчение). Интензитетът на радиация е право пропорционален на броя на свързаните молекули на антигена и антителата.

Широко разпространена версия на RIA в твърда фаза, използваща белязани антитела или антигени, сорбирани в ямките на полистироновите панели.

RIA се използва за откриване на антигени на микроби, вируси, различни хормони, ензими, лекарствени вещества, имуноглобулини, както и други вещества, съдържащи се в тестовия материал в минимални концентрации от 10-12-10-15 g / l.

Контролни въпроси

Реакция на имунна бактериолиза: каква е тази реакция; какво е антиген, какво е антитела, механизъм на реакцията, методи за установяване, практическо приложение. Реакция на имунна хемолиза: необходими съставки, начин на закрепване; контроли, практическо приложение. Реакцията на локална хемолиза в гела (реакция на Jerne): принципът на реакцията, методът на установяване, практическото приложение. Реакция на свързване на комплемента: принципът на реакцията; какво се образува, когато имунният серум взаимодейства със специфичен антиген; какво се случва с комплемента, ако присъства по време на това взаимодействие? Каква е съдбата на комплемента, ако няма специфичен афинитет между антигена и антителата? Каква реакция може да се използва, за да се определи какво се е случило с комплемента; защо се използва тази конкретна реакция; какъв е видимият положителен резултат от RSK? Защо? Какво свойство на комплемента се използва в първата фаза на CBC? Във втората фаза? Ако крайният резултат от CSC е хемолиза, какво означава това - положителен или отрицателен? Обяснете резултатите: RSK + + + +, RSK + + +, RSK + +, RSK +. Назовете съставките на първата RSC система и съставките на втората RSC система. Защо тестовият серум трябва да бъде инактивиран? Как се титрира комплемента? Хемолитичен серум: какво съдържа, как се получава, какъв е титърът и как се определя? Какви животни се използват за получаване на RAC компоненти? Методология за настройка на RSC на студено. При стадиране на коя от изброените реакции е необходимо участието на комплемента: преципитация, флокулация, аглутинация, откриване на непълни антитела, имунна бактериолиза, имунна хемолиза, Yerne, CSC? Реакция на имунофлуоресценция (RIF) - посочете последователността на събитията в директната реакция на Кунс; необходими съставки. Какво е антиген, какво са антитела, с какво са белязани антителата, как се взема предвид резултатът от реакцията, как изглежда положителният резултат? Практическо приложение - Какво може да се определи с тази реакция? Индиректна имунофлуоресцентна реакция - посочете последователността на събитията за тази реакция, необходимите съставки, какъв е антигенът, кои имунни серуми се използват; практическа употреба; предимството на индиректния RIF пред директната реакция. Ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) - принципът на реакцията; необходими съставки; посочете последователността на събитията при провеждане на реакция с цел откриване на антиген в тестовия материал; необходими съставки; какво се случва с положителен резултат, как изглежда? Посочете последователността на действията при настройване на ELISA с цел откриване на антитела в тестовия серум; необходими съставки; какво се случва, ако резултатът е положителен? Имуноблоттинг - принципът на реакцията; основни стъпки; необходими съставки; как се отчита резултатът; ползите от реакцията. Радиоимуноанализ (РИА) – кои са основните етапи на реакцията; с какво са белязани антителата или антигените, как се взема предвид резултатът? Имуноелектронна микроскопия – принципът на метода; основни стъпки; необходими съставки; с какви антитела са белязани; как се взема предвид резултатът от реакцията. Имобилизационни реакции - принципът на метода, техниката на поставяне, компонентите, отчитането на резултатите.

Задачи за изпълнение в процеса на самообучение.

Попълнете таблицата "Реакции на имунитета" за реакциите, обхванати в тази тема.

Имунитетни реакции

Ученическа работа в практически урок

Започнете работата веднага с настройката на 1-ва фаза на RSK, но я запишете в бележника по-късно (вижте по-долу).

1. Реакция на имунна хемолиза. Вижте демонстрационна реакция на имунна хемолиза, очертайте под формата на диаграма, обяснете резултата в експериментални и контролни епруветки.

2. Реакция на свързващия комплемент

а) разглобете RSK според таблицата;

б) начертайте в тетрадка схема за настройка на DSC под формата на таблица;

в) поставете втората фаза на DSC (първата фаза се поставя в началото на урока);

г) разглобява необходимите диагностични препарати за RAC;

д) вземете предвид резултата. Формулирайте заключение за наличието на специфични антитела в изследвания серум.

3. Реакция на имунофлуоресценция. Проучете таблицата, начертайте схема за настройка на реакцията в тетрадка; погледнете диагностичните серуми; определете какво съдържа серумът, как се приготвя, за коя реакция (пряка или индиректна RIF) се използва. Вижте демонстрационния резултат RIF във флуоресцентен микроскоп.

4. Ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA). Начертайте в тетрадка схема за провеждане на реакция в два варианта: за откриване на антиген в тестовия материал и за откриване на антитела в серума. Прегледайте комплекта с инструменти за диагностика на ХИВ и хепатит B. Определете какво съдържа всяка съставка и за какво се използва.

5. Имуноблотинг. Направете схема за инсцениране на реакцията в тетрадка; гледайте демото - резултатът от реакцията.

6. Радиоимуноанализ (RIA). Начертайте схемата на реакцията в тетрадка.

7. Имунна електронна микроскопия (IEM). Гледайте демонстрацията - резултатът от реакцията, начертайте реакционната схема в тетрадка, посочете антигена (вируса) и белязаните антитела със стрелките.

Имуноблотингът е високочувствителен метод за откриване на протеини, базиран на комбинация от електрофореза и ELISA или RIA. Имуноблотингът се използва като диагностичен метод за HIV инфекция и др.

В общ смисъл имуноблотингът се разбира като анализ на смес от протеини, прехвърлени върху твърда мембранна подложка, към която те се свързват чрез ковалентни връзки, с последващо имунооткриване.

Възможно е да се анализира смес от протеини директно приложени към субстрат - дот блот анализ - или след предварителното му фракциониране чрез методи на електрофокусиране, дискова електрофореза или двуизмерна електрофореза - Western blotting.

Патогенните антигени се разделят чрез електрофореза в полиакриламиден гел, след което се прехвърлят от гела върху активирана хартия или нитроцелулозна мембрана и се развиват с помощта на ELISA.

Фирмите произвеждат такива антигенни блотирани ленти. Серумът на пациента се нанася върху тези ленти. . След това, след инкубация, несвързаните антитела на пациента се отмиват и се прилага серумът срещу човешки имуноглобулини, белязани с ензима. . Комплексът, образуван върху лентата (антиген + антитяло на пациента + анти-човешко Ig антитяло) се открива чрез добавяне на хромогенен субстрат, който променя цвета си под действието на ензим.

Тази методология се използва също за избор на клонове на бактерии, фаги или вируси, експресиращи продуктите на целевите клонирани гени.

Прехвърлянето на протеини към мембраната се извършва или пасивно, или с помощта на оборудване за електротрансфер. Ефективността на прехвърлянето на протеини към мембраната се влияе от много фактори, като молекулното тегло на протеините, порьозността на гела, времето за трансфер и състава на използвания буферен разтвор (транс-буфер).

В зависимост от задачите и условията на експеримента се избират условията на трансфер, които осигуряват най-добри резултати. Като субстрати обикновено се използват нитроцелулоза, поливинилиден дифлуорид (PVDF) или положително заредени найлонови мембрани. Нитроцелулозата може да свърже до 80 - 100 μg протеин на 1 cm2.

Нискомолекулните протеини (с молекулно тегло по-малко от 20 kDa) могат да бъдат загубени в резултат на промиване и е възможно предварително да се изследва полиморфизмът на определени генетични локуси по дължините на съответните рестрикционни ДНК фрагменти.

