RIT a RIF sú u neskorého syfilisu negatívne. Aké krvné testy sa odoberajú na syfilis a ako sa interpretujú? Možnosti súkromnej analýzy RIF: absorpcia RIF

Laboratórna diagnostika využíva na získanie čo najpresnejšieho výsledku niekoľko testov na syfilis naraz. To si vyžaduje viac času, ale dáva najpresnejšiu odpoveď.

Najčastejšie je výsledok analýzy RIF prezentovaný v číslach. Dekódovanie má nasledujúce symboly:

• silne pozitívny výsledok je označený 4 plusmi (++++);
• pozitívny výsledok je označený 3 plusmi (+++);
• slabo pozitívny výsledok s 2 plusmi (++);
• pochybný výsledok 1 plus (+);
• negatívny výsledok je označený 1 mínus (-).

Výsledok RIF pre syfilis je tiež prezentovaný ako percento, ktoré závisí od kvantitatívneho ukazovateľa pridružených baktérií:

• ak je výsledok negatívny, imobilizácia je až 20 %;
• so slabo pozitívnym výsledkom sa imobilizácia pohybuje od 20 do 50%;
• pri pozitívnom výsledku je imobilizácia nad 50 %.

Ak je výsledok pozitívne odpoveď, potom to naznačuje prítomnosť choroby.

Ak výsledok slabo pozitívne, potom to znamená jediné množstvo zvyškových protilátok v krvi.

Negatívne výsledok indikuje absenciu treponema pallidum, čo znamená, že pacient je zdravý.

Skúsení lekári na našej klinike diagnostikujú syfilis rýchlo a s vysokou presnosťou. Preto sme sociálne orientovaní na všetky vrstvy obyvateľstva náklady na analýzu RIF sú lacné. Cena je uvedená v tabuľke na našej stránke.

Pri sérologickej diagnostike syfilisu je veľmi dôležité získať spoľahlivý a presný výsledok.

Na zlepšenie kvality údajov sa prijímajú určité opatrenia:

• Testovacie sérum sa zriedi 200-krát (1:200), aby sa predišlo falošne pozitívnym reakciám. Potom hovoria, že sa to vykonáva test na syfilis RIF 200.
• V ďalšej možnosti sa pri riedení séra 1:5 dodatočne používa špeciálny absorbent, ktorý zbiera protilátky „navyše“, aby neskresľovali výsledky.

Výskumníkom hrá do karát aj veľkosť treponém. Veľké mikrobiálne telá spirochét sú jasne viditeľné pod fluorescenčnou mikroskopiou. Ak sa na ne „prilepia“ fosforom označené proteíny zo séra. Použitie štandardizovaného antigénu a séra nám umožňuje maximalizovať senzitivitu a špecifickosť RIF pri diagnostike syfilisu.

Možnosti súkromnej analýzy RIF: absorpcia RIF

Jedna z alternatívnych metód sa nazýva RIF-Abs. Od bežnej metódy sa líši nízkym riedením testovacieho séra - 1:5 oproti 1:200, ako obvykle.

Koncentrovaná vzorka obsahuje veľa aktívnych proteínových molekúl.

Na zabránenie a zvýšenie citlivosti je sérum ošetrené špeciálnym absorbentom vyrobeným z fragmentov syfilitických spirochét. Sorbent zbiera príliš aktívne protilátky a potom sa vzorka ošetrí priemyselným fosforom značeným sérom. Vďaka tejto predbežnej príprave sú eliminované všetky nepotrebné molekuly, ktoré by mohli ovplyvniť výsledky testu.

Umiestňuje sa podľa nasledujúcich indikácií:

• Pozitívne na pozadí klinickej pohody a bez anamnézy rizík infekcie.
• Pozitívna RV u pacientov trpiacich chronickými ochoreniami.
• Negatívna RV, keď sa objavia príznaky podozrivé zo syfilisu.

Prvé pozitívne výsledky sa objavia už 15-16 deň od okamihu infekcie. Ak sa reakcia zmení z pozitívnej na negatívnu, signalizuje to úplné vyliečenie syfilisu. Pravdepodobnosť falošne pozitívneho výsledku je menšia ako 0,4 %.

Táto situácia môže nastať pri vyšetrovaní onkologických pacientov, alkoholikov, tehotných žien a ľudí trpiacich poruchami imunity.

Určitý podiel tvoria technické chyby, keďže výroba je pomerne zložitá. Sú chvíle, kedy je potrebné rozlíšiť vrodenú patológiu od získanej. Môžete to urobiť, ak budete hľadať odlišné typy protilátky v krvi pacienta.

Protilátky proti syfilisu triedy M (IgM) sa objavia krátko po infekcii a sú oveľa rýchlejšie ako IgG. Umožňuje vám ich identifikovať analýza absorpcie RIF syfilisom IgM. Ak sú výsledky tejto reakcie pozitívne, potom môžeme hovoriť o nedávnej infekcii. Takto možno odlíšiť prípady reinfekcie od relapsu alebo odhaliť infekciu dieťaťa po pôrode.

Na základe výsledkov tejto techniky analýzy RIF sa tiež vyvodzuje záver o účinnosti liečby skorého syfilisu.

Ak máte podozrenie na syfilis, obráťte sa na skúseného venerológa.

Analýza na syfilis sa vykonáva pomocou mnohých metód na detekciu patogénu. S rozvojom patológie sa preto objavuje veľké množstvo špecifických znakov, aby sa zistilo presná diagnóza chorý je vyšetrený komplexne. Všeobecný krvný test nie je veľmi informatívny a nepoužíva sa na diagnostiku tejto sexuálne prenosnej infekcie.

Typy výskumu a biomateriály na analýzu

Na identifikáciu ochorenia sa používajú rôzne techniky a biomateriály. Zapnuté skoré štádia Syfilis sa určuje pomocou bakterioskopického testu. Vzorky sa skúmajú pod mikroskopom. Prístroj umožňuje odhaliť kmene patogénov. Sérologické krvné testy sa vykonávajú neskôr. Vďaka nim sa vo vzorkách zisťujú antigény a protilátky syfilisu.

Metódy určovania pohlavne prenosných infekcií sú rozdelené do 2 kategórií:

• Priama, identifikácia patogénnych mikroorganizmov. Patria sem: mikroskopia v tmavom poli, analýza RIT (infekcia králikov biomateriálom na výskum), metóda PCR - polymeráza reťazová reakcia(s jeho pomocou sa nachádzajú genetické prvky patogénu).
• Nepriame (sérologické) testy umožňujú detekciu protilátok proti patogénu. Vyrábajú sa imunitný systém ako odpoveď na infekciu.

Sérologické techniky sú rozdelené do 2 kategórií: treponémové a netreponémové.

• Netreponemálne, vrátane: toluidínového červeného testu, RSC analýzy, RPR testu, krvného testu pomocou expresnej RMP metódy.
• Treponém, vrátane: imunoblotovania, testu RSK, analýzy RIT, štúdie RIF, testu RPGA, analýzy ELISA.

Informačný obsah testov na infekciu sa líši. Najčastejšie sa robia hlavné typy testov na syfilis, ktoré zahŕňajú sérologické metódy.

Biomateriál pre výskum

Na identifikáciu Treponema pallidum, patogénu, ktorý vyzerá ako špirála a spôsobuje syfilis, sa odoberajú vzorky:

• venózna krv;
• cerebrospinálna tekutina (sekrécia z miechového kanála);
• obsah lymfatických uzlín;
• ulceračné tkanivo.

Ak je potrebné vykonať testy na zistenie syfilisu, krv sa daruje nielen z kubitálnej žily, ale aj z prsta. Výber biomateriálu a spôsob vyšetrenia sú ovplyvnené závažnosťou infekcie a vybavením diagnostického centra.

Priamy výskum

Presvedčivým dôkazom syfilisu je identifikácia infekčných agens pod mikroskopom. Týmto spôsobom sa patogén nájde u 8 z 10 jedincov. Negatívny výsledok u 2 zostávajúcich pacientov neznamená, že nie sú infikovaní.

Štúdia sa uskutočňuje v primárnych a sekundárnych štádiách (štádiách) ochorenia, ktoré sú charakterizované výskytom kožných vyrážok a syfilómov (ulcerácií) na epiteliálnych tkanivách alebo slizniciach. Vo výtoku z lézií sa nachádzajú patogény, ktoré spôsobujú sexuálne prenosné choroby.

Presnejšie, komplexný test nazývaný RIF, imunofluorescenčná reakcia, dokáže odhaliť treponémy. Vzorka na výskum je vopred ošetrená fluorescenčnými protilátkami. Zlúčeniny, ktoré môžu svietiť, sa zlepia s baktériami. Pri skúmaní vzoriek pod mikroskopom v prípade infekcie laboratórny technik vidí šumivé patogény.

Test sa používa na včasnú diagnostiku ochorenia. Čím dlhšie choroba trvá, tým nižšia je citlivosť výskumných metód. Okrem toho padá po liečbe vyrážok a vredov Antiseptiká a u pacientov podstupujúcich liečbu. Príležitostne štúdia dáva falošne negatívne a falošne pozitívne.

RIT analýza je vysoko presná metóda na detekciu syfilisu. Pri vykonávaní testu musíte na výsledky dlho čakať. Kým infikovaný králik nevykazuje príznaky infekcie. Test sa používa veľmi zriedkavo, napriek tomu, že je mimoriadne presný.

Používaním polymerická reťazová reakcia Syfilis je určený genetickými prvkami patogénov. Jedinou nevýhodou PCR je jej vysoká cena.

Netreponemálne testy

Takéto krvné testy pomáhajú identifikovať protilátky, ktoré sa objavujú ako odpoveď na kardiolipín, zlúčeninu súvisiacu so všeobecnou štruktúrou membrán patogénov.

Wassermanova reakcia (RW alebo RW)

Najznámejším testom na syfilis je Wassermanova reakcia. RV je zaradená do kategórie komplement fixačných reakcií (CFR). Nové metódy RSC majú významné rozdiely od tradičných RW. Ale sú označené, ako predtým, konceptom „Wassermannovej reakcie“.

Imunitný systém syntetizuje protilátky (markery) ako odpoveď na treponémovú inváziu. Zisťujú sa krvným testom na syfilis pomocou Wassermanovej reakcie. Pozitívny výsledok RW potvrdzuje, že subjekt je infikovaný.

Hemolytická reakcia – index RT analýzy. S ním interagujú dve látky: hemolytické sérum a ovčie červené krvinky. Sérum sa vyrába imunizáciou králika ovčími červenými krvinkami. Aktivita biologická tekutina znížená zahrievaním.

Indikátory RV závisia od toho, či došlo k hemolýze alebo nie. Vo vzorke bez markerov dochádza k hemolýze. V tomto prípade je reakcia na antigény nemožná. Doplnok sa vynakladá na interakciu s ovčími červenými krvinkami. Keď sú vo vzorke markery, kompliment reaguje s antigénmi. V tomto prípade nedochádza k hemolýze.

Treponemálne testy na syfilis. Všeobecný popis.

Na spoľahlivú diagnostiku syfilisu a identifikáciu antisyfilitických protilátok v tele pacienta (v krvnom sére alebo mozgovomiechovom moku) sa používajú špeciálne technológie laboratórny výskum- takzvané sérologické metódy.

Pri vykonávaní diagnostických testov na syfilis sa používajú rôzne sérologické reakcie: aglutinácia, precipitácia, imunofluorescencia, fixácia komplementu, enzýmová imunoanalýza atď. Všetky tieto sérologické reakcie sú založené na interakcii antigénov a protilátok.

Špecifické sérologické testy sú tzv treponém pretože tieto testy používajú Treponema pallidum alebo ich antigény, teda antigény treponémového pôvodu. Účelom treponémových testov je identifikovať špecifické protilátky proti antigénnym štruktúram pôvodcu syfilisu, teda protilátky namierené špecificky proti samotným baktériám T. Pallidum, a nie proti telesným tkanivám poškodeným treponémom. Špecifické antitreponémové protilátky triedy IgM je možné zistiť už na konci druhého týždňa ochorenia.

7. Falošne pozitívne a falošne negatívne výsledky

Pozitívne výsledky RV na syfilis u jedincov, ktorí netrpia týmto ochorením, sa nazývajú falošne pozitívne. Miera falošne pozitívnych výsledkov u zdravých jedincov je 0,2 – 0,25 %. Ak je percento nešpecifických falošne pozitívnych výsledkov RT u zdravých ľudí veľmi malé, potom pri niektorých ochoreniach môže byť vysoké.

Všetky nešpecifické výsledky sérologických reakcií možno rozdeliť do nasledujúcich hlavných skupín:

1. Choroby spôsobené prítomnosťou bežných antigénov u podobných patogénov (spirochéty): recidivujúca horúčka, yaws, bejel, pinta, orálny treponém, leptospira.

2. Pozitívne reakcie spôsobené zmenami metabolizmu lipidov a zmenami sérových globulínov. Patria sem pozitívne výsledky u tehotných žien, pacientov s dnou, poruchami lipidov v dôsledku otravy olovom, fosforom, po užití salicylátu sodného, ​​digitalisu atď. Medzi tieto reakcie by mali patriť aj pozitívne reakcie pri niektorých infekčných ochoreniach ( týfus malária, zápal pľúc, lepra, endokarditída, kolagenóza, infarkt myokardu, otras mozgu, onkologické ochorenia cirhóza pečene atď.)

3. Technické chyby. Nesprávny výber dávky komplementu, nedodržanie podmienok a doby skladovania činidiel, vylúčenie vzoriek kontrolného krvného séra z testu, použitie kontaminovaných skúmaviek a nástrojov.

8. Modifikácia Wassermanovej reakcie

Existujú modifikácie Wassermanovej reakcie v kvalitatívnych a kvantitatívnych verziách, v chlade, s cerebrospinálnou tekutinou.

