Študija krvnega seruma po metodi ifa norm. Analiza ELISA: kaj je to? zakaj je to potrebno? prednosti in slabosti metode. Kaj je ELISA

5.1 Bistvo in razvrstitev ELISA.

ELISA se je pojavila sredi 60. let in je bila prvotno razvita kot metoda za identifikacijo antigena v histološkem vzorcu, pa tudi za vizualizacijo precipitacijskih linij pri imunodifuzijskih in imunoelektroforeznih testih, nato pa se je začela uporabljati za kvantitativno določanje antigenov. in protitelesa v bioloških tekočinah. Pri razvoju metode sta sodelovala E. Engvall in R. Palman ter neodvisno od njih V. Van Veeman in R. Schurs.

riž. 6 Osnovno načelo ELISA:

za odkrivanje antigenov; 2) za odkrivanje protiteles

Metoda temelji na specifični vezavi protitelesa na antigen, medtem ko je ena od komponent konjugirana z encimom; kot posledica reakcije z ustreznim kromogenim substratom nastane obarvan produkt, katerega količina je lahko določeno spektrofotometrično (slika 6).

Odkritje možnosti imobilizacije antigena in protiteles na različnih nosilcih z ohranjanjem njihove vezavne aktivnosti je omogočilo razširitev uporabe ELISA na različnih področjih biologije in medicine.

Pojav monoklonskih protiteles je služil nadaljnjemu razvoju ELISA, kar je omogočilo povečanje njegove občutljivosti, specifičnosti in obnovljivosti rezultatov.

Teoretično ELISA temelji na podatkih sodobne imunokemije in kemične encimologije, poznavanju fizikalno-kemijskih zakonitosti reakcije antigen-protitelo, pa tudi na glavnih načelih analitične kemije. Občutljivost ELISA in čas njenega izvajanja določa več glavnih dejavnikov: kinetične, termodinamične značilnosti reakcije antigen-protitelo, razmerje reagentov, aktivnost encima in ločljivost metod za njegovo odkrivanje. Na splošno lahko reakcijo antigen-protitelo opišemo s preprosto shemo:

+ [AG] ↔ [ATAG]

Raznolikost raziskovalnih predmetov od nizkomolekularnih spojin do virusov in bakterij ter nenavadno širok spekter težav, povezanih z različnimi pogoji za uporabo ELISA, določajo razvoj izjemno velikega števila različic te metode.

Vsaka različica ELISA vsebuje 3 obvezne stopnje:

1. stopnja prepoznavanja testne spojine s specifičnim protitelesom proti njej, kar vodi v nastanek imunskega kompleksa;

2. korak tvorbe vezi konjugata z imunskim kompleksom ali s prostimi veznimi mesti;

3. stopnja pretvorbe encimske oznake v posnet signal. Razvrstitev metod ELISA temelji na več pristopih:

1. Glede na vrsto reagentov, ki so prisotni v prvi fazi ELISA, ločimo konkurenčne in nekonkurenčne metode.

A) Pri konkurenčni ELISA na prvi stopnji sistem vsebuje tako analizirano spojino kot njen analog, označen z encimom in z njim tekmuje za specifična vezavna mesta.

B) Za nekonkurenčne metode je značilna prisotnost v sistemu na prvi stopnji samo analizirane spojine in zanjo specifičnih veznih mest.

2. Vse metode ELISA so razdeljene na homogene in heterogene.

Če vse tri stopnje ELISA potekajo v raztopini in med glavnimi stopnjami ni dodatnih stopenj ločevanja nastalih imunskih kompleksov od nereagiranih komponent, metoda spada v skupino homogenih.

Homogena ELISA, ki se običajno uporablja za določanje snovi z nizko molekulsko maso, temelji na inhibiciji encimske aktivnosti, ko se kombinira z antigenom ali protitelesom. Encimska aktivnost se obnovi kot posledica reakcije antigen-protitelo.

Ko se protitelo veže na antigen, ki vsebuje encimsko oznako, se aktivnost encima zavira za 95 % glede na substrat z visoko molekulsko maso, kar je posledica sterične izključitve substrata iz aktivnega središča encima. Ko se koncentracija antigena poveča, se veže vedno več protiteles in zadrži se vedno več prostih konjugatov antigen-encim, ki so sposobni hidrolizirati substrat z visoko molekulsko maso. Analiza se izvede zelo hitro, za eno določitev traja 1 minuto. Občutljivost metode je precej visoka. Z njegovo pomočjo lahko določite snov na ravni pikomolov.

Za heterogeno metodo je značilna analiza v dvofaznem sistemu s sodelovanjem trdne faze - nosilca in obvezna stopnja ločevanja imunskih kompleksov od nereagiranih komponent (pranje), ki so v različnih fazah (tvorjen imunski sistem). kompleksi so v trdni fazi, nereagirani kompleksi pa v raztopini) ... Heterogene metode, pri katerih nastajanje imunskih kompleksov v prvi fazi poteka na trdni fazi, imenujemo trdnofazne metode.

Metode so homogeno-heterogene, če stopnja 1 - pride do tvorbe specifičnih kompleksov v raztopini, nato pa se za ločevanje komponent uporabi trdna faza z imobiliziranim reagentom.