Освен това, използвайки Southern хибридизация, може лесно да се установи дали целевият ген има място на хидролиза от определена рестрикционна ендонуклеаза във вътрешната си част, което позволява да се избере оптималната стратегия за клониране на изследваната област на генома.

РНК молекулите могат също да бъдат прехвърлени от агарозен гел към нитроцелулозен филтър, като се използва подобна схема. Този метод се нарича Northern blotting, за разлика от Southern blotting, тъй като името Southern на английски означава „южен“.

Прехвърлянето на протеини върху филтрите от гела е подходящо наречено Western blotting. Големи протеини (над 100 kDa), денатурирани в разтвор на натриев додецил сулфат (SDS), могат да бъдат лошо прехвърлени към мембраната, ако етанолът присъства в трансбуфера. Алкохолът значително подобрява трансфера на протеини от SDS-полиакриламиден гел, но стеснява порите в гела, което води до задържане на големи протеини.

PVDF мембраната е оптимизирана за имунооткриване и е способна да задържа специфично свързани протеини до 160 μg / cm2 с много ниско ниво на неспецифично свързване.

Имуноблотинг

Важно свойство на тази мембрана е нейната многократна употреба. Найлоновите мембрани Zeta-Probe ефективно свързват SDS протеини в отсъствие на алкохол и това свързване е устойчиво на последващи обработки. Протеините с ниско молекулно тегло също се задържат ефективно. Поради високия си капацитет на свързване - около 480 μg протеин на 1 cm2 - мембраните Zeta-Probe позволяват откриване на следи от протеин в анализираните смеси.

След като антигенът се имобилизира върху мембраната, останалите места на свързване се блокират с разтвори на желатин, или говежди серумен албумин, или обезмаслено мляко.

След това мембраната се инкубира в разтвор на поликлонални или моноклонални антитела към изследвания антиген. След промиване на несвързаните антитела, мембраната се инкубира в разтвор на вторични антитела, които са конюгат на ензимите алкална фосфатаза (АР) или пероксидаза от хрян (HRP) с антивидови антитела (кози антитела към имуноглобулини на заек, мишка , или човешки) (Staphylococcus aureus протеин) или G (Streptococcus sp. протеин), които имат висок афинитет към Fc областта на имуноглобулините.

Откриването на образуваните имунни комплекси се извършва по химичен или хемилуминесцентен метод. Субстратите за химичната реакция при използване на конюгати на алкална фосфатаза са 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфат (BCIP) или тетразолиево синьо (NBT), а когато се използват конюгати на пероксидаза от хрян, 4-хлоро-1-нафтол и водороден пероксид.

В резултат на ензимни реакции върху мембраната на мястото на локализация на комплекса антиген-антитяло се образува цветна ивица или петно.

Чувствителността на този метод е 100 pg протеин при използване на AR конюгати и 100-500 pg при използване на HRP конюгати. Хемилуминесцентното откриване на имунни комплекси позволява определянето на по-малко от 5 pg антиген. Принципът на този метод е, че когато HRP реагира с водороден пероксид и цикличен диацилхидразин луминол, се излъчва светлина с дължина на вълната 428 nm, която може да бъде фиксирана върху фоточувствителен филм.

Реакцията на имуноблотинг (RI) е разработена на базата на ELISA. Това е най-специфичният и чувствителен метод за имунохимичен анализ. Имуноблотирането (от англ. blot - намокря се, оцветявам) комбинира ELISA с електрофореза. Използва се за откриване не на сложни антитела срещу HIV, а на антитела към неговите отделни структурни протеини (протеини-p24, гликопротеини-gp120, gp 41 и др.). Отнася се до експертни (потвърждаващи) реакции при диагностициране на HIV инфекция.

Реакцията се извършва на няколко етапа:

Вирусът се разрушава на компоненти - антигени (p24, gp120, gp 41 и др.), които се подлагат на електрофореза в полиакриламиден гел, тоест разделяне на антигените на фракции по молекулно тегло.

2. Гелът се покрива с нитроцелулозна мембрана и антигенните фракции се прехвърлят към него с помощта на електрофореза. Нитроцелулозата се държи като попивателна хартия. Мембраната се нарязва на ленти (ленти). Фирмите произвеждат такива антигенни блотирани ленти.

Имуноблоттинг - допълнителен индиректен метод

Ленти с нанесени върху него антигени на HIV се потапят в серума на пациента и след това се измиват от несвързания материал.

4. Лентите се инкубират с белязан с пероксидаза антиглобулинов серум и се промиват.

Добавете субстрата и отбележете броя на оцветените фракции (петна), които съответстват на зоната на локализация на AG-AT комплекса.

Наличието на ленти в определени части на лентата потвърждава наличието на антитела срещу строго определени HIV антигени в изследвания серум. Резултатът от имуноблотинга се счита за положителен, ако върху мембраната се виждат ленти, съответстващи на всеки два от трите HIV антигена - p24, gp41 и gp 120 (фиг. 37).

ФИГУРИ

СПИСЪК НА ИЗПОЛЗВАНАТА ЛИТЕРАТУРА

Основна литература

Медицинска микробиология, вирусология и имунология: учебник за студенти по медицина. университети 2-ро изд., рев. и добавете. - 702 стр. Изд. А.А. Воробьов. М.: МВР, 2012.

2. Микробиология, вирусология и имунология: ръководство за лабораторни изследвания: учебник / (В. Б. Сбойчаков и др.); изд. В.Б.Сбойчакова, М.М.Карапац. - М.: ГЕОТАР-Медиа, 2014.- 320-те: Ил.

3. Медицинска микробиология, имунология и вирусология [Електронен ресурс]: учебник за мед.

университети - 760 стр. - Режим на достъп: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN9785299004250.html Коротяев А.И., Бабичев С.А. SPb .: Спецлит, 2010.

4. Медицинска микробиология, вирусология и имунология [Електронен ресурс]: учебник: в 2 тома / Т. 1. - 448 с. - Режим на достъп: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142241.html Zverev V.V., Boychenko M.N.

М.: Геотар Медиа, 2010.

5. Медицинска микробиология, вирусология и имунология [Електронен ресурс]: учебник: в 2 т. Т. 2. - 480 с. Режим на достъп: http://www.studmedlib.ru/book/ISBN97859704142242.html Zverev V.V., Boychenko M.N. М.: Геотар Медиа, 2010.

допълнителна литература

1. Имунодиагностични реакции: учебник / комп.: GK Davletshina, ZG Gabidullin, AA Ahtarieva, MM Tuigunov, AK Bulgakov, TASavchenko, R.F. ...

Хуснаризанова, Ю. З. Габидулин, М. М. Алсинбаев - Уфа: Издателство на Държавната бюджетна образователна институция за висше професионално образование BSMU на Министерството на здравеопазването на Русия, 2016. - 86с.

2. Характеристики на някои свойства, които определят патогенния потенциал на съвместно култивирани вариации на бактерии Enterobacter, Citrobacter, Serratia, E. coli, Proteus: научна публикация / Ю. З. Габидулин, Р. С. Суфияров, II Долгушин - Уфа, 2015. - 250 с.

Начало »Имуноблот - какво е това? Имуноблот при диагностициране на инфекциозни заболявания

Имуноблот - какво е това? Имуноблот при диагностициране на инфекциозни заболявания

Какво е имуноблот? Това е често срещан метод за лабораторна диагностика на човешки вирусни инфекции. Това е един от най-точните и надеждни начини за откриване на наличието на ХИВ.

За надеждност той е дори по-голям от ензимно-свързан имуносорбентен анализ (elisa). Резултатите от имуноблота се считат за неоспорими и окончателни.

Имуноблот - какво е това? За да разпознаете човек като ХИВ, трябва да се подложите на лабораторен тест за наличие на антитела в кръвния серум.

Методът Western blot се нарича още Western blot (Western blot). Използва се за откриване на човешки вирусни инфекции като допълнителен експертен метод. Това е необходимо за потвърждаване на ELISA - лабораторен тест, който ви позволява да определите наличието на антитела срещу ХИВ в кръвта. Имуноблот за двойна проверка на положителния ELISA.