Úprava RV za studena sa ukázalo byť citlivejším. Zvláštnosťou spôsobu inscenovania Wassermanovej reakcie v chlade sú trojfázové teplotné režimy, pri ktorých dochádza k fixácii komplementu. Táto reakcia sa uskutočňuje aj s kardiolipínovými a treponémovými antigénmi.

Okrem kvalitatívneho hodnotenia RF existuje aj metóda na jeho vykonanie kvantitatívne vyhlásenie s rôznymi riedeniami krvného séra (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Reaginový titer je určený maximálnym zriedením, ktoré stále poskytuje výrazne pozitívny výsledok (4+). Kvantitatívny staging RV je dôležitý pri diagnostike niektorých foriem syfilisu a pri monitorovaní účinnosti terapie.

9. Rozsah pôsobnosti

V Rusku je RSKt súčasťou súboru štandardných sérologických testov na syfilis (SSR).

Využíva sa Wassermanova reakcia s treponémovým a kardiolipínovým antigénom (RSKt).

• diagnostika všetkých foriem syfilisu,
• kontrolu nad účinnosť liečby,
• vyšetrenie osôb, ktoré mali sexuálny kontakt s pacientom so syfilisom,
• vyšetrenie osôb s klinickým a anamnestickým podozrením na syfilis
• pri preventívnej prehliadke na syfilis pacientov v psychiatrických a neurologických liečebniach, darcov a tehotných žien vrátane osôb odoslaných na umelé prerušenie tehotenstva.

V súčasnosti sa na základe nariadenia Ministerstva zdravotníctva Ruskej federácie odporúča nahradiť RSCT citlivejšími treponémovými metódami (ELISA alebo RPGA).

V zahraničí sa Wassermanova reakcia s treponémovým antigénom v klinickej laboratórnej praxi dlhodobo nepoužíva a nie je zaradená do zoznamu štandardných testov odporúčaných Svetovou zdravotníckou organizáciou.

Komplex klasických sérologických reakcií (CSR)

KSR- Toto komplex reakcií, ktorý sa používa na sérodiagnostiku syfilisu ako štandardná metóda. Tento komplex reakcií zahŕňa Wassermannovu reakciu s kardiolipínovým antigénom (extrakt z hovädzieho srdca obohatený o lecitín a cholesterol) a treponémovým antigénom (ultrazvukom upravená suspenzia apatogénneho kultivovaného treponemes pallidum), ako aj mikroprecipitačnú reakciu (MPR) s plazma alebo inaktivované sérum, do ktorého sa pridá kardiolipínový antigén

CSR sa stávajú pozitívnymi v polovici primárneho obdobia (jeho rozdelenie na séronegatívne a séropozitívne je presne určené CSR), v sekundárnom období sú CSR pozitívne u 98-100% pacientov a v terciárnom období - len v r. 60-70 %. To znamená, že s predlžujúcim sa trvaním ochorenia sa pozitivita CSR postupne znižuje.

Výhody DAC:

1) Lacnosť, jednoduchosť a rýchlosť montáže. To platí najmä pre mikroprecipitačnú reakciu: RMP je v súčasnosti hlavnou skríningovou (výberovou) metódou;

2) Netreponemálne testy sú vhodné na sledovanie vyliečenia syfilisu.

Nevýhody DAC:

1) Subjektivita pri posudzovaní výsledkov reakcií („od oka“);

2) Nízka citlivosť v neskorých formách syfilisu;

3) Nedostatok špecifickosti v porovnaní s viacerými moderné testy. Keď sa vykonávajú, často sa pozorujú falošne pozitívne reakcie (FPR).

LPR môže byť spôsobená skríženou reaktivitou medzi svetlou spirochétou a inými mikróbmi, poruchami metabolizmu lipidov a bielkovín, nestabilitou bunkové membrány tvorba autoprotilátok. LPR sa pozorujú pri akútnych (malária, infekčná mononukleóza atď.) a chronických (tuberkulóza, lepra, hepatitída, borelióza atď.) infekciách, infarkte myokardu, cirhóze pečene, kolagenóze (najmä pri SLE), onkopatológii, očkovaní, užívaní drog, zneužívanie alkoholu a mastných jedál. Falošne pozitívne sa môžu vyskytnúť v posledných týždňoch tehotenstva, po pôrode a u niektorých žien aj počas menštruácie. Falošne negatívne výsledky DSC môžu byť spojené s infekciou HIV.

RIT, RIBT - Treponema pallidum imobilizačná reakcia

Treponema pallidum imobilization test (TPI) je klasická metóda, ktorá sa používa na detekciu špecifických protilátok proti treponemu. Reakcia RIBT využíva ako antigén patogénny Treponema pallidum T. pallidum (kmeň Nichols) pestovaný v semenníku králika. RIBT je založený na strate motility živého Treponema pallidum po expozícii protilátkam z krvného séra a komplementu pacienta. Výsledky sa hodnotia pomocou mikroskopie v tmavom poli. Hoci bol RIBT test zavedený do klinickej praxe ako špecifický test na syfilis, jeho použitie je náročné na prácu, technicky zložité, časovo náročné a nákladné.

1. História metódy RIBT

Imobilizačný test Treponema pallidum (TPI) je vlastne prvým špecifickým testom na diagnostiku syfilisu. Túto reakciu zaviedli v roku 1949 americkí výskumníci R. W. Nelson a M. M. Mayer a podrobne ju rozobrali v r. vedeckých prác v nasledujúcich desaťročiach. Neúspešné pokusy použiť živé treponémy v testoch boli vykonané už predtým. Vďaka tomu, že Nelson dokázal vytvoriť prostredie, v ktorom treponémy zostali životaschopné až 8 dní, bol jeho výskum úspešný.

2. Princíp metódy RIBT

Metóda je založená na fenoméne straty motility treponema pallidum v prítomnosti imobilizujúcich antitreponemálnych protilátok testovaného krvného séra a komplementu za anaeróbnych podmienok. Antigén je živý patogénny Treponema pallidum získaný z králikov umelo infikovaných syfilisom.

3. Nastavenie testu RIBT

Reakcia zahŕňa testované sérum, komplement a antigén. Krvné sérum subjektu sa pridá k živému treponému získanému z králičieho testikulárneho tkaniva po umelej infekcii. Ak sú v sére anti-treponémové protilátky-imobilizíny, treponema pallidum sa prestane pohybovať (imobilizovať). Protilátky proti imobilizínu sú neskoré antitreponemálne protilátky.

Reakcia sa uskutočňuje s tepelne inaktivovanými sérami alebo so vzorkami sér vysušenými na voskovom papieri (suché kvapky). Inaktivácia séra zahrievaním sa uskutočňuje 30 minút pri teplote 56 °C. Pred odberom krvi by vyšetrovaný nemal dostať lieky, najmä penicilín. Užívanie liekov sa preruší na dobu ich trvania možné oneskorenie v organizme.

Ako antigén sa používajú baktérie kmeňa Nichols získané zo 7–10-dňovej králičej syfilitickej orchitídy (zápal semenníka). Obdobie od okamihu nastavenia reakcie po zaznamenanie jej výsledkov trvá 18-20 hodín, preto je na udržanie životaschopnosti a dobrej mobility mikroorganizmov nevyhnutné prostredie na prežitie.

RIBT používa doplnok z morčiat. Na získanie komplementu sa musí odobrať krv za sterilných podmienok niekoľkým morčatám.

V prípade bakteriálnej kontaminácie je komplement odmietnutý. Konzervovaný komplement nemožno použiť pri imobilizačnej reakcii Treponema pallidum, pretože je toxický pre mikroorganizmy.

Imobilizačná reakcia využíva nadbytok komplementu. Jeho množstvo do značnej miery závisí od prostredia prežitia Treponema pallidum.

RIBT sa umiestni do sterilných boxov, vopred ožiarených baktericídnym prostriedkom kremenná lampa do 45-60 minút. Každé krvné sérum sa vyšetruje v dvoch skúmavkách: skúsený A ovládanie. Testovacie sérum a antigén sa pridajú do oboch skúmaviek v požadovaných množstvách. Aktívny komplement sa naleje do skúmavky a rovnaké množstvo inaktivovaného krvného séra sa naleje do kontrolnej skúmavky. morské prasa. Po naplnení sa obsah skúmaviek premieša jemným pretrepaním.

RIBT sa vyskytuje v anaeróbnych podmienkach. Skúmavky s prísadami sa umiestnia do mikroanaerostatu, z ktorého sa pomocou vákuovej pumpy odsaje atmosférický vzduch a z valca sa čerpá plynná zmes (95 dielov dusíka a 5 dielov oxidu uhličitého). Mikroanaerostat so skúmavkami sa umiestni do termostatu (35 °C) na 18-20 hodín.

Výsledky RIBT sa hodnotia po vybratí skúmaviek z termostatu a mikroanaerostatu (t.j. po 18-20 hodinách experimentu). Pasteurovou pipetou sa nanesie kvapka obsahu skúmavky na podložné sklíčko, ktoré sa prekryje krycím sklíčkom a skúma sa v mikroskope v tmavom poli (objektív 40, okulár 10X). V rôznych častiach preparátu sa skúma niekoľko zorných polí, pričom v každej sa počíta počet mobilných a imobilných treponém pallidum. Počítanie začína liekom z kontroly a potom zo skúmavky.

Pri nastavovaní reakcie sa používa 5 kontrolných štúdií: so zjavne pozitívnym a negatívnym krvným sérom, s aktívnym a inaktivovaným komplementom a médiom na prežitie pre Treponema pallidum. Kontrolné negatívne krvné sérum sa používa na posúdenie stupňa motility Treponema pallidum v tomto experimente. Kontrolné pozitívne krvné sérum - na posúdenie stupňa imobilizačnej aktivity v podmienkach tohto experimentu. Uskutočňuje sa štúdia aktívneho a inaktivovaného komplementu a prostredia, aby sa určil ich účinok na motilitu Treponema pallidum.

Ak je v experimente nedostatok komplementu, imobilizujúce protilátky nevykazujú správne svoju aktivitu a treponémy zostávajú pohyblivé. Preto sa po experimente stanoví zvyškový komplement, aby sa posúdilo, či motilita Treponema pallidum v skúmavkách bola spôsobená nedostatkom komplementu. Na tento účel sa používa hemolytický systém - zmes suspenzie ovčích erytrocytov a zriedeného hemolytického séra uchovávaná v termostate.

Zvyškový komplement sa stanoví pridaním požadovaného objemu hemolytického systému do každej skúmavky. Skúmavky sa umiestnia do termostatu na 37 °C na 45 minút. V skúmavkách by malo dôjsť k hemolýze červených krviniek, v kontrolných skúmavkách by malo dôjsť k oneskoreniu hemolýzy. Neprítomnosť hemolýzy v skúmavkách naznačuje nedostatočné množstvo komplementu, v týchto prípadoch sa musí štúdia zopakovať. Opakované vyšetrenie krvného séra sa nevykonáva iba vtedy, ak je zaznamenaná 100% imobilizácia Treponema pallidum.

4. Účtovanie výsledkov RIBT

Počítanie imobilizovaných treponém, ktoré stratili svoju pohyblivosť, sa uskutočňuje pod mikroskopom pomocou metódy mikroskopie v tmavom poli. Od výskumníka sa vyžaduje, aby mal schopnosť posúdiť pohyb treponém. Mal by venovať pozornosť intenzite pohybov spôsobených Treponema pallidum. U tejto baktérie nie je vždy možné pozorovať vlnovité kontrakcie a ohybové pohyby, niekedy len rotačné. Mali by ste byť tiež schopní rozlíšiť aktívne pohyby treponém od pohybu s prúdením tekutín.

Na posúdenie výsledkov reakcie sa vypočíta percento imobilizácie bledého treponému, t. j. pomer mobilných a imobilných treponémov v experimente (s aktívnym komplementom) a kontroly (s neaktívnym komplementom) podľa vzorca:

X = (M – C) x 100/M

kde M je počet mobilných treponém v kontrole; C je počet mobilných treponém v experimente; X - % imobilizácie. IN praktická práca percento imobilizácie sa určí z vopred zostavenej tabuľky s použitím vyššie uvedeného vzorca.

Imobilizačná reakcia Treponema pallidum sa hodnotí ako

• pozitívne počas imobilizácie 51 - 100% treponéma,
• slabo pozitívne: 31 - 50% nepohyblivé treponémy,
• pochybný: 21 - 30% nepohyblivé treponémy,
• negatívne: 0 - 20% nepohyblivé treponémy.

Imobilizačná reakcia Treponema pallidum sa stáva pozitívnou na konci primárneho - začiatku sekundárneho obdobia syfilisu (od 7. do 8. týždňa od okamihu infekcie alebo viac). RIBT je však málo užitočný na diagnostiku skorých štádií syfilisu, pretože protilátky, ktoré imobilizujú Treponema pallidum a sú detegované v reakcii, sa objavujú až 3-6 týždňov po infekcii. Protilátky proti imobilizínu patria do triedy imunoglobulínov IgG. Objavujú sa v krvi neskôr ako reagins (antikardiolipínové protilátky), neskôr ako fluoresceínové protilátky (detegované RIF a ELISA) a precipitíny (detekované rakovinou močového mechúra).

V budúcnosti zostáva RIBT pozitívny. Pri neskorých formách syfilisu je vysoká citlivosť reakcie. V prípade sekundárneho, neskorého syfilisu, neurosyfilisu, vrodeného syfilisu je pozitívny výsledok RIBT zaznamenaný v 95–100 % prípadov. Pri terciárnom syfilise so špecifickými léziami vnútorných orgánov a nervového systému, keď je RV často negatívna, RIBT dáva pozitívne výsledky v 98 - 100% prípadov.

RIBT na dlhú dobu bol uznaný ako najšpecifickejší test na syfilis. Špecifickosť RIBT je podľa literatúry 99 %, senzitivita sa pohybuje od 79 do 94 %. Podľa TsNIKVI je citlivosť RIBT (celkovo pre všetky štádiá syfilisu) 87,7%.