3. Na podlagi načela določanja preskusne snovi:

A) Neposredno določanje koncentracije snovi (antigena ali protitelesa) s številom veznih mest, ki z njo delujejo. V tem primeru bo encimska oznaka v oblikovanem specifičnem kompleksu AG-AT. Koncentracija analita bo neposredno sorazmerna s zabeleženim signalom.

B) Določanje koncentracije snovi z razliko med skupnim številom veznih mest in preostalimi prostimi veznimi mesti. V tem primeru se bo koncentracija analita povečala, zabeleženi signal pa se bo zmanjšal, zato je v tem primeru mogoče zaslediti inverzno odvisnost od velikosti zapisanega signala.

5.2 Značilnosti komponent, uporabljenih v ELISA.

Encimi.

Encimske oznake imajo izjemno močan katalitični učinek, ena molekula encima lahko reagira z velikim številom molekul substrata. Tako je encim, ki je prisoten v sledovih, mogoče identificirati in kvantificirati s tvorbo produktov reakcije, ki jo katalizira. Druga prednost uporabe encimov kot oznak je posledica prisotnosti v molekuli številnih funkcionalnih skupin (sulfhidrilnih, karboksilnih, tirazinskih ostankov itd.), preko katerih se lahko kovalentno vežejo molekule ligandov.

Encimski markerji, ki se uporabljajo v ELISA, morajo imeti naslednje lastnosti:

- visoka aktivnost in stabilnost encima v pogojih analize, z modifikacijo in v konjugaciji s protitelesi ali drugimi proteini;

- prisotnost občutljivih substratov in preprostost metode za določanje produktov ali substratov encimske reakcije;

- sposobnost prilagajanja sistemov substrata za nadaljnjo izboljšavo;

- odsotnost encima in njegovih zaviralcev v preiskovani biološki tekočini.

ELISA lahko uporablja vsaj 15 različnih encimov. V skladu z zgornjimi zahtevami so največjo uporabo našle peroksidaza hrena (HRP), alkalna fosfataza (ALP) in β-D-galaktozidaza. Vsi trije so stabilni in katalizirajo zelo občutljive reakcije. Poleg tega je mogoče produkte, pridobljene kot rezultat reakcij, ki jih katalizirajo ti encimi, odvisno od uporabljenega substrata zaznati ne le s kolorimetričnimi metodami, ampak tudi s fluorescenčnimi metodami. Drugi encimi se uporabljajo veliko manj pogosto. To je posledica njihove nižje specifične aktivnosti v primerjavi s HRP in AP.

Substrati.

Izbira substrata je v prvi vrsti določena z encimom, ki se uporablja kot oznaka, saj je reakcija encim-substrat zelo specifična.

Osnovne zahteve za substrat:

- zagotavljanje visoke občutljivosti metode pri odkrivanju encima v konjugatu;

- nastanek dobro upoštevanih (na primer obarvanih) produktov reakcije encim-substrat;

- substrat mora biti varen, poceni, cenovno ugoden in priročen za uporabo.

Pogosteje se uporabljajo kromogeni substrati, ki ob razpadu tvorijo obarvano snov. Obetavna je uporaba visokoenergetskih substratov – fluorescentnih, kemipuminescenčnih. Uporaba takšnih substratov omogoča teoretično povečanje občutljivosti ELISA za dva reda velikosti.

Tvorba konjugata.

Konjugat je antigen ali protitelo, označeno z encimsko oznako. Tvorba konjugata je ena od pomembnih stopenj ELISA.

Pri tvorbi konjugata se izbere optimalna metoda za uvedbo encimske oznake tako, da obe komponenti konjugata ohranita svojo biološko aktivnost: encim je sposobnost interakcije s substratom, antigen ali protitelo pa antigensko in antigensko vezavno aktivnost. , oz. Prisotnost označenega, visoko prečiščenega antigena omogoča uporabo konkurenčnih metod. V tem primeru je v končni fazi mogoče izmeriti aktivnost konjugata, ki ni vezan na imobilizirana protitelesa, s čimer se izognemo postopku izpiranja in naredimo analizo bolj priročno. Vendar so antigeni različni po svojih fizikalno-kemijskih lastnostih in strukturi, kar pomeni, da je nemogoče razviti univerzalne metode za pridobitev konjugata z antigenom. V tem primeru je priprava konjugata antigen-encim ločen izziv. Priprava označenih protiteles za ELISA je metodološko bolj dostopna.

Konjugacija encima z imunokemično aktivnimi beljakovinami se izvaja z različnimi metodami: kemično navzkrižno povezovanje, kovalentna vezava molekule encima z AG ali AT in tvorba spojin prek nekovalentnih vezi, na primer, ko se vez med encimom in AG ali AT se izvaja imunološko, z interakcijo antigen-protitelo.

Najbolj razširjene so kovalentne metode za pripravo konjugatov. Izbira vezavne reakcije je določena z vrsto funkcionalnih skupin, ki so na voljo v danih proteinskih molekulah. Glutaraldehid, natrijev perjodat itd. se uporabljajo kot reagenti za uvedbo encima v molekule antigena in protiteles.