Смята се за най-чувствителния, сложен и скъп.

Цел

Какво е имуноблот? Това е техника за лабораторни изследвания на кръвен серум за наличие на антитела срещу вируса.

По време на специални изследвания общите вирусни протеини в гела и върху нитроцелулозните мембрани.

Имуноблоттинг (откриване на антитела в серумите на пациенти срещу определени антигени на патогена)

Процедурата на Western blotting на срезове е предназначена за определяне на HIV инфекция на различни етапи. На първия етап пречистеният вирус от съставните му части се подлага на електрофореза и антигените, включени в него, се разделят по молекулно тегло.

Вирусът на човешката имунна недостатъчност се размножава в живите клетки, заложен в неговата генетична информация. На този етап човекът става носител на ХИВ вируса, ако сте били заразени.

Спецификата на това заболяване е, че не се проявява дълго време. Вирусът унищожава лимфоцитите, като по този начин имунитетът на човек намалява и тялото става неспособно да се бори с инфекциите.

Ако ХИВ се лекува правилно и навреме, пациентът ще доживее до дълбока старост. Липсата на лечение неизбежно води до смърт. От момента на заразяване, но без лечение, максималният период е не повече от десет години.

Особености

Имуноблот анализът е надежден метод, който ви позволява да определите наличието на антитела срещу HIV антигени от първи и втори тип.

Ако човек е заразен, след две седмици антителата могат да бъдат открити много по-късно. Характерна особеност на ХИВ е, че количеството антитела бързо се увеличава и остава в кръвта на пациента. Дори и да са налице, болестта може да не се прояви по никакъв начин в продължение на две или повече години. Методът ELISA не винаги показва точно наличието на заболяването, което изисква потвърждение на резултатите от PCR и Western блот секции, ако ензимно-свързаният имуносорбентен анализ покаже положителен резултат.

Показания за

Какъв вид „имуноблот“ вече е открит, но кои са въведени в изследването?

Причината за изследване за имуноблот на човешкия имунодефицитен вирус (HIV) ще бъде положителен резултат ELISA. Необходимо е да се премине през ензимно-свързан имуносорбентен анализ при пациенти, на които предстои операция. Освен това трябва да направите анализ на жени, които планират бременност, както и на тези, които водят безразборен полов живот. Секциите по Western blot се предписват на пациенти с HIV инфекция, ако резултатите от elisa са двусмислени.

Причината за посещение при лекар могат да бъдат следните тревожни симптоми: бърза загуба на тегло; слабост, загуба на функция; нарушения на червата (диария), която продължава три седмици; дехидратация; треска; подути лимфни възли в тялото; развитие на кандидоза, туберкулоза, пневмония, токсоплазмоза, обостряне на херпес.

Пациентът не трябва да се подготвя, преди да дари венозна кръв.

Не яжте 8-10 часа преди изследването. Не се препоръчва да пиете алкохол и кафе напитки, да спортувате усилено или да изпитвате безпокойство в деня преди кръводаряването.

Къде да направя анализа?

Къде мога да се тествам за ХИВ?

ELISA, имуноблот анализ, извършен в градски частни клиники, резултатите се дават през деня. Възможна е и спешна диагностика. В държавните институции медицинските тестове elisa и Western blot секциите са безплатни, в съответствие със законодателството на Руската федерация.

Задължителен скрининг за инфекциозни заболявания на бременни жени и пациенти, които се нуждаят от хоспитализация или операция Как се провежда това изследване?

Как да се проведе ELISA? Положителен/отрицателен имуноблот потвърждава или опровергава резултатите от елиза. Процедурата е доста проста. Специалистът извършва събиране на венозна кръв, което отнема по-малко от пет минути.

След вземане на пробата мястото на инжектиране трябва да се дезинфекцира и да се запечата с пластир. Вземането на проби се извършва на празен стомах, така че след процедурата няма да навреди да хапнете блокче черен шоколад или сладка топла напитка.

За да получите направление за безплатен тест в обществено здравно заведение, трябва да посетите лекар.

Като цяло имуноблотът не се различава от другите тестове за вземане на кръвни проби. Методологията на изследването е проста. Ако в кръвта на човек има вирус, тялото започва да произвежда антитела, за да го унищожи. За всеки вирус има много протеинови антигени. Откриването на тези антитела е в основата на метода на Western blot раздел. Цена

Колко анализи? Имуноблот ХИВ се отнася до евтини изследвания.

Средно скрининговите методи за имуноанализ варират от 500 до 900 рубли. Секциите за Western blot са проверка за проучване, чиято цена варира от три до пет хиляди рубли. По-сложните методи са много по-скъпи. Например, за анализ на полимеразна верижна реакция (PCR), ще трябва да платите около 12 000 рубли.

Интерпретация на резултатите

Най-често срещаните методи за диагностициране на HIV инфекция са ензимен имуноанализ и имуноблот.

Те се използват за определяне на антитела срещу вируса на човешкия имунодефицит в серума. Инфекцията обикновено се потвърждава чрез два теста: скрининг и потвърждаващ. Интерпретацията на резултатите трябва да се извършва от лекаря, той диагностицира и предписва лечение. Ако имуноблотът е положителен, това означава, че в човешкото тяло има вирус.

Положителният резултат не трябва да е причина за самолечение, тъй като всеки пациент може да има своя собствена картина на заболяването.

Качественият анализ включва скрининг и сертифициране. Ако не се открие вирус в пациента, резултатът е отрицателен. Когато този сертификат бъде открит, се извършват допълнителни скринингови тестове. Имуноблот анализ, който потвърждава или опровергава скрининга. Ако се появят тест ленти в определени области на потъмняване (протеинова локализация), се поставя диагноза ХИВ.

Ако резултатите са съмнителни, тогава тестовете се извършват в рамките на три месеца.

За да предотвратите заразяване с вируса на човешкия имунодефицит, е възможно, ако спазвате определени правила: избягвайте случайни полови контакти, използвайте презервативи при контакт, не употребявайте наркотици.

Ако заболяването се открие при бременна жена, е важно да се спазват препоръките на лекуващия лекар, да не се забравят тестовете за наличие на вирус.

Какво е Western blotting?

Идентифицирането на протеини в сложни смеси или екстракти от различни тъкани е една от най-честите задачи. Използвайки такъв инструмент като специфични антитела, е възможно да се идентифицира изследваният протеин с минимално време и разходи.

При метода Western blotting, на първия етап, смес от протеини се разделя чрез електрофореза в присъствието на натриев додецил сулфат (SDS) и след това се прехвърля върху нитроцелулозна мембрана чрез електроблотиране.

Същността на този метод е, че гелът след електрофореза се поставя върху нитроцелулозна мембрана между слоеве филтърна хартия. Сглобеният по този начин „сандвич“ се поставя в електрическо поле, така че комплексите протеин-SDS да се движат през геловата плоча и да се имобилизират (в резултат на неспецифична сорбция) върху повърхността на нитроцелулозната мембрана.

При свързването на комплекса протеин-SDS с нитроцелулозната мембрана участват основно електрически сили, като това взаимодействие е многоточково и води до „разпръскване“ на протеини по повърхността на мембраната. Така, след електротрансфер, получаваме реплика на гел върху нитроцелулоза с протеини, подредени по същия начин, както в полиакриламиден гел.

След SDS - електрофореза, електротрансфер и сорбция на протеини от гела върху нитроцелулозна мембрана, третичната конформация на протеина се променя значително, ако като цяло е правилно да се говори за съществуването на третична структура за протеина след такова твърдо третиране . Следователно, за имунохимичното откриване на изследвания протеин обикновено се използват само моно- или поликлонални антитела, специфични за линейните области на протеиновата молекула.