7. Rozsah použitia metódy

Rozsah použitia RIBT sa postupne zužuje z dôvodu trvania inštalácie, vysokých nákladov a náročnosti práce. RIBT je pomerne zložitá a nákladná analýza, ktorá si vyžaduje vysoko kvalifikovaný personál a prítomnosť vivária. V tejto súvislosti sa v posledných rokoch výrazne znížilo používanie tejto metódy. V USA sa tento test v súčasnosti používa iba vo výskumných laboratóriách.

Na základe zložitosti a vysokých nákladov na RIF a RIBT má zmysel ich používať na diagnostiku neskorých a latentných foriem syfilisu. RIBT si zachováva svoju pozíciu „arbitera reakcie“ v diferenciálnej diagnostike skorých latentných foriem syfilisu a falošne pozitívnych výsledkov. Táto reakcia môže byť užitočná pri diagnostike neurosyfilisu a pri rozdielnych výsledkoch iných sérologických testov.

RIBT sa stáva pozitívnym oveľa neskôr ako RIF a RV. Preto sa nepoužíva na diagnostiku infekčných foriem syfilisu.

RIBT, podobne ako RIF, je počas antisyfilitickej liečby veľmi pomaly negatívny. V dôsledku toho nie je vhodný na sledovanie postupu antisyfilitickej terapie.

Falošne pozitívne výsledky (FPR) s RIBT sú zriedkavé a boli zaznamenané najmä pri mnohých treponematózach (yaws, pinta, bejel), ktoré sa v Rusku nenachádzajú, ako aj pri lepre, sarkoidóze, SLE, tuberkulóze, cirhóze pečene a niektorých iných zriedkavých chorôb nesyfilitickej povahy. S vekom pacientov sa počet falošne pozitívnych výsledkov RIBT zvyšuje.

RIBT môže byť falošne pozitívny, ak testované sérum obsahuje treponemocídne látky (napríklad penicilíny, tetracyklíny, erytromycín), ktoré spôsobujú nešpecifickú imobilizáciu Treponema pallidum. Môže to byť dôsledok toho, že pacient užíva treponemocídne antibiotiká, preto sa vyšetrenie nevykonáva pre osoby, ktoré dostali antibiotiká minulý mesiac. Krv na RIBT sa môže testovať najskôr 2 týždne po ukončení užívania antibiotík a iných antisyfilitických liekov.

9. Modifikácie imobilizačnej reakcie Treponema pallidum

Okrem mikroanaerostatovej techniky existuje melanžová metóda RIBT podľa N.M. Ovčinnikov. Anaeróbne podmienky pri nastavovaní reakcie sa vytvárajú umiestnením reakčnej zmesi do melangeru (miešača leukocytov), ​​ktorého oba konce sú uzavreté gumovým krúžkom. Technika melanžovej reakcie vám umožňuje zaobísť sa bez vákuovej pumpy, valca so zmesou dusíka a oxidu uhličitého alebo mikroanaerostatu. Porovnávacia štúdia na veľkom klinickom materiáli priniesla výsledky, ktoré nie sú horšie ako klasická anaerostatická technika.

10. Vlastnosti, výhody a nevýhody RIBT

RIBT je technicky zložitá a nákladná diagnostická metóda. Táto technológia si vyžaduje značné finančné prostriedky na chov králikov a vykonávanie testov. Tento pracný test sa v súčasnosti používa najmä na vedecké účely. Vo väčšine zahraničných krajín sa RIBT už takmer 40 rokov prakticky nepoužíva na diagnostické účely, ale iba vo výskumnej práci.

Nevýhody reakcie:

• RIBT vyžaduje prácu so živým patogénnym Treponema pallidum kmeňa Nichols, ktorý zostáva infekčný pre ľudí napriek adaptácii na králiky
• stupňovanie reakcie je zložité, časovo náročné a drahé
• je potrebné vivárium
• Na nastavenie reakcie, zaznamenávanie výsledkov a údržbu vivária je potrebný vysokokvalifikovaný personál
• subjektívnosť hodnotenia výsledkov
• nedostatok automatizácie
• túto sérologickú metódu nie je možné štandardizovať.
• reakcia nie je použiteľná na pozadí prebiehajúcej antisyfilitickej terapie
• nemožnosť použiť na kontrolu liečby. RIBT u pacientov so syfilisom môže zostať pozitívny po mnoho rokov (a dokonca po celý život), napriek tomu, že dostávajú úplnú liečbu.
• reakcia môže poskytnúť falošne pozitívne výsledky u pacientov s malígnymi nádormi, cukrovkou, leprou, autoimunitnými ochoreniami, zápalom pľúc a ťažkou kardiovaskulárnou patológiou.

Výhody RIBT sú:

1) Dostatočne vysoká citlivosť;

2) Vysoká špecifickosť.

RIF (Imunofluorescenčná reakcia)

Imunofluorescenčná reakcia (RIF) je rýchla diagnostická metóda na identifikáciu mikrobiálnych antigénov alebo stanovenie protilátok. Testy založené na detekcii fluorescenčného signálu sa považujú za jeden z najlepších testov na syfilis.

1. História metódy

Test fluorescenčnej treponemálnej protilátky (FTA) bol prvýkrát vyvinutý v roku 1957 Deaconom a spoluautormi (Deacon, Falcone a Harris).

2. Princíp metódy

Metóda RIF je založená na skutočnosti, že tkanivové antigény alebo mikróby ošetrené imunitným sérom s protilátkami značenými fluorochrómmi sú schopné žiariť v UV lúčoch fluorescenčného mikroskopu. Baktérie v nátere ošetrenom takýmto luminiscenčným sérom žiaria pozdĺž obvodu bunky vo forme zeleného okraja

Ako antigén v RIF sa používa suspenzia živého patogénneho bledého Treponema kmeňa Nichols z králičej orchitídy, ktorá sa suší na podložnom sklíčku a fixuje sa acetónom. Krvné sérum pacienta sa pridá do Treponema pallidum, vysuší sa a zafixuje sa v skle acetónom.

Po premytí sa liek ošetrí sérom obsahujúcim protilátky proti ľudským imunoglobulínom značeným fluoresceínom. Prípravok sa znova premyje a skúma pod fluorescenčným mikroskopom. Ak testovacie sérum obsahuje protilátky proti treponému fluoresceínu, zaznamená sa žltozelená žiara treponémov.

3. Spôsob realizácie výskumu metódou RIF

Antigén fixovaný na podložnom sklíčku (patogénny Treponema pallidum) sa ošetrí testovacím sérom. Po premytí sa liek ošetrí fluorescenčným sérom proti ľudským imunoglobulínom, označeným fluorochrómom. V tomto prípade sa výsledný fluorescenčný komplex (anti-humánny globulín + fluoresceín tioizokyanát) naviaže na ľudský globulín na povrchu treponema pallidum, čím sa zabezpečí žiara treponema pallidum pod fluorescenčným mikroskopom.

Na detekciu komplexov antigén-protilátka sa používa luminiscenčné sérum reprezentujúce protidruhové (protiľudské) imunoglobulíny konjugované s FITC. Prítomnosť protilátok proti treponémom v sére je určená žiarou treponémov pri skúmaní pod fluorescenčným mikroskopom. Test sa vykonáva v kvalitatívnych a semikvantitatívnych verziách.

4. Účtovanie výsledkov

Vizualizácia výsledkov RIF sa uskutočňuje pomocou fluorescenčného mikroskopu. Výsledky sa hodnotia podľa stupňa luminiscencie treponémov v prípravku. V prítomnosti protilátok je žiara treponémov viditeľná, ale ak v sére neboli žiadne protilátky proti treponému, potom treponémy nie sú viditeľné. Stupeň luminiscencie vysušeného svetlého treponému fixovaného na sklo sa uvádza v „plusoch“ (od „–“ po „++++“). Negatívny výsledok – žiadna žiara alebo úroveň pozadia – 1+.

5. V akých obdobiach choroby je lepšie užívať

Imunofluorescenčná reakcia (RIF) je pomerne citlivá vo všetkých štádiách infekcie, od konca inkubačnej doby až po neskorý syfilis. Primárne obdobie syfilisu v klasickom priebehu začína 3-4 týždne po infekcii. RIF sa stáva pozitívnym v prvých dňoch primárneho obdobia alebo dokonca na konci inkubačná doba, od 3. týždňa po infekcii. Výsledky RIF zostávajú pozitívne vo všetkých obdobiach, vrátane neskorých foriem.

RIF sa stáva pozitívnym o niečo skôr ako RV. Podľa niektorých údajov sa pozitívny RIF vyskytuje u 80 % pacientov s primárnym séronegatívnym syfilisom. V sekundárnom období je RIF pozitívny takmer v 100% prípadov. Pri latentnom syfilise je vždy pozitívny a pri neskorých formách ochorenia a vrodenom syfilise dáva 95 - 100 % pozitívnych výsledkov.

6. Citlivosť a špecifickosť

Imunofluorescenčná reakcia (RIF) je skupina metód s vysokou senzitivitou a špecifickosťou. RIF je citlivý vo všetkých štádiách infekcie, od inkubačnej doby až po neskorý syfilis. Podľa WHO je citlivosť RIF pre primárny syfilis 70-100%, pre sekundárny a neskorý syfilis - 96-100%, špecificita - 94-100%. Podľa TsNIKVI je citlivosť RIF pre všetky formy syfilisu 99,1%.

Špecifickosť RIF je možné zvýšiť predúpravou testovacieho séra sorbentom – ultrazvukovým treponémovým antigénom, ktorý viaže skupinové protilátky (RIF-abs).

7. Rozsah použitia metódy

RIF sa používa:

• ako potvrdzujúca reakcia pri včasnom, latentnom syfilise
• pri stanovení retrospektívnej diagnózy
• na odlíšenie latentných foriem syfilisu a falošne pozitívnych výsledkov testov na syfilis.
• ako potvrdzujúci test na neurosyfilis.

RIF je široko používaný ako potvrdzujúci test, ale nie je určený na rutinné použitie alebo skríning, pretože je technicky náročný. Na vykonanie RIF je potrebné mať vivárium alebo získať suspenziu patogénneho Treponema pallidum, čo obmedzuje možnosti reakcie. V posledných rokoch sa však na domácom trhu začali objavovať testovacie systémy, ktoré umožňujú uskutočniť reakciu bez vivária a vlastného laboratórneho kmeňa patogénneho Treponema pallidum.

8. Zdroje a príčiny chýb pri výrobe, falošne pozitívne a falošne negatívne výsledky

LPR sú zriedkavé, keď je diagnostikovaná RIF (pri kolagenóze, borelióze).

RIF sa stále považuje za jeden z najlepších testov na syfilis, „zlatý štandard“ sérodiagnostiky. RIF sa nastavuje jednoduchšie ako RIBT,

Napriek vysokej diagnostickej hodnote, rozsiahle zavedenie RIF v každodenná prax brzdená potrebou použitia živého T. pallidum, vysokými nákladmi a trvaním štúdie. Nastavenie reakcie je náročné na prácu. Hodnotenie výsledkov RIF je navyše subjektívne.

Výhody RIF a RIBT sú:

1) Vysoká citlivosť (najmä pre RIF);

2) Vysoká špecifickosť (najmä pre RIBT).

Nevýhody RIF a RIBT:

1) Technická náročnosť, vysoká cena metód.

2) Subjektivita hodnotenia výsledkov, nedostatočná automatizácia;

3) RIF a RIBT u pacientov so syfilisom môžu zostať pozitívne po mnoho rokov (a dokonca po celý život), napriek tomu, že dostávajú úplnú liečbu. Preto tieto reakcie nemožno použiť na sledovanie vyliečenia.

10. Modifikácie metód

V praxi sa na sérodiagnostiku syfilisu používa a používa niekoľko modifikácií imunofluorescenčnej reakcie:

• RIF-abs– najcitlivejšia metóda sérodiagnostiky syfilisu, stáva sa pozitívnou skôr ako ostatné reakcie (od 3. týždňa od infekcie);
• RIF-200(sérum pacienta sa pri diagnóze zriedi 200-krát) – vysoko špecifická metóda na sérodiagnostiku syfilisu.
• RIF-10(10-násobné riedenie testovacieho séra) je citlivejšia metóda ako RIF-200.
• RIF-ts vykonávané s likérom.
• RIF-abs-IgM- detekcia včasných antitreponemálnych protilátok triedy IgM.

1. Najrozšírenejšia modifikácia je RIF-abs- imunofluorescenčná reakcia s absorpciou. Pred uskutočnením reakcie sa pacientovo sérum ochudobní o zmes nepatogénnych treponémov, aby sa eliminovali skrížené reakcie. Skupinové protilátky sa z testovaného séra odstránia pomocou kultúrnych treponém zničených ultrazvukom, čo výrazne zvyšuje špecifickosť reakcie. Keďže testovacie sérum sa používa v riedení 1:5, RIF-abs je vysoko citlivý.

Hlavné indikácie na použitie RIF-ab v klinickej praxi sú:

• diagnostika latentných a neskorých foriem syfilisu,
• identifikácia falošne pozitívnych výsledkov CSR a rakoviny močového mechúra, najmä u tehotných žien a somatických pacientov s podozrením na syfilis,
• na stanovenie retrospektívnej diagnózy ochorenia.

RIF-abs nie je veľmi informatívny pri hodnotení výsledkov liečby: u 85% pacientov, ktorí dostali adekvátnu antisyfilitickú liečbu, pozitívne výsledky RIF pretrvávajú mnoho rokov.

Táto reakcia sa nazýva „zlatý štandard“ sérodiagnostiky syfilisu. Používa sa na arbitrážne prípady, ale pre spoľahlivý výsledok je potrebná čerstvá koncentrovaná suspenzia T. pallidum kmeňa Nichols zo sedemdňovej orchitídy u králika, ktorú nemožno zmraziť.