Obstajajo enostopenjske in dvostopenjske metode za pridobivanje konjugatov z uporabo glutaraldehida. Nastanejo lahko konjugati različnih velikosti z zmanjšano encimsko aktivnostjo (15-60 % prostega encima). Nastali velik konjugat lahko sterično ovira določanje preskusne snovi. Konjugati z relativno nizko molekulsko maso so sestavljeni iz Fab fragmenta in ene molekule encima.

Kot rezultat dvostopenjske sinteze, ki je sestavljena iz postopne proizvodnje encima, modificiranega z zamreževalnim sredstvom, njegove izolacije in nato njegove nadaljnje interakcije z antigenom (protitelesom), se molekule homogene tvorijo sestavo, ki vsebuje 1-2 encimski molekuli na molekulo imunoglobulina in ohranja visoko encimsko in imunološko aktivnost. Vendar je količina tako nastalih konjugatov majhna (pri peroksidazi hrena je 5 - 10%).

Najbolj praktična uporaba je bila najdena z metodo pridobivanja imunoperoksidaznih konjugatov, ki temelji na oksidaciji ogljikove hidratne komponente encima z natrijevim perjodatom (vezava peroksidaze na konjugat doseže 70-90% začetne količine encima).

Zanesljiv konjugat mora imeti naslednje lastnosti:

Visoka protitelesa tigra in visoka afiniteta za antigen, tako da ga je mogoče uporabiti v veliki razredčini in tako zmanjšati nespecifično vezavo;

Zadostna specifičnost v delovni vzreji;

Prevlada monomernih oblik nad polimernimi, ker polimerne oblike so nagnjene k nespecifičnemu lepljenju na plastiko, kar ima za posledico visoko stopnjo reakcije v ozadju;

Optimalno molsko razmerje med encimom in protitelesi (optimalno razmerje je približno 1:1);

Zadostna encimska aktivnost konjugata. To lastnost določajo predvsem pogoji konjugacije in razmerje med molekulami encima in protitelesa v konjugatu.

5.3 Heterogene metode ELISA.

Heterogena ELISA (ali trdna faza ELISA) vključuje metode, pri katerih je analit v dveh fazah. Za ločevanje komponent imunokemijske reakcije se uporablja trdna faza (netopen nosilec, običajno plastična) z imobiliziranimi protitelesi ali antigenom, ki se na vsaki stopnji spere, da se odstranijo vmesni produkti neizreagiranih komponent.

Imobilizacijo lahko izvedemo s kovalentno vezavo protiteles (antigenov) na aktiviran nosilec s kemičnimi pristopi, pa tudi s fizično adsorpcijo protiteles (antigenov) na površini trdnih polimerov (na primer polistirenskih plošč). V tuji literaturi se to področje imenuje ELISA test ali encimski imunosorbentni test.

Nekonkurenčna ELISA za določanje antigenov na primeru uporabe encimsko označenih specifičnih protiteles in imobiliziranih protiteles.

Nosilcu z imobiliziranimi protitelesi dodamo raztopino, ki vsebuje analiziran antigen. Med inkubacijo nastane specifičen kompleks antigen-protitelo. Nato nosilec speremo z nevezanih antigenov in dodamo označena konjugirana protitelesa. V tem primeru je količina vezanega konjugata neposredno sorazmerna s količino antigena v testnem vzorcu. Po sekundarni inkubaciji in odstranitvi presežka konjugata dodamo kromogeni substrat za uporabljeni encim, ki pod delovanjem encima spremeni barvo, torej pride do encimske reakcije z obarvanjem raztopine v vdolbinicah. Stopnja barve je neposredno sorazmerna s količino encimsko označenih specifičnih protiteles, encima in s tem preučevanega antigena. Meritve optične gostote raztopine v vdolbinicah pri določeni valovni dolžini (odvisno od uporabljenega substrata) se izvajajo s posebnimi spektrofotometri, prilagojenimi za mikroplošče – ​​čitalnike. Kvantitativno oceno koncentracije antigena v vzorcu določimo s primerjavo rezultatov s kalibracijsko krivuljo odvisnosti optične gostote raztopine od koncentracije standardne raztopine antigena.

Slika 7.

Ker je v fazi odkrivanja specifičnega imunokompleksa antigen vezan na molekule imobiliziranih in označenih protiteles, se ta metoda v literaturi pogosto imenuje "sendvič" metoda (iz angleškega sendviča) ali dvocentrična ELISA metoda ( iz angleškega testa na dveh mestih).

S to metodo lahko analiziramo le tiste antigene, na površini katerih sta vsaj dve antigenski determinanti. Za analizo velikega števila monovalentnih antigenov (zdravilne spojine, pesticidi itd.) je nesprejemljivo.

Glavna prednost te metode je njena visoka občutljivost. Meja detekcije spojin po tej metodi trenutno dosega vrednost reda 10-21 mol, kar ustreza detekciji le 600 molekul analita v vzorcu. Največja občutljivost je dosežena, ko se vsaka imunološka reakcija izvaja v ravnotežnem načinu, kar vpliva na trajanje analize, ki je v povprečju 4-6 ur. Nekonkurenčna ELISA za določanje protiteles na primeru uporabe encimsko označenih sekundarnih protiteles in imobiliziranih antigenov.