51. Имуноанализ, имуноблотинг. Механизъм, компоненти, приложение.

Антителата, специфични за конформационни епитопи (или региони, които включват контакти между субединици) обикновено не са подходящи за използване в Western blotting.

След трансфера на протеини, мембраната се инкубира последователно с антитела, специфични за изследвания протеин, и след това с вторични антитела, специфични за Fc фрагментите на първични антитела, конюгирани с ензимен (или някакъв друг) етикет (фиг.

1 А). В случай, че първичните антитела, специфични за изследвания антиген, са директно конюгирани с етикета, вторични антитела не са необходими (фиг. 1 Б). Имунните комплекси, образувани на мястото на локализация на изследвания протеин, се "проявяват" с помощта на хромогенен субстрат (в зависимост от вида на етикета).

Чувствителността и специфичността на метода силно зависят от това кои антитела се използват в изследването.

Използваните антитела трябва да са специфични за уникална аминокиселинна последователност, характерна само за изследвания протеин. В противен случай е възможно взаимодействието (особено в случай на груби протеинови екстракти) на антитела с няколко протеинови молекули, което от своя страна ще доведе до появата на няколко цветни ленти върху мембраната.

В този случай идентифицирането на изследвания протеин често е трудно или дори невъзможно.

Вторият важен фактор, който трябва да имате предвид при избора на антитела, е афинитетът. Колкото по-висок е афинитетът на използваните антитела, толкова по-ярки и по-ясни са белтъчните ленти, толкова по-висока е чувствителността на метода. При използване на антитела с висок афинитет може да се постигне чувствителност от 1 ng и дори по-висока.

За да се визуализира резултатът от взаимодействието между мембранно-свързания антиген и антителата, се използват вторични антитела, конюгирани със средства, способни да дадат определен сигнал при определени условия.

Обикновено като такъв агент се използва ензим (пероксидаза или фосфатаза), чийто реакционен продукт има цвят и се утаява върху мембраната под формата на неразтворима утайка.

При този метод също е възможно да се използват флуоресцентни етикети.

Ориз. 1. Схема на имунохимично оцветяване на изследвания протеин: А - използване на вторични антитела, конюгирани с ензимен етикет; B - първичното антитяло е директно конюгирано с ензимен етикет.

протокол:

I. Приготвяне на гел и мембрана и електротрансфер на протеин

След електрофореза, полиакриламидният гел се поставя във вана с блотиращ буфер (25 mM Tris, рН 8.3, 192 mM глицин, 10% етанол).

Два листа филтърна хартия, изрязани по формата на попиващата касета и навлажнени с попиващ ​​буфер, се поставят върху частта на касетата, която ще е обърната към анода. След това върху филтърната хартия се поставя нитроцелулозна мембрана, предварително навлажнена със същия буфер, като се гарантира, че между мембраната и хартията няма въздушни мехурчета.

След това гелът трябва внимателно да се постави върху мембраната, като отново се обръща особено внимание на липсата на въздушни мехурчета между гела и мембраната. Формирането на сандвич се завършва от два слоя навлажнена филтърна хартия, които се поставят върху повърхността на гела (фиг. 2). Полученият сандвич се захваща в касета и се поставя между електродите, така че мембраната да е обърната към анода.

Ориз. 2. Схема на електропреноса на протеини към мембраната.

II. Електропренос

Електропреносът на протеини към нитроцелулозна мембрана се извършва в буфер, съдържащ 25 mM Tris, pH 8.3, 192 mM глицин, 10% етанол за 30-50 минути при постоянно напрежение 100 V.

Времето на електротрансфера зависи от размера на прехвърлените протеини; колкото по-голям е протеинът, толкова по-дълго отнема електропреносът. Качеството на електротранспорта и местоположението на протеиновите ленти се оценяват чрез оцветяване на нитроцелулозната мембрана с 0,3% разтвор на Ponceau S в 1% оцетна киселина. Преди да се извърши имунохимично оцветяване, мембраната трябва да се измие няколко пъти със слабо алкален воден разтвор на Tris, за да се отстрани багрилото, свързано с протеините.

III. Имунохимично оцветяване на протеини, имобилизирани върху нитроцелулозна мембрана

За блокиране на местата на неспецифично свързване на антитела, мембраната се инкубира при постоянно разбъркване при стайна температура за 30 минути в PBST (за по-добро блокиране може да се използва разтвор на PBST, съдържащ 10% обезмаслено мляко на прах).

След блокиране, мембраната се инкубира за един час при стайна температура с постоянно разбъркване в PBST, съдържащ 1-10 μg / ml специфични антитела.

Оптималната концентрация на антителата се избира емпирично и зависи от афинитета на взаимодействието на антителата с антигена.

В края на инкубацията, измийте мембраната 5 пъти с PBST и прехвърлете в разтвор на вторични антитела, конюгирани с пероксидаза от хрян. Разреждането на конюгата обикновено се посочва от производителя на опаковката или се избира емпирично от изследователя. В разтвор на вторични антитела, инкубирайте мембраната за 1 час при постоянно разбъркване.

След цялостно промиване (смяна на буфера поне 5-6 пъти), PBST мембраната се прехвърля в хромогенен субстратен разтвор, съдържащ 3 mg диаминобензидин (DAB) и 10 μl 30% водороден пероксид в 10 ml 0,1 M Tris-HCl рН 7,6.

Инкубирането се извършва при разбъркване в продължение на 5 до 10 минути. След края на инкубацията със субстрата, мембраната трябва да се измие с PBST, да се изсуши чрез попиване с филтърна хартия и веднага да се направи електронно копие чрез сканиране в цвят. Ако мембраната изсъхне напълно, оцветените протеинови ивици избледняват и изображението е по-малко ярко и контрастно.

Забележка: DAB е токсично вещество и потенциален канцероген. Носете само гумени ръкавици!

Имуноблоттингът е диагностична мярка, провеждана в лабораторни условия, според резултатите от която се откриват антитела срещу патогени на различни заболявания. Един от тях е вирусът на човешкия имунодефицит. Веднага трябва да се отбележи, че такова изследване като HIV имуноблотинг е допълнителна мярка, която се предписва за потвърждаване на положителен резултат ELISA.

Вирусът на човешкия имунодефицит е бавно прогресираща инфекция. От момента, в който патогените попаднат в тялото и до появата на първите симптоми, често минава много време, което може да достигне няколко години.

В началния етап на развитие клиничните прояви може да липсват. Повишаване на общата температура, неразположение, възпалено гърло, симптоми, характерни за ХИВ инфекция, човек бърка с обикновена настинка, но инфекцията продължава да прогресира. Ето защо специалистите от ХИВ центровете препоръчват цялостна диагностика в такива случаи:

• ако сте имали незащитен полов акт с нов партньор;
• ако медицинска спринцовка или игла за еднократна употреба са били използвани повторно;
• ако наскоро сте си направили татуировка или пиърсинг;
• ако се открие друга инфекция, чийто път на предаване е полов (например сифилис, бактериална вагиноза, гонорея);
• ако е имало контакт със заразен човек.

Имуноблот за HIV се извършва с помощта на серум или кръвна плазма. Изследването на една лента изисква 1,5-2 ml кръв или 15-25 μl серум.

Диагностичната мярка позволява откриване на антитела не само към вируса на човешкия имунодефицит, но и към други патогени. По време на изследването се използват специални комплекти, които са характерни за различни заболявания, например:

• HSV1 и HSV2 IgM / IgG (за откриване на херпесвирусна инфекция);
• TORCH IgM профил (за откриване на токсоплазмоза, рубеола, цитомегаловирусна инфекция, HSV 1 и HSV 2);
• EBV IgMTIgG (за откриване на вирусна инфекция на Epstein-Barr);
• HCV IgG (за откриване на вирусен хепатит тип С).

Резултатът от имуноблотинга може да бъде положителен (при откриване на антитела) и отрицателен (когато в биологичния материал няма антитела), както и неопределен, фалшиво положителен и фалшиво отрицателен.