2. V ZSSR bol inštalovaný v dvoch modifikáciách - RIF-10 A RIF-200 t.j. s riedením testovacieho séra 10 a 200-krát. RIF-200 - testovacie sérum sa zriedi 200-krát, aby sa znížil počet falošne pozitívnych výsledkov. To poskytuje vysokú špecifickosť reakcie, ale jej citlivosť sa trochu znižuje. RIF-10 je citlivejší, ale častejšie poskytuje nešpecifické pozitívne výsledky ako RIF-200, ktorý je vysoko špecifický. RIF-10 je citlivejší, RIF-200 a RIF-abs sú špecifickejšie.

Senzitivita RIF-200 a RIF-abs sa odhaduje na 84–99 % a špecificita je 97–99 %.

3. RIF-ts vykonávané s likérom. Reakcia sa uskutočňuje s použitím celého cerebrospinálneho moku na identifikáciu špecifických lézií centrálneho nervového systému.

4. Reakcia RIF-abs-IgM navrhnuté na detekciu včasných antitreponemálnych protilátok triedy IgM. Táto reakcia sa môže použiť na diagnostiku vrodeného syfilisu, skorých foriem syfilisu a diferenciálnu diagnostiku prípadov reinfekcie a sérorelapsu.

Sú známe 2 modifikácie tejto reakcie:

– FTA-ABS-IgM, založený na použití v druhej fáze reakcie konjugátu anti-IgM (fluoresceínom značené protilátky proti ľudskému IgM) namiesto anti-humánneho fluorescenčného globulínu;

– Ruská verzia RIF-abs-IgM, vyznačujúca sa tým, že do testovaného krvného séra sa pridáva sorbent, ktorý odstraňuje IgG protilátky, a RIF-abs sa podáva so zvyšnými IgM protilátkami.

Hlavné indikácie na testovanie RIF-abs-IgM sú:

- sérodiagnostika vrodeného syfilisu pri absencii prejavov vrodeného syfilisu na koži a slizniciach u dieťaťa;

– diferenciálna diagnostika reinfekcie a klinicko-sérologického alebo sérologického relapsu syfilisu, pri ktorom bude RIF-abs-IgM negatívny a RIF-ab pozitívny;

– hodnotenie účinnosti liečby včasného získaného alebo vrodeného syfilisu: po adekvátnej liečbe sa RIF-abs-IgM stane negatívnym počas nasledujúcich 3-6 mesiacov.

Táto reakcia sa môže použiť na detekciu vrodeného syfilisu. Je známe, že veľké molekuly IgM nemôžu prejsť zdravou placentou. V dôsledku toho sa protilátky triedy M proti treponema pallidum môžu objaviť v tele dieťaťa buď v dôsledku narušenia bariérovej funkcie placenty, alebo sú produkované telom dieťaťa so syfilisom. Protilátky triedy IgM sa v krvi pacienta so syfilisom objavujú už v prvých týždňoch ochorenia a protilátky triedy IgG sa objavujú neskôr. Oddelené stanovenie protilátok oboch tried sa ukazuje ako mimoriadne užitočné pri diagnostike vrodeného syfilisu u detí, pretože prítomnosť protilátok triedy IgM u dieťaťa v prvom mesiaci života naznačuje, že sú tvorené telom dieťaťa so syfilisom. , zatiaľ čo detekcia iba IgG protilátok bude indikovať materský pôvod týchto protilátok.

Nastavenie reakcie 19S(IgM)-RIF-abs zahŕňa predbežnú separáciu pomocou gélovej filtrácie väčších molekúl 19S IgM z

frakcie menších molekúl 7S IgG. Ďalšia štúdia reakcie RIF-abs krvného séra obsahujúceho iba frakciu 19S IgM,

eliminuje všetky možné zdroje chýb. Technika usporiadania tejto reakcie je však zložitá a náročná na prácu a vyžaduje špeciálne vybavenie a odborné školenie.

Imunitná adhézna reakcia (RIP, TPIA - imunoadherencia Treponema pallida).

Táto reakcia je založená na použití javu, ktorý opísal Rieckenberg v roku 1912. RIP je založený na skutočnosti, že virulentný tkanivový treponém, senzibilizovaný sérom pacienta so syfilisom, za prítomnosti komplementu a erytrocytov adheruje na povrch erytrocytov a pri centrifugácii je s nimi odnášaný do sedimentu a mizne zo supernatantu.

Na nastavenie reakcie sa používajú nasledujúce zložky: testovacie sérum, antigén, komplement, darcovské červené krvinky, izotonický roztok chloridu sodného. Ako antigén sa používa suspenzia bledého treponému kmeňa Nichols.

Tento test bol najviac študovaný vo vzťahu k sérodiagnostike syfilisu domácimi a zahraničnými autormi v 50.-60. Dôkazy týkajúce sa hodnoty RIP ako diagnostického testu boli nekonzistentné. Reakcia si vyžadovala maximálnu presnosť, pretože nepresné dávkovanie zložiek alebo nadbytok alebo nedostatok testovaného materiálu v prípravku viedli k nespoľahlivým výsledkom.

V Rusku uskutočnil rozsiahly výskum L.V. Sazonov, ktorý získal podobné výsledky v RIP a RIT s použitím čerstvo pripravenej suspenzie patogénneho pallidum treponema kmeňa Nichols. Avšak použitie zahriateho alebo fenolom konzervovaného antigénu prudko skreslilo výsledky reakcie a spôsobilo nestabilitu antigénu. Odporúčame tento test ako náhradu za RIT L.V. Sazonová to považovala za nemožné.

G.P. Avdeeva, ktorý pri výrobe antigénu použil iné teplotné a časové režimy, získal pri štúdiu RIP odlišné výsledky. Podľa jej údajov je citlivosť tejto reakcie vyššia ako citlivosť KCP a RIT, ale o niečo nižšia ako RIF a špecifickosť RIP, RIT a RIF je blízka.

Nedostatočná priemyselná výroba antigénu pre RIP však neumožnila širšie študovať a zaviesť tento test do praxe.

RPHA pasívna hemaglutinačná reakcia

Pasívna hemaglutinačná reakcia (RPHA) je bežný sérologický test, ktorý je pevne zavedený v laboratórnej praxi. má pomerne vysokú úroveň efektívnosti vo výskume.

1. História metódy RPGA

Prvýkrát o použití RPHA na diagnostiku syfilisu informovali G. Blumental a W. Bachman (1932). V roku 1965 bol na diagnostiku syfilisu navrhnutý nepriamy alebo pasívny hemaglutinačný test. Modifikáciu reakcie pomocou rôznych antigénov opísal Ratlev T. v rokoch 1965 - 1967. Mikromodifikáciu RPGA navrhol Sokh R.M. a spoluautormi v roku 1969. Prvý komerčný testovací systém vyvinuli japonskí vedci Tomisava et. al. v roku 1969

2. Princíp metódy RPGA

Z pripravenej homogénnej suspenzie erytrocytov „nabitých“ antigénmi sa po pridaní testovacieho séra s obsahom protilátok vyzráža zrazenina vo forme vločiek. Výsledná zrazenina pozostáva z červených krviniek „zlepených“ protilátkami a nazýva sa "hemaglutinát". Suspenzia červených krviniek je pripravená vopred a dodávaná ako súčasť diagnostických testovacích systémov.

Proces zlepovania červených krviniek, ktoré majú na svojom povrchu antigény, sa nazýva „hemaglutinácia“. K lepeniu dochádza pod vplyvom špecifických protilátok (aglutinínov). Reakcia je tzv "pasívny", pretože vlastné antigény erytrocytov nereagujú a samotné erytrocyty plnia výlučne pomocnú indikátorovú funkciu.

Pasívna (nepriama) hemaglutinačná reakcia je typ aglutinačnej reakcie, pri ktorej sa ako nosiče antigénu používajú erytrocyty (z gréckeho háima - krv), a nie iné častice. Vo všeobecnosti platí, že pri aglutinačnej reakcii sa vplyvom protilátok zlepia a vyzrážajú mikróby alebo iné bunky – nie nevyhnutne červené krvinky, ale napríklad latexové častice, baktérie alebo iné korpuskulárne častice nesúce antigén.

Pri pasívnej hemaglutinačnej reakcii na diagnostiku syfilisu sa ako antigén používajú ovčie alebo vtáčie erytrocyty potiahnuté antigénmi Treponema pallidum. Po pridaní séra obsahujúceho špecifické protilátky sa červené krvinky zlepia (aglutinácia).

Reakcia RPGA je klasifikovaná ako imunologická metóda, pretože je založená na špecifickej interakcii patogénneho antigénu Treponema pallidum s protilátkou. Podľa „mriežkovej teórie“ je aglutinácia výsledkom „zosieťovania“ molekúl povrchového antigénu s molekulami protilátok (imunoglobulíny).

3. Nastavenie pasívnej hemaglutinačnej reakcie

RPGA sa vkladá do plastových tabliet alebo do skúmaviek s riedeným krvným sérom pacienta, do ktorého sa pridáva erytrocytové diagnostické činidlo.

Proces spojenia antigénu s erytrocytmi sa nazýva senzibilizácia a takto získaný umelý korpuskulárny antigén sa nazýva senzibilizované erytrocyty. Diagnostika erytrocytov nazývané erytrocyty senzibilizované antigénom.

Na prípravu diagnostika sa používajú erytrocyty oviec alebo vtákov (zvyčajne kurčiat), najskôr ošetrené formaldehydom a potom tanínom, ktoré sa senzibilizujú ultrazvukovým antigénom patogénneho treponema pallidum (Nicholsov kmeň) alebo rekombinantnými proteínmi treponema pallidum (TpN15). TpN17, TpN47). Možno použiť aj ovčie erytrocyty senzibilizované ultrazvukovým antigénom kultivovaného Treponema pallidum.

Testuje sa iba sérum (nepoužívať krvnú plazmu). Hemolyzované a zakalené vzorky nie sú vhodné. Nesenzibilizované erytrocyty slúžia ako negatívna kontrola (na vylúčenie prítomnosti antierytrocytových protilátok). V každej sérii produkcií sa používajú pozitívne a negatívne kontroly.

Vzorky testovaného krvného séra a testovaných červených krviniek sa pridajú do jamiek (jamiek) imunologickej tablety. Ak krvné sérum pacienta obsahuje špecifické anti-treponemálne protilátky, potom po pridaní testovaného séra do jamky s antigénom dochádza k tvorbe komplexov antigén-protilátka spojených s povrchom nosičov (erytrocytov). Vizuálne sa to prejavuje zlepovaním červených krviniek, teda hemaglutináciou, ktorá je viditeľná voľným okom. Imunitné komplexy „protilátka-antigén-erytrocyt“, ktoré vplyvom gravitácie postupne padajú, sú rozložené po celom povrchu dna jamky a vytvárajú charakteristický obraz „obráteného dáždnika“.

V závislosti od množstva protilátok obsiahnutých v testovanej vzorke sa obraz „obráteného dáždnika“ mení od maximálneho, ktorý zaberá celý povrch dna jamky, až po malú oblasť v strednej, najnižšej časti (s prejasnením v centrum a tvorba intenzívnejšieho prstenca usadených červených krviniek na periférii).

Imunitné komplexy sa nevytvárajú, ak vo vzorke nie sú žiadne špecifické protilátky alebo keď sa do reakcie pridajú kontrolné (neporušené) červené krvinky. Zároveň sa červené krvinky postupne zhromažďujú v najnižšom bode dna otvoru a vytvárajú obrazec vo forme kompaktného bodu alebo „gombíka“, niekedy s miernym presvetlením v strede.

Ak krvné sérum osoby obsahuje protilátky proti erytrocytom, v každom prípade sa vytvorí „dáždnik“ - v reakcii s testovanými erytrocytmi aj s kontrolnými erytrocytmi. V tomto prípade sa odporúča použiť iné lekárske technológie na identifikáciu špecifických antitreponemálnych protilátok.

Je možný fenomén prozóny (nemožnosť reakcie v dôsledku prebytku protilátok), ktorý je možné eliminovať zriedením séra.

4. Zohľadnenie výsledkov pasívnej hemaglutinačnej reakcie

Výsledky RPGA sa vizuálne zohľadnia po 60-120 minútach pri nastavovaní mikrometódy a po 2-4 hodinách alebo nasledujúci deň pri nastavovaní makrometódy. Pri použití väčších (jadrových) vtáčích erytrocytov sa získa jasnejší obraz a výsledky sa zaznamenajú v skoršom čase.

Je možné určiť titer (vysoký titer RPHA ≥ 1:2 560).

Výsledky štúdie sa hodnotia pomocou systému 4+ (od „–“ po „++++“) na základe veľkosti vytvoreného filmu. Keď dôjde k aglutinácii, červené krvinky sa nachádzajú na povrchu otvoru vo forme „dáždnika“ a ak je výsledok negatívny, červené krvinky voľne skĺznu a hromadia sa na dne v strede otvoru v vo forme „tlačidla“.

Všeobecne akceptované hodnotenie výsledkov RPGA:

4+ - pozitívne RPGA. Aglutinované červené krvinky vo forme „dáždnika“ rovnomerne lemujú celý povrch otvoru;

3+ - pozitívne RPGA. Červené krvinky lemujú celý povrch otvoru, ale niektoré z nich „skĺžu“ do stredu. V tomto prípade sa pozdĺž okraja sedimentu vytvorí viditeľný prstenec;

2+ - slabo pozitívne RPGA. Červené krvinky tvoria film na malej ploche spodnej časti otvoru a vytvárajú hustý prstenec sedimentu červených krviniek s viditeľnou priehlbinou v strede;

1+ - neurčitá RPHA, červené krvinky tvoria voľný sediment na dne jamky s nejasnými okrajmi a miernym lúmenom v strede;

(–) - negatívny RPGA, všetky červené krvinky ležia na dne jamky vo forme kompaktného sedimentu („gombíky“ alebo krúžky) na čistom okolitom pozadí (bez okolitého zrnitého sedimentu).