Imobiliziranemu antigenu dodamo testni serum. Po inkubaciji in izpiranju nevezanih protiteles se dodajo označena sekundarna protitelesa, ki so specifična za protitelesa, ki jih je treba analizirati. Po sekundarni inkubaciji in odstranitvi presežka označenih sekundarnih protiteles je vsebnost encimske oznake na nosilcu sorazmerna s koncentracijo specifičnih protiteles v serumu.

Ta shema je ena najpogostejših ELISA za določanje protiteles, saj omogoča odkrivanje protiteles proti različnim antigenom.

Heterogena kompetitivna ELISA za določanje antigena na primeru označenega antigena in imobiliziranih protiteles.

Protitelesom, imobiliziranim na nosilcu, dodamo raztopino, ki vsebuje antigen, ki ga je treba analizirati, in fiksno koncentracijo konjugata antigen-encim. Po inkubaciji nosilec speremo z nevezanega prostega in označenega antigena in zabeležimo encimsko aktivnost na nosilcu, ki je obratno sorazmerna s koncentracijo antigena, ki se določa.



5.4 Homogena metoda ELISA.

Homogeni encimsko vezan imunosorbentni test (ELISA) je metodološko najbolj preprosta vrsta ELISA. Ko je nastavljen, enega od udeležencev imunskega odziva (običajno nizkomolekularnega antigena) označimo z encimom in spremljamo potek tvorbe kompleksa antigen-protitelo z beleženjem spremembe aktivnosti encim.

Takšna kršitev encimske aktivnosti se lahko pojavi bodisi zaradi prostorske ločitve encima in substrata bodisi zaradi konformacijskih sprememb v molekuli encima, ki spremljajo nastanek imunskega kompleksa. GIFA ima številne pomembne prednosti pred drugimi imunokemijskimi metodami. Prvič, visoka ekspresija (celotna analiza z uporabo GIFA traja minute in celo delčke minut).

riž.8 Možnosti homogenega encimskega imunskega testa(A - učinek odklopa encima (F) in substrata (C) zaradi steričnih ovir pri interakciji antigena (Ar) in protitelesa (Ab); B - učinek spremembe konformacije encima med nastajanjem kompleksa antigen-protitelo).

Drugič, metoda ima eno stopnjo in ne zahteva napornih in dolgotrajnih korakov pranja. In končno, tretjič, metoda zahteva minimalne količine (8-50 μl) in količine biološkega ali kliničnega vzorca. Vendar ima metoda GIFA eno izjemno pomembno pomanjkljivost - na njeni podlagi je mogoče ustvariti diagnostične testne sisteme samo za antigene z nizko molekulsko maso. Samo v tem primeru lahko protitelo v interakciji z antigenom učinkovito pregleda ali modificira molekulo encima, vezano na ta antigen. Prav v zvezi s tem (kljub navidezni preprostosti in očitnim prednostim pred drugimi metodami so bili na podlagi GIFA ustvarjeni diagnostikumi za odkrivanje le hormonov, peptidov, zdravilnih in narkotičnih snovi ter nekaterih nizkomolekularnih beljakovin.

5.5 "Sendvič" - različica ELISA za odkrivanje antigenov.

Antigeni, določeni s to različico ELISA, morajo imeti več epitopov, ki lahko vežejo protitelesa, ali pa morajo imeti ponavljajoče se, prostorsko ločene epitope iste specifičnosti.

Pri izvajanju te različice ELISA se visoko specifična poli- ali monoklonska protitelesa, adsorbirana na trdni fazi, inkubirajo s testnim vzorcem. Po postopku izpiranja se v vdolbinice vnesejo encimsko označena protitelesa (konjugat) proti istemu antigenu, nato pa se izvedejo vse druge faze reakcije. Učinkovitost tvorbe specifičnega kompleksa na vsaki stopnji analize je odvisna od vezavne konstante reakcije antigen-protitelo.

Seznam razpoložljivih diagnostičnih tehnik se v zadnjih desetletjih hitro širi, diagnostiki poskušajo združiti prednosti vseh dosedanjih analiz v nove metode in se znebiti vseh njihovih prejšnjih pomanjkljivosti.

V zadnjem času se vse pogosteje na seznamu diagnostičnih postopkov pojavlja encimski imunski test - sodoben in dokaj nov test, o katerem navadnemu človeku, ki ni povezan z medicino, malo vemo. Kljub temu ta tehnika hitro širi vrste svojih privržencev med kvalificiranim zdravstvenim osebjem. Kaj je in v katerih primerih ga je treba uporabiti, lahko poskusite ugotoviti tako, da se seznanite z njegovimi značilnostmi in glavnimi značilnostmi.

Encimski imunski test je instrumentalna in laboratorijska tehnika, ki temelji na molekularni reakciji "antigen-protitelo", ki omogoča odkrivanje specifičnih beljakovin v bioloških materialih (vzorcih za raziskave). Te beljakovine so lahko encimi, različni mikroorganizmi (virusi, bakterije, glive), protozoji itd.

Po odkritju metode je dobila ime ELISA test, ki nima nobene zveze z imenom odkriteljev, ampak je okrajšava polnega imena v angleški različici – enzyme-linked immunosorbent assay. Zdravniki po vsem svetu uporabljajo to ime, nekateri zdravniki v rusko govorečih državah tovrstno raziskavo imenujejo tudi tako.