Къде можете да се тествате за вирусна инфекция и какво да правите след това

Всяка клиника, частна лаборатория, болница, клиника е специализирана в подобна диагностична мярка. Можете да се тествате в център за тестване на ХИВ. Няколко частни клиники предлагат домашно консултиране и тестване за СПИН и ХИВ.

ВАЖНО! След като получите резултатите от изследването, трябва да се свържете с Вашия лекар за назначаване на подходяща терапия.

Положителни проби

Ако резултатите от имуноблота са положителни, това не означава, че в тялото се развива ХИВ инфекция. За потвърждаване на диагнозата се предписват други изследвания, например непряка имунофлуоресценция.

Въпреки че имуноблот методът е силно чувствителен, поради определянето на клас G имуноглобулини е възможен фалшиво положителен резултат през първите 3 седмици след заразяването. В този случай тестът се повтаря след определено време.

Всички причини за фалшиво положителен резултат са неизвестни. Най-честите източници са бременност и скорошни имунизационни ваксини. Ако след известно време след излагане на такива фактори имуноблотът за ХИВ все още е положителен, това означава, че лицето е заразено.

Отрицателен резултат

Имуноблотът може да даде отрицателен резултат, което сигнализира за отсъствието на антитела срещу HIV инфекцията в организма и като следствие за пълно здраве.

Отрицателен имуноблот често се наблюдава по време на "периода на прозореца" (през първите 3 месеца между инфекцията и появата на антитела в кръвта). През този период тестът не открива съответните антитела, но в друга течност (сперма, вагинално течение) е възможно да се открият в голям обем.

Как се прави анализът

Имуноблот ви позволява да идентифицирате антитела чрез изследване на кръв и използване на гел електрофореза.

На първо място се извършва унищожаването на бактериални клетки или вириони чрез ултразвук, след което чрез електрофореза се отделят всички антигени на вируса или бактериалните клетки. Резултатът е търговски реагент, който се поставя върху специален нитроцелулозен филм.

По време на производството на имуноблотинг, тестовият серум също се прилага върху материала с известен антиген. След инкубиране и промиване на несвързани антитела се започва ензимен имуноанализ, имуноглобулини се прилагат върху серума, който е белязан с ензим, и хромогенен субстрат, който променя цвета си при контакт с ензима.

Ако има антитела, върху средата се образуват петна.

Вземането на кръв се използва за имуноблотинг на ХИВ

Линеен метод

Linear blot за HIV е индиректно имунологично изследване, чрез което се получава качествен индикатор за IgG автоантитела.

В хода на имунологично изследване се използва вирусна субстанция или антигени от ХИВ формат. В лабораторията се комбинират HIV протеини и индивидуални антитела, получени от кръвен серум. След това инкубацията се извършва чрез добавяне на белязани антитела и човешки имуноглобулин.

Диагностика на ХИВ при новородени

В тялото на дете под 9 месеца, родено от заразена жена, има антитела срещу ХИВ на майката, което води до фалшиво положителен резултат ELISA. Поради тази причина се дава предпочитание на вирусологичните тестове – количествен анализ на РНК и ДНК PCR. Културният метод за диагностициране на инфекцията е по-чувствителен.

ВАЖНО! Показания за провеждане на диагностични мерки за идентифициране на ХИВ инфекция при новородени са: раждане от заразена жена, получаване на съмнителен резултат от осъществим преди това анализ.

Проучване по време на бременност

Тъй като ХИВ инфекцията, която се развива при бременна жена, може да се предаде на неродено дете, е необходима ранна диагностика на вируса на имунодефицита.

На първо място се извършва ензимен имуноанализ, който се използва като скрининг. Диагностичната мярка помага да се открият антитела срещу инфекция в кръвния серум. Въпреки точните резултати от анализа по време на бременност е необходимо второ изследване.

Един вид ELISA е имунен блот, който често се използва по време на бременност. Според резултатите от диагностиката е възможно да се идентифицират антитела към определени антигени, които се разпределят по молекулно тегло чрез електрофореза.

Как да преминете теста правилно

Имунното блотиране за ХИВ изисква специално обучение, подобно на други методи за диагностициране на заболяване. Ако провеждате някои изследвания и получавате резултатите от определени показатели през целия ден (например реакцията към алерген), тогава трябва да дарите кръв за имунологичен тест само сутрин.

Декодиране на резултатите

ДекриптиранеРезултатите от имуноблота се извършват от лаборант. Ако се открият 2 от 3 протеина HIV-1 или HIV-2, това показва наличието на съответна инфекция в тялото. Изследването се провежда за потвърждаване на положителен ензимен имуноанализ. Следователно, реакцията се проверява за такива протеини като gp120 / 160, gp41 в комбинация с p24. Последните са част от три гена на СПИН – gag pol и env.

Схематично показване на резултатите от имуноблота за ХИВ

Първоначалната диагноза включва изследване на протеини p25, gp110 / 120 и gp160, което показва ранен стадий на развитие на заболяването. При положителен резултат, даден от втория серологичен ензимен имуноанализ, се извършва имуноблот. Ако последният също е положителен, диагнозата ХИВ се потвърждава.

Вероятността за положителен резултат зависи от периода, който е изминал от момента на инфекцията до диагнозата:

• след 28 дни - 60-65%;
• след 42 дни - 80%;
• след 56 дни - 90%;
• след 84 дни - 95%.

Фалшиво положителен резултат е възможен, ако събирането на биологичен материал за по-нататъшна диагностика е извършено по време на бременност, в случай на хормонален дисбаланс, продължително потискане на имунната функция от определени лекарства, които човек приема.

Критерии за оценка на анализа

Резултатите от ELISA и Western blot анализа трябва да отговарят на следните критерии:

• петното от изследвания биологичен материал съвпада с петното на референтната проба;
• Молекулното тегло на основния идентифициран компонент отговаря на изискванията на спецификацията.

Резултатите, получени в специализирана лаборатория, ще бъдат най-точни

Откритият примес и неговото съдържание трябва да отговарят на изискванията на сертификата за референтния материал.

Резултати, които не могат да се интерпретират

В някои случаи имуноблотингът за ХИВ и СПИН не съответства на отрицателен и положителен резултат и лекарят не може да определи истинската причина за съмнителната информация. Инфекцията с различен серотип често е причина за погрешно тълкуване.

За да се премахнат съмненията, PCR и ELISA се провеждат в динамика. При липса на симптоми, характерни за заболяването в продължение на шест месеца и рискови фактори, те говорят за пълно здраве. На този етап диагностичните мерки са завършени.

Съмнителен резултат може да се получи и с развитието в тялото на друго инфекциозно заболяване, раково новообразувание или алергична реакция.

Важно! Ако резултатът е съмнителен, човек не може да бъде донор на кръв и друг биологичен материал.

Типични грешки при диагностициране на HIV инфекция

Събирането на биологичен материал, доставката и регистрацията на материалите, използвани в лабораторната диагностика, трябва да отговарят на следните правила:

1. Изготвя се придружаваща документация, в която се посочват името на тестовата система, нейният срок на годност и партидата.
2. Паспортните данни на субекта, датата и мястото на вземане на биологичния материал са напълно посочени.
3. Серумът се съхранява не по-дълго от установения период, за изследването се взема допустимият обем на биопсия - не по-малко от 2-5 ml.
4. Номерът на флакона съответства на посочения номер в посоката.
5. Събирането на биологичен материал става по установените правила, а именно от кубиталната вена. В изследваната кръв не трябва да има съсиреци.

За събиране на материала се използва суха епруветка. Често се взема кръв от пъпна връв от новородени, което показва такъв факт в посоката.

Типична грешка на лекарите е съхраняването на получения материал повече от 12 часа при стайна температура и повече от 1 ден при температура 4-8 градуса над Целзий. Поради настъпването на хемолиза резултатите от диагностичната мярка се изкривяват.