V zahraničnej praxi sa výsledky RPGA hodnotia aj ako reaktívne (pri tvorbe aglutinátov), ​​slabo reaktívne (ak sú útvary nevýznamné) a nereaktívne (ak nie je pozorovaná aglutinácia).

Výsledky reakcie je možné zaznamenať automaticky pomocou špeciálnych analyzátorov. Okrem kvalitatívneho výskumu poskytujú všetky testovacie systémy kvantitatívnu analýzu s určením titra.

5. V ktorých obdobiach ochorenia je lepšie užívať RPHA?

RPHA sa stáva pozitívnym v strede primárneho obdobia (7-8 týždňov od okamihu infekcie, 3-4 týždne po objavení sa chancre) a zostáva pozitívny po celé roky po liečbe.

Pri veľmi vysokej hladine protilátok proti treponému v testovacom sére (čo je najtypickejšie pre sekundárny syfilis) je možný falošne negatívny výsledok RPGA (takzvaný fenomén „prozóny“).

Špecifické protilátky proti aglutinínu sa zisťujú v krvi ľudí, ktorí majú syfilis dlhodobo, preto RPGA nemožno odporučiť na diferenciálnu diagnostiku reinfekcie alebo určenie závažnosti infekčného procesu.

RPGA sa nepoužíva na kontrolu vytvrdzovania, pretože môže zostať pozitívny mnoho rokov po zotavení. Zároveň sa môže použiť ako doplnková (k rakovine močového mechúra alebo k RPR) metóda pri sledovaní účinnosti liečby štúdiom dynamiky poklesu titrov protilátok. Predpokladom je použitie rovnakého testovacieho systému RPGA ako pri prvom (pred liečbou) vyšetrení pacienta, ako aj testovanie v rovnakom laboratóriu.

6. Citlivosť a špecifickosť RPGA

RPGA sa považuje za vysoko citlivý a špecifický test. Táto reakcia je cenným diagnostickým testom pre všetky formy syfilisu, ale je obzvlášť citlivá v neskorých formách ochorenia. V závislosti od štádia ochorenia sa citlivosť RPGA mení. S primárnym syfilisom je citlivosť RPGA 76% (a vyššia), so sekundárnym syfilisom - až 100%. Pre latentný skorý syfilis - 97%, pre neskorý syfilis - 94%, so špecifickosťou 98–100%. Nižšia citlivosť pri čerstvých formách ochorenia sa vysvetľuje neskoršou tvorbou aglutinínov.

Podľa štátnej inštitúcie „TsNIKVI Roszdrav“ bola citlivosť RPGA pri diagnostike rôznych foriem syfilisu 99,4%. Väčšina výskumníkov zaznamenáva 98-99% špecifickosť pre RPGA.

Z hľadiska citlivosti a špecificity nie je RPGA horší a pri neskorých formách a kongenitálnom syfilise je dokonca lepší ako RIF a RIBT.

7. Rozsah použitia metódy RPGA

RPGA možno použiť ako skríningový aj potvrdzujúci test; možno použiť v semikvantitatívnej verzii s výpočtom titra protilátok. Bola vyvinutá kvantitatívna metóda na stanovenie RPHA, mikrometóda, ako aj automatizovaná mikrohemaglutinačná reakcia.

8. Vlastnosti, výhody a nevýhody RPGA

Podľa literatúry má RPGA trvalo vedúce miesto v klinickej praxi vo väčšine krajín sveta. RPGA je najpoužívanejším testom na klinikách STI v zahraničí.

Technika RPGA sa ľahko vykonáva a nevyžaduje špeciálne vybavenie: všetko, čo potrebujete, je hemaglutinačná platňa. Výskum netrvá dlho; reakcia je vysoko citlivá a špecifická. Testovanie metódy v klinickej praxi ukázalo, že je mimoriadne jednoduchá, lacná a citlivá. Rovnako ako ELISA, aj RPGA sa jednoducho vykonáva, nevyžaduje vysokokvalifikovaný personál a špeciálne vybavenie a je možná automatizácia.

Výhody testu RPGA:

• jednoduché nastavenie a interpretácia,
• nevyžaduje špeciálne vybavenie,
• čas na získanie výsledkov – 45 minút,
• vhodné na hromadný skríning (vyžaduje sa iba 25 µl séra zriedeného v pomere 1:20),
• vysoký stupeň štandardizácie,
• prítomnosť vnútorných kontrol,
• dlhá trvanlivosť,
• prijateľná cena
• možnosť automatizácie účtovníctva.

Treba tiež poznamenať nevýhody RPGA:

• možnosť nešpecifických reakcií v prítomnosti antierytrocytových protilátok,
• nedostatok korelácie medzi titrom a štádiom syfilisu,
• neskoršia pozitivita reakcie v skorých štádiách syfilisu,
• možnosť falošne pozitívnych reakcií u osôb, ktoré požili alkohol, drogovo závislých,
• citlivosť na vibrácie a teplotu v laboratóriu.

Výhody RPGA v porovnaní s RIBT a RIF sú:

• používanie priemyselných testovacích systémov,
• možnosť automatizácie reakcie,
• nie je potrebné pracovať so živým Treponema pallidum,
• nie je potrebné vivárium.

9. Zdroje a príčiny chýb pri vykonávaní RPGA, falošne pozitívne a falošne negatívne výsledky

Pasívny hemaglutinačný test je relatívne jednoduchý test; pri jej vykonávaní je potrebné dodržiavať všetky odporúčania výrobcov diagnostika a pravidlá práce v klinickom diagnostickom laboratóriu. Vykonané chyby môžu viesť k objaveniu a registrácii výsledkov falošne negatívnych aj falošne pozitívnych reakcií. Falošne pozitívne výsledky RPGA môžu byť spôsobené vplyvom ľudských a biologických faktorov.

Môžu sa získať falošne pozitívne výsledky

• pri štúdiu krvných sér pacientov s nevenerickými treponematózami,
• v dôsledku reumatoidného faktora
• v dôsledku protilátok skrížene reagujúcich s treponémovým antigénom, ktoré sa tvoria pri rôznych systémových alebo liekmi vyvolaných metabolických poruchách,
• v dôsledku abnormálnych hladín imunoglobulínov;
• u novorodencov - v dôsledku tvorby IgM protilátok proti IgG matky v tele plodu alebo dieťaťa, čo sťažuje interpretáciu výsledkov a diagnostiku vrodeného syfilisu.

Chyby spôsobené vplyvom ľudskej účasti na štúdii:

• kontaminované mikroplatničky
• nesprávne pipetovanie
• prítomnosť vibrácií v laboratóriu
• Teplota vzduchu v laboratóriu je mimo teplotného rozsahu: 18–25 stupňov

Medzi najtypickejšie technické chyby pri vykonávaní RPGA, ktoré vedú k nespoľahlivým výsledkom, patria:

• nepresné riedenie zložiek,
• porušenie teploty,
• porušenie inkubačného času činidiel,
• porušenie lehôt na aplikáciu činidiel na tabletu,
• nesúlad medzi pH roztokov a požadovanými hodnotami,
• kontaminácia laboratórneho skla.

Nasledujúce technické problémy môžu byť tiež zdrojom chýb pri nastavovaní RPGA:

• vylúčenie kontrolného krvného séra z reakcie;
• nerovnomerná koncentrácia červených krviniek v diagnostike v dôsledku nedostatočného premiešania pred použitím;
• porušenie podmienok skladovania diagnostických a kontrolných červených krviniek; používanie súprav s uplynutou platnosťou;
• používanie kontaminovaných skúmaviek, špičiek pipiet, pipiet, imunologických platní, roztokov pri vykonávaní reakcií;
• nepresnosti v počiatočnom riedení vzorky séra;
• nedostatočná starostlivosť pri vykonávaní sériových dvojitých riedení;
• nedodržanie teplotných podmienok a inkubačnej doby;
• prítomnosť vonkajších vibrácií a trasenie imunologickej tablety počas inkubácie;
• porušenie postupu na stanovenie štádia RPGA, vyjadrené v odmietnutí vykonať štúdiu s kontrolnými erytrocytmi.

Použitie krvnej plazmy obsahujúcej antikoagulanciá, ktoré môžu spôsobiť nešpecifickú aglutináciu erytrocytov (RPGA), môže viesť k výsledkom, ktoré sa nedajú interpretovať.

Počet falošne pozitívnych a falošne negatívnych výsledkov je nižší ako pri iných sérologických testoch. LPR pri stagingu RPHA sú zriedkavé a sú možné pri treponematózach (yaws, bejel, pinta). Taktiež boli zaznamenané falošne pozitívne výsledky (spolu menej ako 1 %) u drogovo závislých, u pacientov infekčná mononukleóza, borelióza, lepra, kolagenóza, cirhóza pečene, lymfosarkóm, ako aj u tehotných žien.

Falošne negatívne výsledky testov môžu byť spôsobené konkurenciou medzi IgM a IgG protilátkami. Falošne negatívne výsledky sú možné aj u pacientov infikovaných HIV.

10. Modifikácie metódy RPGA

Existujú mikro- a makro modifikácie nastavenia RPHA, pričom prvá z nich je častejšie používaná kvôli jej efektívnosti, rýchlosti nastavenia a zaznamenávania výsledkov.

Okrem toho bol vyvinutý automatický diagnostický komplex na analýzu obrazu, ktorý umožnil vykonávať kvantitatívne automatické hodnotenie výsledkov a eliminovať subjektivitu pri interpretácii získaných údajov. Hardvérový a softvérový komplex rozpozná obraz, spracuje dáta a poskytne odpoveď v relatívnych jednotkách.

Na automatizáciu zaznamenávania výsledkov RPGA sa používajú aj čítačky a automatické analyzátory.

TPPA (aglutinácia častíc Treponema pallidum) - aglutinačná reakcia umelých častíc na detekciu protilátok proti Treponema pallidum

Stručný popis testu TPPA

V súčasnosti sa na diagnostiku syfilisu využíva aj modifikácia metódy pasívnej hemaglutinácie - TPPA (Treponema pallidum particglutination), pri ktorej je antigén Treponema pallidum fixovaný na želatínových časticiach. Keďže umelé polymérne častice nemajú svoje vlastné antigény, ktoré určujú biologickú aktivitu, súpravy na sérodiagnostiku syfilisu založené na nich majú dôvod považovať sa za pokročilejšie. Použitie biologicky inertných umelých častíc minimalizuje nešpecifickú aglutináciu bežne pozorovanú pri iných nosičoch.

TPPA sa používa na sérologickú diagnostiku protilátok proti rôznym druhom a poddruhom patogénneho treponému. Tento test možno použiť na detekciu protilátok proti patogénom syfilis, pinta, bejel a yaws.

Postup výskumu je veľmi jednoduchý a nevyžaduje špeciálne vybavenie – používajú sa štandardné mikroplatničky v tvare „U“. Test je založený na aglutinácii želatínových častíc senzibilizovaných antigénmi T. pallidum, protilátkami obsiahnutými v krvnom sére pacienta.

TPPA je konfirmačný treponémový test, ktorý je užitočný pri testovaní na malých vzorkách aj pri hromadnom skríningu. TPPA sa v zahraničí používa ako konfirmačný test a nahrádza mikrohemaglutinačný test MHA-TP (mikrohemaglutinačný test na protilátky proti T. pallidum).

Senzitivita testu TPPA je medzi 85 % a 100 % a špecificita medzi 98 % a 100 %. Citlivosť TPPA pre primárny syfilis- 88 %, na sekundárny a neskorý latentný syfilis 98 % -100 %.

Ak sa TPPA používa na diagnostiku syfilisu, protilátky proti iným treponémam (ako T. pallidum endemicum, pertenue alebo carateum) môžu spôsobiť falošne pozitívne výsledky. Existuje množstvo dostupných metód na odstránenie týchto protilátok zo vzoriek séra pred testovaním.

Princíp testu TPPA

TPPA je metóda pasívnej aglutinácie želatínových častíc v ľudskom sére alebo plazme. Sérum obsahujúce protilátky proti patogénnemu treponému reaguje so želatínovými časticami senzibilizovanými antigénom bledého treponému kmeňa Nichols, podrobených ultrazvuku. V dôsledku reakcie sa v jamke mikrotitračnej platne vytvorí hladký film aglutinovaných želatínových častíc.

Ak protilátky chýbajú, častice sa usadia na dne jamky platne a vytvoria kompaktné „gombík“ neaglutinovaných častíc. Kontrolné jamky s nesenzibilizovanými želatínovými časticami by mali tiež ukazovať toto kompaktné „tlačidlo“ pre každé sérum, t. j. žiadna aglutinácia.

Aplikácia testu TPPA

TRPA je univerzálny test, ktorý možno rovnako úspešne použiť ako pri povinnom preventívnom vyšetrení skupín populácie na syfilis (skríning), tak aj v špecializovaných dermatovenerologických pracoviskách. Výhodou testu TPPA je jeho vysoká citlivosť, ktorá nie je nižšia ako klasické testy, ktoré boli donedávna „zlatým štandardom“ sérodiagnostiky syfilisu. Medzi ďalšie výhody testu patrí vysoká reprodukovateľnosť, ako aj jednoduchosť a rýchlosť nastavenia reakcie.

Test TPPA sa používa na potvrdenie pozitívnych výsledkov skríningových testov na netreponemálny syfilis, ako je test VDRL, a na vyhodnotenie pacientov s negatívnymi výsledkami netreponemálneho testu, ktorí však majú znaky alebo symptómy naznačujúce neskorý syfilis. Použitie TPPA ako jediného skríningového testu na syfilis sa neodporúča.

Okrem toho sa aglutinačný test TPPA môže použiť na vyšetrenie vzoriek mozgovomiechového moku pri diagnostike neurosyfilisu. V tomto prípade, rovnako ako pri iných sérologických testoch, musí byť interpretácia výsledkov vykonaná v povinnej kombinácii s inými indikátormi a príznakmi ochorenia.