Glavno načelo metode je molekularna reakcija "antigen-protitelo".

Antigen je vsaka tuja molekula, ki je vstopila v človeško telo kot del mikrobnega povzročitelja bolezni. Antigeni so običajno beljakovinske molekule. Poleg mikroorganizmov so lahko tak "tujec" celice krvi nekoga drugega, ki ne sovpadajo v skupini ali Rh faktorju.

Kot odgovor na vdor takšnega antigena se v telesu sproži imunski odziv, ki je namenjen zaščiti pred kakršnimi koli tujimi molekulami. To je posledica sinteze posebnih sredstev imunskega sistema - protiteles (imunoglobulinov). Vsako protitelo je primerno samo za določen antigen in nevtralizira patogenega "tujca" tako, da se z njim veže v en sam kompleks. To je proces te vezave, ki se imenuje reakcija "antigen-protitelo".

Vrste protiteles

Vsa protitelesa (imunoglobulini) so razdeljena na 5 vrst, odvisno od tega, v kateri fazi imunskega odziva se pojavijo:

Za ELISA diagnostiko so najpogosteje pomembne ravni imunoglobulinov IgG, IgM in IgA. Po njihovih zaslugah lahko ugotovite, ali je bila oseba prej zbolela za boleznijo ali se je pred kratkim okužila, ali je razvila imuniteto ali je njegovo telo brez obrambe pred patologijo.

Prednosti in slabosti encimskega imunskega testa

Trenutno je ELISA ena najbolj natančnih in občutljivih metod. Sprejeli so ga strokovnjaki z različnih področij medicine in še naprej širi svoje področje uporabe.

Prednosti metode

• Visoka natančnost prejetih podatkov.
• Občutljivost (omogoča odkrivanje zahtevane snovi tudi pri minimalni prisotnosti patogena v vzorcu).
• Možnost diagnostike v prvih dneh bolezni ali v inkubacijskem obdobju.
• Hitrost pridobivanja podatkov v primerjavi z drugimi metodami podobne natančnosti.
• Visoka avtomatizacija procesa in minimalna človeška vpletenost, kar zmanjša napako izvajalca.
• Pridobivanje podatkov o stopnji patološkega procesa in učinkovitosti izbrane terapije.
• Neboleč in nizka invazivnost pri izbiri materiala.

Slabosti metode

• V večini primerov vam omogoča, da določite odziv telesa na patogeno sredstvo in ne samega patogena.
• Pred študijo mora biti sum na bolezen natančno znan, saj je test zelo specifičen.
• Verjetnost lažnih kazalnikov zaradi tehničnih težav, jemanja zdravil, hkratne prisotnosti več kroničnih bolezni ali presnovnih motenj v pacientovem telesu.
• Interpretacijo rezultatov naj izvaja le visokokvalificiran specialist, saj je za interpretacijo pridobljenih podatkov potrebno posebno usposabljanje in veliko zalogo medicinskega znanja na določenem področju.
• ELISA je precej redka analiza, zato se ne izvaja v vseh diagnostičnih laboratorijih.
• Metoda je precej draga, saj mora laboratorij poleg reagentov imeti veliko drago opremo in vzorce antigenov, proizvedenih v posebnih inštitutih.

V katerih primerih se uporablja encimski imunski test?

Celoten seznam indikacij za predpisovanje encimskega imunskega testa je zelo širok, vključuje skoraj vse veje medicine.

Najpogosteje se ELISA uporablja za naslednje namene:

• prepoznavanje nalezljivih bolezni;
• diagnostika spolno prenosljivih bolezni;
• ugotavljanje imunskega statusa ali posameznih avtoimunskih bolezni;
• identifikacija tumorskih markerjev;
• določanje hormonov.

V primeru nalezljivih in virusnih bolezni vam tehnika omogoča odkrivanje naslednjih patologij:

Poleg tega vam ELISA omogoča hitro in učinkovito določitev stanja infarkta, oceno reproduktivnega potenciala telesa, identifikacijo alergij, njen vir itd.

Encimski imunski test se uporablja za klinične raziskave pri razvoju novih zdravil in pri ocenjevanju njihovega učinka na človeško telo.

Vrste vzorcev in metode njihovega izbora za raziskave

Najpogosteje je testni material za encimski imunski test kri, odvzeta iz pacientove kubitalne vene. Vzorčenje se izvaja na prazen želodec, predvsem zjutraj. Po vzorčenju se tiste enotne celice, ki motijo ​​študijo, ločijo in odstranijo iz krvi, pri čemer ostane le serum.

Pri diagnosticiranju genitourinarnih okužb pogosto postanejo materialni brisi iz sluznice genitalnih organov, sluz iz sečnice ali materničnega vratu, vzorci rektuma, strgani erozij ali razjed v predelu dimelj in drugih delov telesa. Brise lahko vzamemo tako iz ustne votline kot tudi iz nazofarinksa.

Včasih se v porodniški in ginekološki praksi med nosečnostjo uporablja encimski imunski test za določitev stanja amnijske tekočine. V tem primeru amnijska tekočina postane vzorec. Za to vzamemo majhno količino tekočine s prebodom plodovega mehurja z dolgo iglo. Vse manipulacije se izvajajo s sterilnim instrumentom za zmanjšanje možnih tveganj.