И така, типичните грешки по време на диагностицирането на ХИВ инфекция включват:

• неправилно събиране на биологичен материал;
• неправилно съхранение на биопсия;
• неправилно транспортиране на диагностични системи;
• дългосрочно съхранение на тестовата система.

Резултатът се влияе дори от качеството на водата, използвана за изплакване на съда, в който е поставен биологичният материал.

След като получи резултатите от изследването, лаборантът трябва да издаде становище за лекаря. Ако диагностиката е извършена през "периода на прозореца", той назначава повторната диагностика след определено време. Във всеки случай, за да се постави диагноза ХИВ инфекция, един имуноблот не е достатъчен. Необходима е цялостна диагностика.

В практиката на лабораторна диагностика на инфекциозни заболявания понякога има нужда да се определят антитела не общо към патогена, а към определени негови протеини (антигени), тоест спектъра на специфични антитела. Ако за тази цел се използва методът на ензимно-свързан имуносорбентен анализ, тогава в този случай е необходимо първо да се изолират и пречистят необходимите антигени от културата на патогена. Получените протеини се прилагат отделно към твърдата фаза. В случай на използване на 96-ямкова плака - един вид антиген във всяка ямка. След това специфичните антитела се определят по индиректен метод.

По наличието на положителна реакция в ямката с един или друг антиген може да се съди за наличието на съответните специфични антитела. Този вид ензимно-свързан имуносорбентен анализ се предлага от производствени фирми, но поради по-голямото информационно съдържание и простотата на самото изследване, методът на имунно блотинг (Western blot) стана широко разпространен.

Имунното блотиране позволява определянето на антитела в кръвния серум едновременно и в същото време диференцирано към всички диагностично значими протеини на патогена. В превод от английски Western blot означава уестърн трансфер (буквално - попиване). Историята на този необичаен термин е следната.

Учен на име E. Southern през 1975 г. е първият, който предлага метод за пренасяне на електрофоретично разделени ДНК фрагменти от гел към мембрана. Според автора методът е наречен Southern blot, което означава „южен трансфер“. Методът за прехвърляне на РНК молекули от своя страна е наречен от специалистите Northern blot - "северен трансфер". Първоначално на шега, а след това това име се заби в официалната научна литература.

G. Toubin през 1979 г. публикува резултатите от първите експерименти за белтъчно блотиране. В продължение на традицията на „географски“ методи за именуване за пренос на биологични макромолекули, този метод става известен като „уестърн“ трансфер – Western blot.

На първия етап от този метод се извършва електрофоретично разделяне на смес от патогенни протеини в полиакриламиден гел в присъствието на натриев додецил сулфат (SDS). SDS, като повърхностно активно вещество, равномерно обгръща протеиновите молекули и придава отрицателен заряд с приблизително еднаква величина на всички тях. Следователно, молекулите се движат в електрическо поле в една посока, а скоростта на движение зависи само от размера на молекулата (молекулното тегло) на протеина.

В резултат на електрофоретичната процедура се получава гел плоча, в дебелината на която са разположени протеини под формата на отделни тънки линейни зони. По посока на движение те се разделят в следния ред: по-близо до старта са протеини с голямо молекулно тегло, от порядъка на 120-150 kDa, а протеините с маса 5-10 kDa са напреднали до финала линия. Във втора стъпка, гел лист се нанася върху лист от нитроцелулоза и структурата се поставя между електродите на източника на постоянен ток. Под действието на електрическо поле протеините преминават от порестия гел към по-плътна мембрана, където са здраво фиксирани.

Полученото петно ​​се третира с блокиращ разтвор, съдържащ антигенно индиферентни протеини и/или нейонни детергенти (Tween 20), които блокират свободни от антиген места върху мембраната. След това мембранният лист се нарязва на тесни ивици, така че всяка лента да съдържа всички антигенни фракции. Описаните стъпки се извършват от производителя.

Търговските тестови системи за определяне на антитела чрез имунен блот съдържат петна (ленти или ленти), готови за анализ. Потребителят извършва определянето на целия спектър от специфични антитела към протеините на патогена, използвайки индиректния метод. Като хромоген за провеждане на цветна (ензимна) реакция се използва разтворимо безцветно вещество, чийто продукт придобива цвят, става неразтворим и се утаява (утаява) върху нитроцелулозата.

В резултат на последователното изпълнение на имунни и ензимни реакции в присъствието на антитела срещу протеините на патогена в тестовата проба, върху петното се появяват тъмни напречни ивици, чието местоположение е разположено в зоната на определени протеини на патоген. Всяка такава лента показва наличието на специфични антитела към съответния антиген. Резултатът от изследване, проведено по метода на имунно блотинг, се издава под формата на списък с антитела към специфични протеини на патогена. Например: "антитела срещу p17 и p24 протеини са идентифицирани."

След развитието, нитроцелулозните петна могат да се съхраняват на сухо за дълго време. Въпреки това, интензивността на цвета е значително отслабена. Мокри петна могат да се снимат или с помощта на скенери да се въведе графичното им изображение в паметта на персоналните компютри. Специални компютърни програми ви позволяват да обработвате получените резултати и бързо да проследявате динамиката на спектъра на антителата по време на динамично наблюдение

Имуноблот (имуноблот) е високоспецифичен и високочувствителен референтен метод, който потвърждава диагнозата при пациенти с положителни или несигурни получени резултати от теста, вкл. с помощта на RPGA или ELISA .

Този метод за откриване на антитела срещу отделни антигени на патогена се основава на ELISA върху нитроцелулозни мембрани, върху които се нанасят специфични протеини под формата на отделни ленти, разделени чрез гел електрофореза. Ако има антитела срещу определени антигени, на съответното място на лентата се появява тъмна линия. Уникалността на имуноблота се състои в неговото високо информационно съдържание и надеждността на получените резултати.

Материал за изследванее човешки серум или плазма. За изследване на една лента са необходими 1,5-2 ml кръв или 15-25 μl серум.

Според препоръката на СЗО Western blotting се използва при диагностицирането на HIV инфекция като допълнителен експертен метод, който трябва да потвърди резултатите от ELISA. Обикновено този метод се използва за двойна проверка на положителния резултат с ELISA, тъй като се счита за по-чувствителен и специфичен, макар и по-сложен и скъп.

Имунното блотиране комбинира ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA) с предварително електрофоретично разделяне на вирусни протеини в гел и прехвърлянето им към нитроцелулозна мембрана. Имуноблот процедурата се състои от няколко етапа. Първо, ХИВ, предварително пречистен и разграден до съставните му компоненти, се подлага на електрофореза, докато всички антигени, които съставляват вируса, се разделят по молекулно тегло. След това антигените се попиват от гела върху нитроцелулозна или найлонова филтърна лента, която сега съдържа спектър от HIV протеини, невидими за окото. След това тестовият материал се нанася върху лентата (серум, кръвна плазма на пациента и т.н.) и ако в пробата има специфични антитела, те се свързват с лентите от антигенни протеини, строго съответстващи на тях. В резултат на последващи манипулации (като ELISA) резултатът от това взаимодействие се визуализира – става видим. Наличието на ленти в определени части на лентата потвърждава наличието на антитела срещу строго определени HIV антигени в изследвания серум.

Имунното блотиране най-често се използва за потвърждаване на диагнозата на HIV инфекция. СЗО счита за положителни серуми, в които антитела към всеки два протеина на обвивката на ХИВ се откриват чрез имунно блотиране. Съгласно тези препоръки, ако има реакция само с един от протеините на обвивката (gp160, gp120, gp41) в комбинация или без реакция с други протеини, резултатът се счита за съмнителен и се препоръчва повторно тестване с помощта на комплект от друг серия или друга фирма. Ако и след това резултатът остане съмнителен, изследването продължава на всеки 3 месеца.