Výsledky testu TPPA

Výsledok sa posudzuje podľa systému „plusov“ – od (–) po (2+). Výsledky testu sú viditeľné voľným okom a interpretujú sa takto:

Stupeň aglutinácie	Testovací indikátor	Výklad
Aglutinované častice rovnomerne obložia dno taniera	2+	Pozitívny
Výrazne veľký prstenec s nerovnými vonkajšími okrajmi a periférnou aglutináciou	1+	Pozitívny
Častice tvoria kompaktný prstenec s medzerou v strede a hladký hladký vonkajších hraníc	±	Slabo pozitívne
Častice tvoria kompaktný prstenec v strede otvoru s miernou medzerou v strede a hladkým vonkajším okrajom	–	Negatívne
Častice tvoria „gombík“ v strede otvoru s hladkým vonkajším okrajom	–	Negatívne

Výsledky sa berú do úvahy na určenie zhody s vyššie uvedeným popisom. Vzorky, ktoré vykazujú neurčitý výsledok (±), sa musia znova otestovať. Ak vzorka vykazuje neurčitý výsledok vo viacerých testoch TPPA, odporúča sa testovať pomocou iných metód.

Výsledky analýzy by sa nemali vnímať izolovane. Napríklad na skoré štádium infekcii je počet protilátok stále príliš nízky, v dôsledku čoho TPPA a mnohé ďalšie metódy nemajú citlivosť. Preto pri podozrení na syfilis, aj keď sú výsledky testov negatívne, vzorky sa musia testovať znova. Na stanovenie diagnózy je potrebné vziať do úvahy klinické príznaky, dostupné pacientovi, klinickú anamnézu a ďalšie údaje.

Rovnako ako pri RPHA reakcii, TPPA môže vykazovať fenomén prozóny a falošne negatívny výsledok, ak vzorka séra obsahuje príliš vysoký titer protilátok.

ELISA - enzýmová imunoanalýza

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) je jednou z mnohých sérologických diagnostických metód infekčné choroby. Enzýmová imunoanalýza (ELISA) v sérodiagnostike syfilisu je test na protilátky tried M, G a A (IgM, IgG, IgA) proti antigénom Treponema pallidum. Je možné vykonať ELISA s cerebrospinálnou tekutinou.

Zavedenie enzýmovej imunoanalýzy (ELISA) namiesto Wassermanovej reakcie a iných kardiolipínových testov do praxe výrazne zlepšilo kvalitu laboratórnej diagnostiky syfilisu. Významnou výhodou tejto metódy je možnosť automatizácie výskumného procesu, čím sa znižuje vplyv ľudského faktora.

1. História metódy ELISA

Základné princípy enzýmovej imunoanalýzy na povrchu nosiča v tuhej fáze boli vyvinuté E. Engvarom a spoluautorom. (1971), B. Van Weeman a A. Schuurs (1971). Enzýmový imunotest, ktorý vyvinuli, bol prvýkrát navrhnutý na diagnostiku syfilisu v roku 1975 J. Veldkampom a A. Visserom, ktorí zhodnotili potenciál tohto automatizovaného testu. ELISA sa začala vo veľkej miere využívať v diagnostike syfilisu v 80. rokoch 20. storočia, kedy boli vyvinuté a certifikované diagnostické testy a štandardizované testovacie metódy. V ZSSR metódu ELISA na diagnostiku syfilisu vyvinuli V. N. Bednová, A. V. Babiy a A. V. Kotrovsky (1982, 1983).

2. Princíp metódy ELISA

Enzýmový imunosorbentový test (ELISA) je podobný v reakčnom mechanizme ako RIF (detegujú sa rovnaké protilátky). Reakcia enzýmovej imunoanalýzy je klasifikovaná ako imunologická reakcia založená na vysoko špecifickej interakcii antigénov treponema pallidum s protilátkami pacienta so syfilisom.

V syfilidologickej praxi sa používa najmä nepriama verzia ELISA. Princíp najčastejšie používanej nepriamej reakcie je nasledovný. Na povrchu jamiek polystyrénovej tablety sú fixované imunitné komplexy, ktoré sa tvoria, keď protilátky pacienta so syfilisom interagujú s antigénmi Treponema pallidum. Potom sa detegujú farebnou reakciou pomocou špecifických konjugátov a vhodných substrátovo-chromogénnych aditív.

Postup na vykonanie testu je nasledujúci: sérum pacienta sa umiestni na nosič s tuhou fázou s pripojeným antigénom. Ak sú v ňom protilátky, na povrchu nosiča sa vytvorí komplex antigén-protilátka. Na „prejavenie“ výsledkov reakcie sa používajú anti-humánne Ig protilátky konjugované s enzýmovými markermi. Kedy pozitívna reakcia enzým naviazaný na komplex antigén-protilátka rozkladá substrát pridaný do systému, čo vedie k rozvoju farebného sfarbenia rôznej intenzity.

V reakcii sa stanovenie komplexu AG a AT sorbovaného na pevnej fáze uskutočňuje pomocou antiglobulínových protilátok značených enzýmom na základe farebnej reakcie enzýmu so substrátom.

V reakcii sa stanovenie komplexu antigénov a protilátok sorbovaných na pevnej fáze uskutočňuje pomocou antiglobulínových protilátok značených enzýmom.

ELISA poskytuje schopnosť detegovať sérové ​​Ig rôznych tried. Na trhu sú systémy, ktoré umožňujú samostatne stanoviť IgM a IgG a celkové protilátky.

Špecifické antigény používané na ELISA môžu mať rôzny pôvod:

ultra-hlas- získavajú sa zničením bakteriálnej bunky T. pallidum ultrazvukom alebo iným spôsobom;

rekombinantný- získavajú sa technológiami genetického inžinierstva zavedením génu zodpovedného za syntézu špecifického antigénu T. pallidum do genómu bakteriálnej bunky (napríklad E. Coli) a následným zvýšením bakteriálnej hmoty produkujúcej mikroorganizmov, deštrukcia týchto buniek, izolácia a čistenie antigénu;

peptid- získaný ako výsledok sekvenčnej chemickej syntézy antigénnych epitopov proteínov T. pallidum.

Telo je schopné vytvárať protilátky takmer na akúkoľvek časť molekuly antigénu. Pri normálnej imunitnej odpovedi sa to zvyčajne nestane. Jeden alebo viacero imunogénnych peptidov izolovaných z proteínového antigénu má špeciálnu antigenicitu a väčšina protilátok sa tvorí špecificky proti nim. Vyvíja sa u nich najintenzívnejšia imunitná odpoveď. Najinformatívnejšia ELISA ukázala imunodominantné oblasti proteínov Treponema pallidum s molekulovými hmotnosťami 15 kDa, 17 kDa a 47 kDa. Ako antigén sa použil detergentný extrakt alebo sonikát patogénnych treponém kmeňa Nichols.

3. Spôsob vykonávania výskumu pomocou metódy

Princípom metódy je detekcia špecifického komplexu antigén-protilátka sorbovaného na tuhej fáze (povrch jamiek plastovej platničky) s antiglobulínovými protilátkami značenými enzýmom (peroxidázou) pomocou farebnej reakcie so substrátom. účtovať kvantitatívne spektrofotometricky.

Antigény používané na senzibilizáciu jamiek polystyrénovej platne môžu byť:

• lyzát- získané v dôsledku deštrukcie Treponema pallidum ultrazvukom;
• peptid- získané ako výsledok chemickej syntézy proteínových fragmentov Treponema pallidum a majúce antigénnu reaktivitu podobnú pôvodným proteínom patogénu;
• rekombinantný- získané pomocou metód genetické inžinierstvo nesúce antigénne determinanty identické s Treponema pallidum.

V syfilidologickej praxi sa zvyčajne používa nepriama verzia ELISA.

4. Účtovanie výsledkov

V ELISA na vizualizáciu reakcie antigén-protilátka reaguje enzým (alkalická fosfatáza alebo chrenová peroxidáza) so substrátom, ktorý mení farbu. Intenzita farby určuje pozitivitu reakcie (od „–“ po „++++“). Výsledky ELISA možno hodnotiť vizuálne pomocou 4-bodového systému alebo inštrumentálne vo forme digitálnych indikátorov optickej hustoty získaných na špeciálnych čítačkách (ako je Multiscan) pri vlnovej dĺžke 492 nm. Pretože Výsledky sú hodnotené spektrofotometricky, čím sa eliminuje subjektívna interpretácia.

5. V akých obdobiach choroby je lepšie užívať

Načasovanie pozitivity ELISA je od 4. týždňa od infekcie. Výsledky ELISA (rovnako ako RIF) sa stanú pozitívnymi v prvých dňoch primárneho obdobia alebo na konci inkubácie a zostávajú pozitívne vo všetkých obdobiach. ELISA je obzvlášť cenná pri včasnej diagnostike syfilisu – pozitívne výsledky na zistenie protilátok možno získať už na konci inkubačnej doby ochorenia (t.j. 4–6 týždňov po infekcii).

6. Citlivosť a špecifickosť

ELISA je vysoko citlivý a špecifický test, čo je jeho výhodou. ELISA je blízka RIF z hľadiska reakčného mechanizmu, citlivosti a špecifickosti, pretože Na oboch reakciách sa zúčastňujú rovnaké protilátky. Väčšina výskumníkov zaznamenáva vysokú špecifickosť a citlivosť vo všetkých štádiách ochorenia. Senzitivita rôznych variantov ELISA podľa G. A. Dmitrieva dosahuje 98 - 100% a špecifickosť - 96 - 100%. Podľa TsNIKVI je citlivosť ELISA na syfilis 99,1 % (obj. č. 87 M3 Ruskej federácie).

Možnosť ELISA na pevnej fáze (enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) je jednou z najcitlivejších sérologické reakcie, ktorý umožňuje detekciu 0,0005 μg/ml protilátok a 0,000005 μg/ml antigénov.

7. Rozsah použitia metódy

Metóda sa odporúča použiť pri vyšetrovaní tehotných žien, kontaktných osôb, darcov a zástupcov rizikových skupín. ELISA sa môže použiť ako skríningový aj potvrdzujúci test. Za relatívne krátky čas svojej histórie sa ELISA vyvinula z indikatívneho testu na potvrdzujúci test. Pri diagnostike syfilisu sa test používa aj ako konfirmačný test pre vzorky preukazujúce pozitívne výsledky pomocou rôznych netreponemálnych testov a RPGA.

Metódu ELISA je možné použiť v kvantitatívnej verzii s výpočtom indexu pozitivity, prípadne reaktivity, ktorá umožňuje vyhodnotiť hladinu protilátok vo vzorke.

V súčasnosti v Rusku upravuje používanie enzýmovej imunoanalýzy na diagnostiku syfilisu vyhláška Ministerstva zdravotníctva Ruskej federácie č. 87 z 26. marca 2001 „O zlepšení sérologickej diagnostiky syfilisu“ (Príloha č. 1 „ Stagingový skríning a diagnostické testy na syfilis“). Objednávka plánuje nahradiť RSC v komplexe séroreakcií (SRC) ELISA a RPGA.

8. Zdroje a príčiny chýb pri výrobe, falošne pozitívne a falošne negatívne výsledky

Enzýmová imunoanalýza je komplexná viacstupňová štúdia, pri ktorej je potrebné prísne dodržiavať všetky odporúčania výrobcov diagnostických súprav, pravidlá pre úpravu a konfiguráciu zariadení používaných v štúdii.

Zdrojom chýb pri vykonávaní testu ELISA môžu byť tieto body:

Štúdia reakcie hyperlipidemického, hemolyzovaného krvného séra alebo vzoriek s príznakmi bakteriálneho rastu;

Nepraktizujte zmrazovanie vzorky biologického materiálu dvakrát alebo viackrát, v prípade potreby zopakujte štúdiu, použite sérum z duplicitnej skúmavky;

Porušenie podmienok skladovania imunosorbentu a premývacieho roztoku; používanie testovacích súprav po expirácii;

Použitie reakčných komponentov z iných diagnostických súprav;

Porušenie načasovania reakčných stupňov;

Vysušenie jamiek imunologickej platne v reakčných štádiách;

Opätovné použitie plastových nádob (plastových podnosov) na prípravu zmesi chromogénu a substrátu;

Nedodržanie frekvencie metrologickej kontroly prevádzkových parametrov používaných zariadení (umývačka a spektrofotometer);

Použitie kontaminovaného laboratórneho skla pri nastavovaní reakcií: banky, odmerné valce, skúmavky, pipety, špičky pipiet;

Nedostatočná dôkladnosť pri vykonávaní riedení vzoriek biologického materiálu;

Chyby pri zavádzaní vzorky biologického materiálu do zodpovedajúcej jamky platne;

Chyby pri prenose výsledkov štúdie do registračného denníka, protokolu štúdie alebo formulára odpovede.

Starostlivé vykonávanie odporúčaní pokynov na používanie diagnostických testovacích súprav, pravidelné overovanie presnosti dávkovačov pipiet a automatických zariadení a používanie vnútorných pozitívnych a negatívnych kontrol umožňuje získať výsledky testu ELISA s vysokou reprodukovateľnosťou.

9. Vlastnosti, výhody a nevýhody

ELISA je moderná, sľubná metóda na sérodiagnostiku syfilisu vďaka svojej jednoduchosti, reprodukovateľnosti a dostupnosti. Stanovenie protilátok metódou ELISA je ideálna diagnostická metóda, vhodná na súčasné vyšetrenie veľkého množstva vzoriek. Pre svoje prednosti si získal obľubu vo všetkých krajinách.

Výskumná technológia ELISA vyžaduje súlad so všetkými odporúčaniami výrobcov komerčných diagnostických testovacích súprav a dôkladnosť výskumného postupu. Na uskutočnenie výskumu v ELISA je potrebné zakúpiť ďalšie špeciálne vybavenie. Inscenačná technika si vyžaduje viac ako dlho v porovnaní s RMP, RPR a RPGA.