Pogosto postane material cerebrospinalna tekočina ali serozna tekočina. To se zgodi z lokalno anestezijo, ki se daje z injekcijo.

Da bi pojasnili, kakšne vrste materialov so potrebni za encimski imunski test, bi moral specialist, ki se sklicuje na študijo. Vzorci se pogosto vzamejo iz več vrst hkrati ali z različnih lokacij. Zdravnik, ki izda napotnico za tovrstni pregled, mora bolniku povedati tudi o pripravah na oddajo biomateriala.

Priprava na encimski imunski test

Za povečanje natančnosti podatkov, pridobljenih po encimskem imunskem testu, mora biti priprava za izbiro materiala naslednja:

• 10 dni pred študijo izključite antibiotike, protivirusna in antimikotična zdravila;
• na dan je treba izključiti alkohol, kajenje in jemanje drog;
• v istem obdobju se je treba izogibati fizični preobremenitvi;
• opozoriti specialista za predpisovanje o vseh zdravilih, ki jih bolnik jemlje;
• obvestiti zdravnika v primeru nosečnosti ali suma na nosečnost.

Najbolje je, če material za testiranje zberemo zjutraj na prazen želodec.

Če je cilj diagnoze ugotoviti stanje hormonskega ozadja, je pomembno, da si dan prej zagotovite mirno stanje in se izognete živčni napetosti. Za ženske je darovanje krvi za hormone jasno opredeljeno z obdobjem mesečnega cikla, ki ga bo zdravnik povedal ob imenovanju.

2-3 dni pred izbiro materiala je treba iz jedilnika izključiti ocvrto in mastno, pred analizo za hepatitis pa ne jejte citrusov in drugega sadja in zelenjave oranžne in rumene barve.

Dešifriranje rezultatov encimskega imunskega testa

Rezultat kvalitativne študije je običajno označen z "+" (najdeno) ali "-" (ni najdeno).

Na podlagi prisotnosti ali odsotnosti določenih skupin imunoglobulinov lahko sklepamo naslednje:

• JgM (-), JgG (-), JgA (-) - imuniteta na bolezen je popolnoma odsotna (telo se še nikoli ni srečalo s to vrsto antigena);
• JgM (-), JgG (+), JgA (-) - prej je prišlo do trka s tem antigenom ali s cepivom;
• JgM (+), JgG (- / +), JgA (- / +) - akutni patološki proces (najverjetneje primarni);
• JgM (-), JgG (+/-), JgA (+/-) - proces kroničnega poteka;
• JgM (+), JgG (+), JgA (+) - ponovitev;
• JgM (-) - stopnja okrevanja.

Kvantitativne vrednosti imajo veliko informacijsko obremenitev, vendar jih lahko razlaga le lečeči zdravnik na podlagi predhodnih indikacij, bolnikove starosti in norm za vsako posamezno bolezen. Zaradi tega ne morete sami oceniti rezultatov.

Koliko časa traja čakanje na rezultate

Ta tehnika ima veliko različic, glede na katere je določen čas za pridobitev podatkov na roko. Povprečno trajanje ELISA diagnostike je 4-6 ur, kar vam omogoča, da rezultate podate naslednji dan.

Najdaljše metode trajajo do 10 dni, na primer v primeru okužbe s HIV.

V primeru nujne potrebe je možno uporabiti ekspresne metode, pri katerih je odgovor prejet v 1-2 urah.

Kje lahko dobim test ELISA?

Ker je oprema za tovrstno diagnostiko precej draga, je ne morejo kupiti vsi laboratoriji. Poleg tega imajo testi, ki vsebujejo specifične antigene, omejen rok uporabnosti (običajno približno 1 leto) in jih je zato treba nenehno posodabljati.

Zaradi teh razlogov državne zdravstvene ustanove nimajo vedno laboratorijev ELISA. Najpogosteje je treba iti v velike zasebne zdravstvene ali velike diagnostične centre.

Za izvedbo študije ELISA mora imeti laboratorij posebno licenco, osebje in laboratorijski tehniki pa morajo opraviti posebno usposabljanje.

Najpogosteje določen diagnostični center ali laboratorij priporoči zdravnik, ki pacienta pošlje na pregled.

Cena encimskega imunskega testa

Cena te študije je odvisna od regije države in od ravni klinike, ki nudi storitev. V Moskvi se najnižja cena za določitev enega antigena začne pri 700 rubljev. Če je treba naenkrat identificirati več imunoglobulinov, se cena povzame.

V primeru nujne analize se stroški povečajo za 150-200 rubljev. za vsak antigen.

Kljub precej visokim stroškom encimski imunosorbentni test omogoča čim bolj informativen in hiter pregled bolnika, kar skrajša čas pred začetkom zdravljenja in omogoča hitro stabilizacijo stanja osebe.

Ta video predstavlja film "Osnove encimskega imunskega testa".

Kako se izvaja študija ELISA?

Reakcijski mehanizem

Encimsko vezan imunski test temelji na imunskem odzivu antigena s protitelesom, dodajanje encimske oznake protitelesom pa omogoča, da upoštevamo rezultat reakcije antigen-protitelo s pojavom encimske aktivnosti ali z sprememba njegove ravni.