Особености

Имуноблот анализът е надежден метод, който ви позволява да определите наличието на антитела срещу HIV антигени от първи и втори тип. Ако човек е заразен, в рамките на две седмици се появяват антитела, които могат да бъдат открити много по-късно. Особеността на ХИВ е, че количеството антитела бързо се увеличава и остава в кръвта на пациента. Дори и да са налице, болестта може да не се прояви в продължение на две или повече години. Методът ELISA не винаги определя точно наличието на заболяването, следователно е необходимо потвърждение на резултатите чрез имуноблотинг и PCR, ако ензимно-свързаният имуносорбентен анализ покаже положителен резултат.

Показания за назначаване

Какво представлява този "имуноблот" вече е установено, но на кого е възложено това изследване? Причината за преминаване на тестове за вируса на човешкия имунодефицит (HIV) чрез имуноблотинг е положителен резултат ELISA. Необходимо е да се премине през ензимно-свързан имуносорбентен анализ за пациенти, които ще бъдат оперирани. Освен това трябва да се направи анализ за жени, които планират бременност, както и за всички, които водят безразборен полов живот. Назначете имуноблотинг на пациенти с ХИВ, ако резултатите от ELISA са под съмнение.

Следните тревожни симптоми могат да станат причина да се свържете с лекар:

• рязка загуба на тегло;
• слабост, загуба на работоспособност;
• разстройство на червата (диария), което продължава три седмици;
• дехидратация на тялото;
• треска;
• увеличени лимфни възли по тялото;
• развитие на кандидоза, туберкулоза, пневмония, токсоплазмоза, обостряне на херпес.

Пациентът не трябва да се подготвя, преди да дари венозна кръв. Храна не трябва да се приема 8-10 часа преди изследването. Не се препоръчва да пиете алкохолни и кафеени напитки на ден преди кръводаряване, да се занимавате с тежки физически упражнения, да изпитвате безпокойство.

Как се прави изследването?

От гледна точка на пациента, имуноблотът не се различава от всеки друг анализ: взема се, изследва се венозна кръв и се получава резултатът. Но ако навлезете в техниката малко по-подробно, тогава не е много просто, но все пак нека се опитаме да го разберем.

Първо, "референтният" човешки имунодефицитен вирус се взема в завода за производство на реагенти. След това, като се използва специална процедура (електрофореза) в гел среда, вирусът се унищожава до най-малките му компоненти: протеини (вирусни антигени). След това с помощта на самото попиване (от англ. blotting) частиците се поставят върху специален материал - нитроцелулозен или найлонов филтър, получава се готов за употреба индикатор, т. нар. лента. Лентата е лента, в която антигените са разпределени в зависимост от тяхното молекулно тегло в ясна последователност, тоест на всеки милиметър хартия съответства определен протеин.

Както може би знаете, ако в кръвта на човек присъстват вируси, тялото започва да произвежда антитела срещу техните мембрани (определени протеини) и всеки вирус има свой собствен индивидуален набор от антигенни протеини. Откриването на антитела срещу антигенни протеини в кръвта е в основата на имуноблот метода. В края на краищата, ако антитяло се сблъска с антиген, тогава те със сигурност ще взаимодействат помежду си - "слепят".

И така, антигените са върху лентата на лентата и ако има подходящи антигени в кръвта на изследваното лице, те със сигурност ще взаимодействат един с друг и на това място, върху лентата на лентата, ще се появи индикатор - ще изглежда плосък ( като тест за бременност). Освен това, на определено място на лентата, така че лекарят ще разбере дали в кръвта има набор от протеини, които са характерни за конкретен вирус.

Така например, ако има потъмняване на лентата в местата на локализация на протеини gp160, gp120, gp41ХИВ е диагностициран, за други вируси ще бъде напълно различен набор от протеини.

Трябва да се отбележи, че имуноблотът ви позволява точно да установите наличието на вируса само ако наборът от антитела в кръвта е пълен, тоест ако протеините gp160, gp120, gp41 присъстват едновременно, тогава това е 100% ХИВ инфекция. Но ако поне един липсва, например: gp41 липсва, но има само gp160, gp120, тогава тестът се счита за съмнителен и трябва да се повтори.

ЧЗВ

Какви етапи включва имуноблотът?

1. Подготовка на лентата.Вирусът на имунодефицита (HIV), предварително пречистен и унищожен до съставните му компоненти, се подлага на електрофореза, докато антигените, които са част от HIV, се разделят по молекулно тегло. След това, чрез попиване (аналогично на изстискване на излишно мастило върху попивател), антигените се прехвърлят в лента от нитроцелулоза, която сега съдържа спектър от антигенни ленти, които са невидими за окото, характерни за ХИВ.
2. Примерно изследване.Изследваният материал (серум, плазма от кръвта на пациента и др.) се нанася върху нитроцелулозната лента и ако в пробата има специфични антитела, те се свързват със строго съответстващи (комплементарни) антигенни ленти. В резултат на последващи манипулации резултатът от това взаимодействие се визуализира – прави видим.
3. Интерпретация на резултата.Наличието на ленти в определени области на нитроцелулозната плоча потвърждава наличието на антитела срещу строго определени HIV антигени в изследвания серум.

• Лента А - Положителен контрол
• Лента B - Слаба положителна контрола
• Лента C - Отрицателна контрола
• Ивица D - Положителна проба (открити са антитела срещу ХИВ-1)

Как да дешифрираме анализа?

Ако ELISA показа наличието на всички или почти всички антитела срещу антигени според тази тестова система, това показва положителен тест за ХИВ. Ако отговорът след втория серологичен имуноензимно-свързан имуносорбентен анализ е положителен, тогава трябва да се извърши имуноблотиране. Дешифрирането на неговите резултати ще бъде по-правилно. Ако ензимният имуноанализ даде положителен резултат, следващият имуноблот анализ също показа наличието на ХИВ, след което се поставя крайният резултат.

Когато тестовете бъдат дешифрирани, тогава трябва да знаете, че положителният тест за ХИВ се определя от:

• 60% до 65% 28 дни след заразяването;
• 80% - след 42 дни;
• в 90% - след 56 дни;
• 95% - след 84 дни.

Ако отговорът на ХИВ е положителен, това ще означава, че са открити антитела срещу вируса. За да избегнете фалшиво положителен отговор, е необходимо да тествате отново, за предпочитане два пъти. Ако антитела срещу имунодефицит се открият при преминаване на два теста от два или при преминаване на 3 теста в 2 от тях, тогава резултатът се счита за положителен.

Р24 антигенът може да бъде открит в кръвта още 14 дни от деня на инфекцията. С помощта на метода на ензимен имуноанализ този антиген се открива от 14 до 56 дни. След 60 дни той вече не е в кръвта. Едва когато в тялото се образува СПИН, този протеин р24 нараства отново в кръвта. Следователно, системите за ензимен имуноанализ се използват за откриване на ХИВ в ранните дни на инфекцията или за определяне на това как протича заболяването и за наблюдение на процеса на лечение. Високата аналитична чувствителност на ензимно-свързан имуносорбентен анализ открива р24 антиген в биологичен материал с HIV от първия подтип при концентрация от 5 до 10 pkg / ml, с HIV от втория подтип от 0,5 ng / ml или по-малко.

Под съмнителнорезултатът от ензимно-свързан имуносорбентен анализ предполага, че някъде в диагнозата е допусната грешка, като правило нещо е объркано от медицинските работници или човек има признаци на инфекция и резултатът е отрицателен, което поражда подозрение, лицето се изпраща за втори тест.

Под фалшиво положителнорезултатът се разбира като резултат, когато доставката на кръвни изследвания е извършена при следните състояния на пациента:

• бременност;
• ако човек има хормонално разстройство;
• с продължителна имуносупресия.

Как да дешифрираме анализа в този случай? Фалшиво положителен резултат се дава, ако се открие поне един протеин. Поради факта, че антигенът p24 е силно зависим от индивидуалните вариации, с помощта на този метод в първия период на инфекция се откриват от 20% до 30% от пациентите.