Prítomnosť automatizácie niekoľkých etáp alebo celého procesu ako celku umožňuje súčasne študovať veľké množstvo vzoriek biologického materiálu s vysokým stupňom štandardizácie štúdie, minimalizovať subjektívny prvok pri hodnotení výsledkov a schopnosť ukladať pevné protokoly štúdie, čo vám umožňuje archivovať údaje štúdie a znova k nim pristupovať na retrospektívnu analýzu.

Výhody:

• Umožňuje diferencované a celkové stanovenie IgM a IgG protilátky na pôvodcu syfilisu.
• vysoká citlivosť a špecifickosť blížiace sa 100 %,
• reprodukovateľnosť
• schopnosti automatizácie

Medzi výhody ELISA patrí vysoká špecificita (96-100 %) a citlivosť (98-100 %), ktorú zaznamenala väčšina výskumníkov.

Prítomnosť automatizácie niekoľkých etáp alebo celého procesu ako celku vám umožňuje súčasne študovať tok s veľkým počtom vzoriek biologického materiálu s vysokým stupňom štandardizácie štúdie, čím sa minimalizuje subjektívny prvok pri hodnotení výsledkov. , schopnosť ukladať pevné výskumné protokoly, čo vám umožňuje archivovať výskumné údaje a znova k nim pristupovať pre retrospektívnu analýzu.

Významné nevýhody manuálnych metód, vrátane stanovenia protilátok proti antigénom T. pallidum pomocou ELISA, sú:

~ možné personálne chyby pri výskume (nedbalosť, nedbalosť, porušenie technológie);

~ nemožnosť úplnej štandardizácie výskumného procesu s manuálnou verziou ELISA;

~ zvýšené riziko infekcie personálu.

10. Modifikácie metód

Spolu s klasickou nepriamou ELISA metódou pasca ELISA. Navrhol ho v roku 1989 O. E. Ijsselmudien a kol. na detekciu IgM protilátok proti Tr antigénom. pallidum. Metóda má vysokú špecifickosť a citlivosť.

Purifikované protilátky proti ľudským imunoglobulínom triedy M sa sorbujú na povrchu jamiek platne a po inkubácii testovaného séra sa všetok IgM naviaže na nosič. Prítomnosť antigén-špecifického Tr medzi asociovanými IgM. pallidum sa deteguje pomocou Tr. pallidum konjugované s enzýmom.

Táto metóda umožňuje zistiť protilátky nielen triedy IgM, ale aj triedy IgG a IgA. Na tento účel sa jamky doštičiek senzibilizujú afinitne purifikovanými protilátkami určitej triedy proti ľudským imunoglobulínom. V tomto prípade sa protilátky tejto triedy zachytávajú zo séra a detekcia protilátok špecifických pre treponém sa uskutočňuje ich kombináciou s konjugátom, ktorý predstavuje spojenie treponemálneho antigénu s enzýmom.

Použitie návnadovej verzie enzýmového imunotestu znižuje riziko sprostredkovaných falošne pozitívnych reakcií reumatoidný faktor krvi, skrížené reakcie medzi imunoglobulínmi triedy M a G. Pri vyšetrovaní novorodencov sú v tomto prípade vylúčené aj falošne pozitívne výsledky testov spojené s detekciou IgM namierených proti materskému antitreponemálnemu IgG.

ELISA našli široké uplatnenie v zahraničí ako možnosti. enzýmový imunitný test (EIA) a systém ĽADOVÝ syfilis. V druhom prípade sa v bunkách platne sorbuje zmes protilátok proti IgM a IgG, ako aj tri rekombinantné proteíny T. pallidum. Pozitívne výsledky sa testujú v rovnakom testovacom systéme duplicitne, aby sa dosiahol konečný výsledok.

V Rusku bolo vyvinutých množstvo testovacích systémov na sérodiagnostiku syfilisu pomocou metódy ELISA s domácimi činidlami. Tieto systémy majú vysokú špecifickosť a citlivosť.

Okrem vyššie uvedeného existujú aj ďalšie možnosti ELISA, vrátane tých, ktoré umožňujú priamu detekciu patogénu v krvi (direct ELISA), dot-ELISA s reakciou na nitrocelulózových prúžkoch, ELISA s kapilárnou krvou, ako aj imunoblotovanie, alebo Western Blot, so súčasnou detekciou AT na rôzne zložky patogénu.

Modernou vylepšenou modifikáciou ELISA je imunoblotting.

ICA (imunochemiluminiscenčný test), ICL (imunochemiluminiscencia)

S rozvojom laboratórnej diagnostiky v rámci modernizácie zdravotníctva v Ruskej federácii sa do praxe laboratórií dostala automatizácia laboratórneho výskumu, ktorá umožňuje štandardizovať analytické fázy výskumu. Pomáha to zlepšiť kvalitu diagnostiky. So zavedením automatizácie sa začali používať nové high-tech metódy s vysokou citlivosťou a špecifickosťou, ako je chemiluminiscenčná imunoanalýza (CLIA)

Chemiluminiscencia je proces emisie fotónov počas prechodu elektronicky excitovaných oxidačných produktov chemické reakcie do pôvodného energetického stavu. Počas chemiluminiscenčnej reakcie sa uvoľňuje značné množstvo energie a kvantový výťažok emitovaného svetla je pomerne vysoký. Zo všetkých neizotopových metód poskytuje najvyššiu citlivosť chemiluminiscencia. Pre imunometrické metódy je citlivosť chemiluminiscencie rádovo väčšia ako citlivosť rádioimunoanalýzy.

Imunochemiluminiscenčná (ICL) metóda našla v súčasnosti svoje uplatnenie v diagnostike nádorových markerov, autoimunitné ochorenia cukrovka, srdcové markery, hormóny ( štítna žľaza, nadobličky, ženské a mužské pohlavné hormóny), infekcie pochodne, vírusová hepatitída, vírusy skupiny herpes.

Na základe imunochemiluminiscenčnej metódy bolo vyvinutých množstvo vysoko citlivých a špecifických (98 – 100 %) testovacích systémov na diagnostiku syfilisu, ktoré sa využívajú najmä v zahraničí.

Metóda využíva ako antigény rekombinantné lipoproteíny získané metódami genetického inžinierstva, ktoré sú úplné analógy antigény T. pallidum.

Metóda ICA založená na výsledkoch klinická štúdia bol uznaný a odporúča sa na použitie pri laboratórnej diagnostike syfilisu v Ruskej federácii ako skríningový a potvrdzujúci test, ak je v laboratóriách k dispozícii vhodné vybavenie. V roku 2012 bola ICA zaradená ako skríningový a potvrdzujúci test na diagnostiku syfilisu do Klinických odporúčaní pre liečbu pacientov so pohlavne prenosnými infekciami a urogenitálnymi infekciami.

Použitie high-tech ICA, ktoré sa zavedením automatizácie stalo súčasťou praxe globálnej aj domácej laboratórnej diagnostiky, teda poskytuje tieto výhody:

• eliminácia vplyvu subjektívnych faktorov v analytickej fáze štúdie
• bezpečnosť personálu pri vykonávaní výskumu potenciálne infikovaného biologického materiálu
• zvýšenie rýchlosti, akou pacient dostáva výsledky
• štandardizácia štúdií a kontrola kvality štúdií
• poskytovanie spoľahlivých a spoľahlivých výsledkov pacientom
• vysoká kvalita klinického laboratórneho výskumu.

Z hľadiska citlivosti je metóda ICA porovnateľná s metódou rádioimunoanalýzy a v jednoduchosti vykonania, bezpečnosti pre personál a mnohých ďalších parametroch ju prekonáva.

Metóda ICA, ktorá má vysokú senzitivitu a špecificitu (98–100 %), umožňuje kvantitatívne stanoviť hladinu protilátok proti pôvodcovi syfilisu a môže sa použiť na potvrdenie syfilitickej infekcie a skríning. Obmedzenia použitia: nemožno použiť na sledovanie účinnosti terapie, môže poskytnúť falošne pozitívny výsledok.

Imunochromatografia (ICH).

Metódy detekcie protilátok špecifických pre treponému založené na metódach imunochromatografie (ICH) sú v Ruskej federácii relatívne nové. Ako pri metóde ICA sa ako antigény používajú rekombinantné lipoproteíny získané metódami genetického inžinierstva (napríklad: antigény Tp15, Tp17, Tp47) a biosyntetický peptid TmpA. Uvedené antigény sa v rôznych kombináciách používajú aj ako súčasť imunosorbentov pri ELISA a imunoblotingu.

Metóda ICG umožňuje rýchlo stanoviť obsah treponémových špecifických protilátok proti pôvodcovi syfilisu vo vzorkách séra a plnej krvi bez použitia špeciálneho laboratórneho vybavenia a využíva sa pri poskytovaní primárnej zdravotnej starostlivosti, vrátane epidemiologických indikácií.

Obmedzenia použitia: nemožno použiť na sledovanie účinnosti terapie, môže poskytnúť falošne pozitívny výsledok.

PBT (jednoduché rýchle testy pri lôžku)

Relatívne nedávno sa v sérodiagnostike syfilisu začal vyvíjať smer takzvaných jednoduchých rýchlych testov (SRT), alebo testov pri lôžku (Point-of-care - POC). Jednoduché rýchle testy pri lôžku pacienta, prípadne imunochromatografické testy umožňujú rýchle stanovenie obsahu treponémových špecifických protilátok proti pôvodcovi syfilisu vo vzorkách séra a plnej krvi bez použitia špeciálneho laboratórneho vybavenia a možno ich využiť pri poskytovaní primárnej zdravotnej starostlivosti vrátane epidemiologických indikácií. Obmedzenia použitia: nemožno použiť na sledovanie účinnosti terapie, môže poskytnúť falošne pozitívny výsledok.

Tieto testy sú založené na imunochromatografickom stanovení protilátok proti treponemovým antigénom Treponema pallidum a vykonávajú sa na prúžkoch; v tomto prípade možno použiť plnú krv aj sérum (Herring A., Ballard R. et al, 2006). Formát testu umožňuje vykonávať výskum bez špeciálneho vybavenia a bez použitia elektriny. Vzhľadom na relatívne nízku senzitivitu a špecificitu sa však tieto testy zatiaľ v praxi veľmi nepoužívajú.

Imunoblotting (Western Blot)

V posledných rokoch sa objavili výskumné metódy zamerané na detekciu a analýzu obsahu protilátok ku každému antigénu Treponema pallidum oddelene. Jednou z týchto metód je metóda immunoblotting (alebo blotting, immunoblotting, Western blot), ktorá sa používa na stanovenie IgG alebo IgM protilátok proti Treponema pallidum. Metóda imunoblotovania je modifikáciou enzýmového imunotestu - variantom ELISA.

Imunoblotting je jedným z najviac moderné metódy sérodiagnostiku syfilisu a aktívne sa používa v zahraničí. Svoj názov („Western blotting“) dostal ako vtipnú odpoveď na názvy techník určovania DNA („Southern blotting“) a RNA („Northern blotting“).

1. História metódy

Imunoblotting (Western blot) sa používa na stanovenie protilátok IgG alebo IgM proti antigénom treponema pallidum (Herremans M. et al., 2007).

2. Klasický imunoblot

Klasický imunoblot(Western Blot Analysis) kombinuje enzýmový imunotest a použitie elektroforetickej metódy. Antigénne proteíny pôvodcu syfilisu sa predbežne oddelia elektroforézou a prenesú sa na nosič - nitrocelulózovú membránu (prúžok). Tento prenos sa nazýva blotting. Potom sa na tento nosič s oddelenými bodkami (bloty) pôsobí testovaným sérom a protilátkami proti IgG alebo IgM, značenými enzýmami alebo rádioaktívnymi látkami. Spôsob zahŕňa použitie prirodzených alebo rekombinantných treponémových proteínov.

Elektroforéza je separácia nabitých zlúčenín na základe ich pohyblivosti v elektroforetickom poli. Keď sa v médiu aplikuje potenciálny rozdiel, kladne nabité molekuly sa pohybujú smerom k záporne nabitej elektróde a záporne nabité molekuly sa pohybujú smerom k kladnej elektróde.

Väčšina globulárnych proteínov je zostavená tak, že väčšina nabitých skupín, menovite hydrofilných, je umiestnená na povrchu proteínu, zatiaľ čo nenabité hydrofóbne zvyšky sú vložené vo vnútri globule. V elektrickom poli proteíny migrujú podľa svojho náboja smerom k opačne nabitej elektróde.

Elektroforetická separácia proteínov sa uskutočňuje v syntetickom gélovom médiu na báze polyakrylamidu. Na oddelenie proteínov podľa ich molekulovej hmotnosti sa proteínová zmes pred elektroforézou predinkubuje v prítomnosti dodecylsulfátu sodného (SDS).

Podrobné štúdie zahraničných vedcov Webera a Osborna (1969) ukázali, že po takomto ošetrení jediným faktorom, ktorý môže ovplyvniť pohyblivosť proteínov v polyakrylamidovom géli (PAGE) je veľkosť proteínu, respektíve jeho molekulová hmotnosť. To umožnilo použiť metódu PAGE elektroforézy v prítomnosti SDS na pomerne presné stanovenie molekulovej hmotnosti proteínov a peptidov. V zahraničnej literatúre sa táto metóda nazývala SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyakrylamide gel electrophoresis).

Profil reaktivity v klasickom WB teste s prírodnými antigénmi (metóda elektroforézy na polyakrylamidovom géli s dodecylsulfátom sodným). (1) - pozitívny výsledok kontroly, (2) - negatívny výsledok kontroly, (3-6) - klinické vzorky.

Pri testoch na syfilis s použitím tejto metódy sa Treponema pallidum, predtým vyčistená a rozložená na jednotlivé zložky, podrobí elektroforéze v polyakrylamidovom alebo agarózovom géli. V tomto prípade sú antigény obsiahnuté v jeho zložení oddelené molekulovou hmotnosťou.