	Prva reakcija se pojavi med odkritim Ig (Ab) in prečiščenim antigenom patogena (Ag), pritrjenim na površino vdolbinic imunološke plošče.
	Za identifikacijo nastalih imunskih kompleksov izvedemo drugo imunološko reakcijo, pri kateri vezan specifični Ig deluje kot antigen in konjugat, ki je Ig (Ab) na ustrezen človeški Ig, označen z encimom peroksidaza (K) , deluje kot protitelesa proti njemu.
	Nato pride do encimske reakcije, ki jo katalizira encimski del molekule konjugata.Substrat te reakcije je brezbarvna snov – kromogen, ki med reakcijo tvori obarvano snov. Intenzivnost barve v vdolbinici je na določen način odvisna od količine imunoglobulinov, ki jih vsebuje vzorec.

Štetje rezultatov

Encimski imunski test

Za serodiagnostiko se uporabljajo polistirenske plošče s 96 vdolbinicami, na stene celic katerih se antigen vnaprej adsorbira. Testni serum se doda v vdolbino plošče. V tem primeru so nanj pritrjena protitelesa, homologna antigenu. Ne-adherentna protitelesa odstranimo s pranjem. Nato se v celice vnesejo protitelesa proti človeškim imunoglobulinom (protitelesa), označena z encimom. Če so bila v testnem serumu zaznavna protitelesa, bodo v tej fazi delovala kot antigeni, s katerimi bodo reagirala označena protitelesa. Dodatek kromogene snovi (barvila) po pranju bo omogočil upoštevanje reakcije z razvojem obarvanja v vdolbinicah. Intenzivnost barve je sorazmerna s količino encima, torej s količino protiteles.Ko merimo optično gostoto (OD) tekočine v celici in jo primerjamo s kontrolnim vzorcem, koncentracijo protiteles izračunamo v enote prostornine.Najpogosteje uporabljen izračun rezultatov v enotah optične gostote.Upoštevati je treba, da za vsak testni sistem obstajajo indikatorji za beleženje rezultatov ter kazalniki norme in patologije, ki jih je treba voditi pri interpretaciji rezultatov. .

Katere okužbe je mogoče odkriti z ELISA

Predvsem v sodobni venerologiji se uporablja za diagnostiko sifilisa (v kombinaciji z drugimi reakcijami), okužbe s HIV, virusnega hepatitisa.Za diagnosticiranje klamidijske okužbe, okužbe s citomegalovirusom in drugih herpetičnih okužb se uporablja tudi metoda ELISA. za določanje protiteles pri različnih nalezljivih boleznih, ravni hormonov, avtoprotiteles in različnih označevalcev raka.

Kako razlagati rezultate ELISA

Študija prisotnosti in ravni protiteles različnih razredov v nekaterih primerih pomaga določiti stopnje nalezljivega procesa

Stadij bolezni	IgM	IgA	IgG
Primarna faza (2 tedna po okužbi)
Primarna faza (2,5-3 tedne po okužbi)
Primarna faza (3-4 tedne po okužbi)
Poslabšanje kronične faze (2 tedna od začetka poslabšanja)
Kronična faza
Preteklost (ozdravljena okužba)
Okrevanje		zmanjšanje titra za 2-4 krat po uspešnem zdravljenju	zmanjšanje titra za 4-8 krat v 1-1,5 mesecih po uspešnem zdravljenju
Negativen rezultat

Žal tako pomembna prednost ELISA, kot je kvantitativno določanje protiteles, pri praktičnem delu ni velikega pomena, tj. ne omogoča natančne postavitve diagnoze in ne vpliva na odmerjanje in čas predpisovanja zdravil.

Kakšna je vloga metode ELISA pri diagnostiki sifilisa

Metoda ELISA pri diagnostiki sifilisa je bila prvič uporabljena leta 1975. Danes se v Rusiji pogosto uporablja za serološko diagnostiko sifilisa in se uporablja kot potrditveni test za sifilis.Navadno se opravi študija, ki odkrije t.i. totalna protitelesa. na antigene treponeme (IgM in IgG), čeprav je v nekaterih primerih mogoče določiti tudi samo "zgodnja" protitelesa razreda M. ELISA pri sifilisu postane pozitivna po 3 tednih od trenutka okužbe in ostane pozitivna precej dolgo tudi po zdravljenju (včasih vse življenje).Zato se kot test, ki potrjuje ozdravitev sifilisa, ELISA ne uporablja.V večini primerov se izvaja le kvalitativno določanje ELISA – t.j. samo pozitiven ali negativen rezultat, čeprav je možna količinska opredelitev.

Za celovito oceno stanja telesa (zlasti njegovih zaščitnih funkcij) je predpisan encimski imunski test (ELISA). Krvni test ELISA se izvaja za diagnosticiranje infekcijskih, avtoimunskih, hematoloških patologij, primarnih in sekundarnih imunskih pomanjkljivosti. V tem članku predlagamo, da podrobneje razmislimo, kaj je krvni test ELISA, pa tudi kakšne so indikacije za njegovo izvajanje.