Колко надежден е положителният резултат от теста?

Понякога резултатите от ELISA са фалшиво положителни (в около 1% от случаите), причината за такъв резултат може да бъде бременност, различни вирусни инфекции или обикновен инцидент. След получаване на положителен резултат е необходим по-точен тест - имуноблот, според резултатите от който се поставя диагноза. Положителният имуноблот резултат след положителен ELISA е 99,9% надежден - това е максималната точност за всеки медицински тест. Ако имуноблотът е отрицателен, тогава първият тест е фалшиво положителен и всъщност човекът няма ХИВ.

Какво е несигурен (съмнителен) резултат?

Ако ELISA е положителен или отрицателен, тогава имуноблотът може да бъде положителен, отрицателен или неопределен. Несигурен имуноблот резултат, т.е. наличието на поне един протеин към вируса в имуноблота може да се наблюдава, ако инфекцията е настъпила наскоро и все още има малко антитела срещу HIV в кръвта, в който случай имуноблотът ще стане положителен след известно време. Също така, несигурен резултат може да се появи при липса на HIV инфекция с хепатит, някои хронични метаболитни заболявания или по време на бременност. В този случай или имуноблотът ще стане отрицателен, или ще бъде намерена причината за недефинирания резултат.

Колко струва анализа?

Имуноблот за ХИВ не е евтин тест. Средно скринингово изследване чрез методи за имуноанализ струва от 500 до 900 рубли. Имуноблотингът е проучване за проверка, чиято цена варира от три до пет хиляди рубли. По-сложните методи са много по-скъпи. Например, за анализ на полимеразна верижна реакция (PCR), ще трябва да платите около 12 000 рубли.

Къде да направя анализа?

Къде мога да се тествам за ХИВ? ELISA, имуноблот изследвания се провеждат в градски частни клиники, резултатите се издават в рамките на един ден. Възможна е и спешна диагностика. В държавните лечебни заведения тестовете ELISA и имуноблотингът се извършват безплатно, в съответствие със законодателството на Руската федерация. Бременните жени, както и пациентите, които ще бъдат хоспитализирани или подложени на операция, се подлагат на задължително изследване за инфекциозни заболявания.

ELISA в твърда фаза - вариант на теста, когато един от компонентите на имунния отговор (антиген или антитяло) се сорбира върху твърд носител, например в ямките на полистиролови плочи. Компонентите се откриват чрез добавяне на белязани антитела или антигени. Ако резултатът е положителен, цветът на хромогена се променя. Всеки път след добавяне на следващия компонент, несвързаните реагенти се отстраняват от ямките чрез промиване,

При определяне на антитела (лява фигура), кръвният серум на пациента, антиглобулиновият серум, белязан с ензим, и субстрат / хромоген за ензима се добавят последователно към ямките на плаките със сорбирания антиген.

II. При определяне на антигена (дясна фигура) в ямките с адсорбирани антитела се въвежда антиген (например кръвен серум с желания антиген), диагностичен серум срещу него и вторични антитела (срещу диагностичен серум), белязани с ензим добавен и след това субстрат/хромоген за ензима.

Конкурентна ELISA за определяне на антигени: целевият антиген и белязаният с ензим антиген се конкурират един с друг за свързване на ограничен брой антитела на имунния серум.

Друг тест е конкурентен ELISA за определяне на антитела: целевите антитела и белязаните с ензим антитела се конкурират помежду си за антигени, адсорбирани върху твърдата фаза.

Имуноблотинг- високочувствителен метод за откриване на протеини, базиран на комбинация от електрофореза и ELISA или RIA. Имуноблотингът се използва като диагностичен метод за HIV инфекция и др.

Патогенните антигени се разделят чрез електрофореза в полиакриламиден гел, след което се прехвърлят от гела върху активирана хартия или нитроцелулозна мембрана и се развиват с помощта на ELISA. Фирмите произвеждат такива антигенни блотирани ленти. Серумът на пациента се нанася върху тези ленти. . След това, след инкубация, несвързаните антитела на пациента се отмиват и се прилага серумът срещу човешки имуноглобулини, белязани с ензима. . Комплексът, образуван върху лентата [антиген + антитяло на пациента + антитяло срещу човешки Ig], се открива чрез добавяне на хромогенен субстрат, който променя цвета си под действието на ензим.

52. Интерферони, природа. Методи за получаване и използване.

интерферонпринадлежи към важните защитни протеини на имунната система. Той беше открит при изследване на интерференцията на вирусите, тоест явлението, когато животни или клетъчни култури, заразени с един вирус, стават нечувствителни към инфекция с друг вирус. Оказа се, че интерференцията се дължи на получения протеин, който има защитно антивирусно свойство. Този протеин се нарича интерферон.

Интерферонът е семейство гликопротеинови протеини, които се синтезират от клетките на имунната система и съединителната тъкан. В зависимост от това кои клетки се синтезира интерферонът, се разграничават три вида: α, β и γ-интерферони.

Алфа интерферонпроизвежда се от левкоцити и се нарича левкоцит; бета интерфероннаречен фибробластен, тъй като се синтезира от фибробласти - клетки на съединителната тъкан, и гама интерферон- имунен, тъй като се произвежда от активирани Т-лимфоцити, макрофаги, естествени клетки убийци, т.е. имунни клетки.

Интерферонът се синтезира постоянно в тялото и неговата концентрация в кръвта се поддържа на около 2 IU / ml (1 международна единица - ME е количеството интерферон, което защитава клетъчната култура от 1 CPE 50 вирус). Производството на интерферон се увеличава рязко при заразяване с вируси, както и при излагане на индуктори на интерферон, например РНК, ДНК, сложни полимери. Такива индуктори на интерферон се наричат интерфероногени.

В допълнение към антивирусния ефект, интерферонът има антитуморна защита, тъй като забавя пролиферацията (умножаването) на туморните клетки, както и имуномодулиращата активност, стимулирайки фагоцитозата, естествените клетки убийци, регулирайки производството на антитела от В клетките, активирайки експресията на основните комплекс за хистосъвместимост.

Механизъм на действиеинтерферонът е сложен. Интерферонът не засяга пряко вируса извън клетката, но се свързва със специални рецептори на клетките и влияе върху процеса на възпроизвеждане на вируса вътре в клетката на етапа на протеинов синтез.

Използване на интерферон... Действието на интерферона е толкова по-ефективно, колкото по-рано започва да се синтезира или да навлиза в тялото отвън. Поради това се използва за профилактични цели при много вирусни инфекции, като грип, както и за терапевтични цели при хронични вирусни инфекции като парентерален хепатит (B, C, D), херпес, множествена склероза и др. Интерферонът дава положителни резултати при лечение на злокачествени тумори и заболявания, свързани с имунодефицити.

Интерфероните са видоспецифични, т.е. човешкият интерферон е по-малко ефективен за животните и обратно. Тази видова специфичност обаче е относителна.

Получаване на интерферон... Интерферонът се получава по два начина: а) чрез заразяване на човешки левкоцити или лимфоцити с безопасен вирус, в резултат на което инфектираните клетки синтезират интерферон, който след това се изолира и от него се конструират интерферонови препарати; б) генно инженерно - чрез отглеждане в промишлени условия на рекомбинантни щамове бактерии, способни да произвеждат интерферон. Обикновено се използват рекомбинантни щамове на Pseudomonas, Escherichia coli с интерферонови гени, вградени в тяхната ДНК. Генно инженерният интерферон се нарича рекомбинантен. В нашата страна рекомбинантният интерферон е получил официалното име "Reaferon". Производството на това лекарство е в много отношения по-ефективно и по-евтино от левкоцитното.

Рекомбинантният интерферон намира широко приложение в медицината като профилактично и терапевтично средство при вирусни инфекции, неоплазми и имунодефицити.