Potom sa pomocou vertikálnej elektroforézy antigény prenesú na prúžok nitrocelulózy, ktorý teraz obsahuje spektrum antigénnych pásov neviditeľných pre oko, charakteristické pre Treponema pallidum.

Pri vykonávaní analýzy sa testovaný materiál (sérum, krvná plazma pacienta atď.) nanesie na nitrocelulózový prúžok (prúžok). Ak sú vo vzorke špecifické protilátky, potom sa počas inkubačného procesu silne viažu na presne zodpovedajúce (komplementárne) antigénne pásy a vytvárajú komplex „antigén-protilátka“.

Po odstránení nenaviazaných imunoglobulínov pri premývaní prúžku nasleduje inkubácia s konjugátom - enzýmom značené protilátky proti ľudským imunoglobulínom (protilátky proti ľudskému IgG alebo IgM), počas ktorej sa enzýmom značené protilátky naviažu na existujúce komplexy antigén-protilátka na povrchu membrána.

Po odstránení nenaviazaného konjugátu počas inkubácie so substrátovým roztokom dochádza k interakcii enzýmu so substrátom, čo má za následok vznik farebnej reakcie – zafarbenie membránových oblastí (vo forme prúžkov), kde sa nachádzajú jednotlivé antigény treponema pallidum, protilátky, proti ktorým boli v testovacom sére. Intenzita zafarbenia závisí od množstva naviazaných protilátok zo séra. Výsledok reakcie sa hodnotí vizuálne.

Prítomnosť pásov v určitých oblastiach nitrocelulózovej platne potvrdzuje prítomnosť protilátok proti presne definovaným antigénom Treponema pallidum v testovanom sére.

Imunodeterminanty 15, 5, 17, 44,5, 47 kD stanovené pomocou tejto metódy majú diagnostický význam pre syfilis. Ig G imunoblotting je podobný v citlivosti a špecificite ako RIF s absorpciou (RIF abs). Ig M imunoblotting môže slúžiť ako diagnostický test na vrodený syfilis.

3. Imunoblot vo formáte lineárneho imunotestu

Line immunoassay (LIA) umožňuje simultánne stanovenie protilátok proti antigénom Treponema pallidum v ľudskom sére alebo plazme. Antigény sú vopred aplikované na testovacie prúžky, ktoré sa dodávajú ako súčasť komerčných diagnostických súprav.

Pásiky sú vyrobené z nitrocelulózovej membrány, polyamidu s plastovým podkladom alebo nylonovej membrány s plastovým podkladom. Počas výroby sa na testovací prúžok umiestni niekoľko samostatných antigénov vo forme samostatných antigénnych čiar. Okrem týchto syfilisových antigénov sa na každý prúžok aplikujú ďalšie štyri kontrolné čiary: streptavidín a kontrolné vzorky (3 +, 1 + a ± rezná čiara).

V prúžkoch sa používajú umelé antigény získané metódami genetického inžinierstva – rekombinantné proteíny alebo syntetické polypeptidové konštrukty. Ide o analógy povrchových antigénov Treponema pallidum - TpN15, TpN17, TpN47 a TmpA s molekulovými hmotnosťami 15, 17, 47 kDa a 44,5 (TmpA), kde kDa = kiloDaltony. S ich pomocou sa stanovujú sérové ​​protilátky proti rôznym imunodominantným zložkám patogénu.

Testovaná vzorka sa inkubuje v kyvete, kde je tiež umiestnený indikátorový prúžok. Protilátky proti T. pallidum sa stanovujú väzbou na antigény aplikované na testovacie prúžky. Ak sú vo vzorke prítomné špecifické protilátky proti T. pallidum, vytvárajú väzby s odlišnými antigénovými líniami. Keď protilátky obsiahnuté v testovacom sére interagujú s diskrétnymi antigénmi T. pallidum umiestnenými na testovacom prúžku, vytvorí sa komplex antigén-protilátka vo forme vizuálne zistiteľných farebných pásov.

Pri zohľadnení výsledkov imunoblotovania sa reaktivita séra na každý z antigénov hodnotí samostatne. Celkom pozitívna odpoveď nastane, keď sa výsledok získa súčasne s dvomi alebo tromi prezentovanými antigénmi.

Výskumné postupy sa vykonávajú ručne alebo na špeciálnom analyzátore s interpretáciou výsledkov pomocou špecializovaného počítačového programu pre infekčné choroby.

Vďaka vysokému stupňu purifikácie rekombinantných antigénov a súčasnej detekcii protilátok proti najimunogénnejším determinantom pôvodcu syfilisu má metóda vysokú senzitivitu a špecifickosť.

4. Účtovanie výsledkov

Na odčítanie intenzity zafarbenia antigénnych pásov na prúžkoch boli vyvinuté fotometre, ktorých činnosť je založená na odraze signálu, ktorý vylučuje subjektívne hodnotenie a poskytuje potenciál pre automatizáciu.

5. V akých obdobiach choroby je lepšie užívať

Testy využívajúce imunobloting dokážu odhaliť špecifické protilátky proti antigénom Treponema pallidum vo veľmi skorom štádiu ochorenia. Najvýznamnejšími protilátkami v diagnostike syfilisu sú protilátky proti antigénom Treponema pallidum TpN15, TpN17, TmpA a TpN47. Tieto antigény sú membránové proteíny s molekulovými hmotnosťami 15, 17, 44,5 a 47 kDa.

Keď sa Treponema pallidum zavedie do ľudského tela, antisyfilitické protilátky sa objavia v tomto poradí: najprv sa vyvinie imunitná odpoveď na antigény TpN17, potom na TpN47, po TpN15 a neskôr na všetky TmpA. Pri zohľadnení výsledkov testov sa reaktivita séra na každý z nich hodnotí samostatne. Napríklad, keď lineárny blot vykazuje reaktivitu iba na antigénne línie TpN17 a TpN47, znamená to, že ochorenie je v počiatočných štádiách. Čím viac antigénových línií začne reagovať, tým ďalej infekcia postupuje. Pri liečbe syfilisu sa vzorec reaktivity v tomto teste mení.

Stanovenie IgM na proteíny s molekulovou hmotnosťou 15,17, 41, 47 kDa umožňuje identifikovať 29,2 % pacientov so sekundárnym syfilisom, 12,5 % so skorým latentným syfilisom a 8,0 % so sérorezistenciou. Hľadanie IgG na rovnaké molekuly je charakterizované citlivosťou 61,6 % pre sérorezistenciu a 100 % pre sekundárny a skorý latentný syfilis.

6. Citlivosť a špecifickosť

Podľa literatúry je senzitivita a špecificita testu veľmi vysoká – 99,6 – 100, respektíve 99,3 – 99,5 %. Pri klasickej metóde sa to dosiahne elektroforetickou separáciou proteínov, glyko- a lipoproteínov a maximálnou špecifickosťou detekcie imunitných sér alebo monoklonálnych protilátok. Za optimálnych podmienok môže imunoblotting detegovať antigén v množstvách menších ako 1 ng v testovacom objeme.

Senzitivita lineárneho blotu je tiež 99,6 % a špecificita sa pohybuje medzi 99,3 % a 99,5 %.

Podľa odborníkov je imunoblotting s rekombinantnými vysoko špecifickými antigénmi podobný v citlivosti a špecifickosti ako RIF-abs.

Podľa údajov zo zahraničnej literatúry a výsledkov štúdie na TsNIKVI má metóda imunoblotovania vysokú senzitivitu (98,8 – 100 %) a špecificitu (97,1 – 100 %) na diagnostiku syfilisu.

7. Rozsah použitia metódy

Imunoblotovanie (imunoblot) je vysoko špecifická a vysoko citlivá referenčná metóda. Vysoká citlivosť a špecifickosť umožňujú, aby sa táto metóda považovala za potvrdzujúci test na syfilis. Metódu možno použiť na potvrdenie diagnózy, ako aj v prípadoch, keď iné treponémové testy dávajú pochybné a protichodné výsledky. Pomocou imunoblottingu môžete potvrdiť diagnózu u pacientov s pozitívnymi alebo neurčitými výsledkami testov, vrátane tých, ktoré boli získané pomocou RPGA alebo ELISA.

8. Zdroje a príčiny chýb pri výrobe, falošne pozitívne a falošne negatívne výsledky

Falošne pozitívne výsledky sú veľmi zriedkavé. Falošne negatívne výsledky sú tiež pomerne zriedkavé a pozorujú sa u pacientov s imunodeficienciou - častejšie u ľudí infikovaných HIV a s účinkom diagnostického „okna“ v dôsledku oneskorenia syntézy protilátok, ako aj v prípade chýb. v štádiu diagnózy.

Použitie moderných testovacích systémov vyžaduje prísne dodržiavanie všetkých požiadaviek na materiál aj na priebeh reakcie. V zásade je zdrojom chýb porušenie poradia a technológie štúdie (najmä pri klasickom Western blote) a nedodržanie odporúčaní výrobcov testovacích súprav. . Chyby sa môžu vyskytnúť aj počas odberu, dodávky, skladovania vzoriek séra a počas testovania. Okrem poškodených vzoriek okrem iného možné dôvody- používanie testovacích súprav po expirácii, ako aj chyby v analýze výsledkov štúdie.

9. Vlastnosti, výhody a nevýhody

Jedinečnosť imunoblotu spočíva vo vysokom informačnom obsahu a spoľahlivosti výsledkov.

Test nevyžaduje vysoko purifikované antigény, referenčné alebo kontrolné séra. Identifikácia protilátkového cieľa je založená na molekulovej hmotnosti proteínu, s ktorým reagujú protilátky zo séra pacienta. V jedinej reakcii je možné detegovať väzbu protilátky na viacero antigénov, z ktorých každý môže byť presne charakterizovaný. Vďaka tomu má imunoblotting oproti iným metódam detekcie protilátok množstvo výhod, ktorých výsledky závisia od štandardizácie, citlivosti, kvality substrátu, nestability alebo nerozpustnosti určitých antigénov.

Metóda je ľahko reprodukovateľná, relatívne jednoduchá na vykonávanie a interpretáciu výsledkov, umožňuje určiť spektrum protilátok proti niekoľkým antigénom T. pallidum naraz a vyhodnotiť prínos k všeobecná reakcia protilátky s rôznou špecifickosťou.

Použitie vysoko purifikovaných rekombinantných a peptidových antigénov minimalizuje nešpecifickú reaktivitu séra. Použitie metódy umožňuje vyhnúť sa pracným a subjektívnym metódam, ktoré predstavujú nebezpečenstvo pre výskumníka (očkovanie kmeňmi G. pallidum, práca s patogénnym T. pallidum pri stagingu reakcie). To určuje preferenciu metódy imunoblotovania pred inými treponémovými testami (RIF a najmä RIBT) na diagnostiku syfilisu.

10. Modifikácie metód

Existuje niekoľko komerčných testovacích systémov založených na tejto metóde. Niektoré z nich sú vyrobené vo formáte Western blot, pozostávajú z prúžkov, na ktoré sú prenesené proteínové zložky T. pallidum, vopred oddelené elektroforézou v polyakrylamidovom géli.

Ostatné sú vo formáte lineárny blot, pozostávajú z prúžkov, na ktorých sú sorbované rekombinantné a syntetické polypeptidy vo forme diskrétnych čiar - analógov povrchových antigénov T. pallidum, TpN15, TpN17, TpN47 a TmpA.

Výsledky Western blotu sa interpretujú ťažšie, pretože prúžky odhaľujú širokú škálu protilátok, z ktorých mnohé sú špecifické pre skupinu. Na rozdiel od toho je interpretácia výsledkov čiarového blotu jednoduchá; Okrem toho ďalšie kontrolné čiary aplikované na prúžok umožňujú semikvantitatívne hodnotenie hladiny protilátok proti štyrom antigénom T. pallidum.

technológia xMAP

xMAP - moderná technológia, čo umožňuje multiparametrické štúdie simultánnou detekciou viacerých analytov v jednej biologickej vzorke. Ako pevná fáza sa používajú farebné mikroguľôčky potiahnuté zachytávacími činidlami (oligonukleotidy, protilátky, antigény).

Testovaná vzorka sa pridá k roztoku obsahujúcemu mikrosféry. Analyty detegované vo vzorke sa naviažu na zodpovedajúcu mikrosféru, po ktorej sa do roztoku pridá detekčné činidlo (detekčné protilátky, fluorescenčná značka). Na detekciu stanovovaného analytu sa používa systém dvoch laserov, ktorý umožňuje kvalitatívne hodnotenie prítomnosti analytu vo vzorke (na tento účel sa používa červený laser, ktorý klasifikuje mikrosféry podľa farby), ako aj kvantitatívne hodnotenie obsahu analytu vo vzorke (na to sa používa zelený laser).

Štúdia sa vykonáva automaticky na analyzátoroch, ako je Bio-Plex 200 (bio-rad), Bio-Plex2200 (bio-rad), Luminex100 (luminex), Luminex200 (luminex) vybavených softvérom.

Produktivita technológie xMAP výrazne prevyšuje klasickú enzýmovú imunoanalýzu (ELISA) s výrazne menším objemom biomateriálu.

Technológia xMAP, ktorá má vysokú analytickú citlivosť, sa v súčasnosti používa na riešenie širokého spektra klinických problémov. S jeho pomocou sa v jednej vzorke biologického materiálu uskutoční súčasná detekcia známych nádorových markerov, srdcových markerov, markerov akútnej fázy a cukrovka, veľký rozsah cytokíny, chemokíny, rastové faktory. Súčasná detekcia viacerých analytov v jednej biologickej vzorke môže výrazne skrátiť čas vyšetrenia pacienta. Doteraz bolo vyvinutých množstvo testovacích systémov na detekciu protilátok proti patogénom STI, najmä syfilitickej infekcii, pomocou metódy xMAP.

ZDRAVOTNÉ STREDISKO"Na Samotechnaja"

Recepcia po dohode! Sobota nedeľa.