Indikacije za predpisovanje krvnega testa z ELISA in načelo njegovega delovanja

Kot smo že omenili, je krvni test ELISA laboratorijski test, s katerim določimo antigene ali protitelesa v vzorcu krvi. Ta analiza se uporablja za odkrivanje ravni hormonov, imunoloških kompleksov in imunoglobulinov. Obstajajo naslednje indikacije za opravljanje analize ELISA:

• Diagnoza alergij.
• Diagnoza bolezni virusnega izvora - virus Epstein-Barr, herpes, hepatitis, citomegalovirus.
• Diagnoza spolno prenosljivih okužb - mikoplazma, ureaplazma, sifilis, trichomonas, klamidija.
• Opredelitev imunske pomanjkljivosti.
• Diagnostika onkoloških patologij.
• Ocena učinkovitosti terapije.
• Določanje ravni hormonov.
• Celovit predoperativni pregled.

Načelo encimskega imunosorbentnega testa temelji na preiskavi krvi na prisotnost imunoglobulinov (specifičnih proteinov protiteles). Imunoglobuline proizvaja imunski sistem, ko antigeni (tuji mikroorganizmi) vstopijo v človeško telo. Te imunske molekule se vežejo na različne povzročitelje okužb in jih nevtralizirajo. Pomembna značilnost imunoglobulinov je njihova specifičnost. Zaradi teh lastnosti lahko tvorijo kompleks antigen-protitelo z vezavo na določen antigen. Med izvajanjem krvnega testa ELISA se ta kompleks določi kvantitativno in kvalitativno.

Za to študijo se pogosto uporablja človeška kri. Vendar pa se kot material za analizo lahko vzame vsebina steklastega telesa, amnijske tekočine, cerebrospinalne tekočine. Vzorec krvi se običajno vzame iz pacientove kubitalne vene. Krv je priporočljivo darovati na prazen želodec (od zadnjega obroka naj preteče najmanj 12 ur). Če bolnik jemlje zdravila, je treba o tem obvestiti zdravnika, saj lahko nekatera od njih vplivajo na rezultat testa. Prav tako na zanesljivost rezultatov testov vpliva uživanje drog in alkohola.

Dešifriranje krvnega testa za ELISA

Obrazec za to analizo običajno označuje negativen (-) ali pozitiven (+) rezultat izračuna vsakega razreda imunoglobulinov.

Predlagamo, da razmislimo o razlagi verjetnega dekodiranja krvnega testa za ELISA.

• IgG, IgA niso odkriti in rezultat je negativen IgM - popolno okrevanje.
• Rezultat IgM, IgA, IgG je negativen - ni imunosti proti okužbi.
• IgG, IgA pozitiven in negativen ter IgM pozitiven - akutna okužba.
• Pozitiven rezultat IgG in negativen rezultat IgA in IgM - imunost po cepljenju ali po okužbi.
• Pozitivni ali negativni IgG, IgA in negativni IgM - kronična okužba.
• Rezultat IgG, IgM, IgA je pozitiven - poslabšanje kronične infekcijske patologije.

V encimsko povezanem imunosorbentnem testu krvi so poleg razjasnitve razredov protiteles v dekodiranju navedeni tudi njihovi kvantitativni kazalniki. Njihovo obsežno razlago pa zagotovi le lečeči zdravnik.

Prednosti in slabosti te študije

• Relativno nizki stroški.
• Udobje pri delu.
• Možnost diagnostike v zgodnji fazi domnevne bolezni.
• Relativno visoka natančnost pridobljenih podatkov.
• Za pridobitev rezultatov raziskave je potrebno kratko obdobje.
• Sposobnost spremljanja dinamike razvoja infekcijskega procesa v telesu.
• Visoka stopnja poenotenja, ki omogoča izvajanje množičnih raziskav.
• Avtomatizacija vseh raziskovalnih stopenj.

Pomanjkljivost krvnega testa ELISA je, da lahko v precej redkih primerih daje lažno pozitivne ali lažno negativne rezultate. Tudi pri izvajanju študije je poleg tehničnih napak vzrok za napačne rezultate pri bolniku lahko revmatoidni faktor, prisotnost kroničnih bolezni (pri katerih se proizvajajo protitelesa), jemanje nekaterih zdravil, presnovne motnje.

• Giardiasis
• Ascariasis.
• cisticerkoza.
• Amebiaza.
• Trihinoza - študija se izvaja več kot enkrat, v 4-12 tednih po okužbi se določi najvišja raven protiteles.
• Tenioza.
• Opisthorchiasis - opraviti diferencialno diagnozo med akutnimi in kroničnimi oblikami bolezni.
• Toksoplazmoza.
• Fascioliaza - v akutni fazi bolezni se ugotovi prisotnost protiteles.
• Kožna ali visceralna lišmanijaza.

Torej, lahko povzamemo: za identifikacijo antigenov (odpadnih produktov parazitov in njihove prisotnosti) ter protiteles (imunoglobulina) je treba opraviti test ELISA za parazite. Specifičnost te raziskovalne metode pri določanju parazitov po statističnih podatkih je približno 90-odstotna. Zahvaljujoč tej analizi lahko zdravnik natančno določi vrsto parazitov, njihovo skupno število in tudi sledi dinamiki razvoja patoloških procesov zaradi ravni protiteles.