Vrste raka ščitnice. Molekularni testi za onkologijo v Izraelu

Molekularna medicina pri zdravljenju raka

Ustvarjanje zdravil na osnovi markerskih genov in markerskih proteinov omogoča, da z delovanjem samo na njih selektivno uničijo njihove nosilce in preprečijo neželeni učinki. To je molekularna ali genetska medicina.

V prihodnjih letih 21. stoletja naj bi to zdravilo nadomestilo obstoječe, ki se zdaj imenuje »staro«. Navsezadnje v »stari« medicini zdravila nastajajo po metodi »poskusov in napak«, zato pogosto povzročajo hude stranske učinke pri bolnikih. V tem smislu je standardna kemoterapija raka danes v težkem položaju.
Glavni razlogi za to: 1) rakava celica je evkariont med normalnimi celicami človeškega telesa, tudi evkarionti; 2) zaostajanje znanosti do zadnjih let o virih karcinogeneze in njenih molekularnih vzrokih.

Standardna kemoterapevtska zdravila sama po sebi ne morejo razlikovati med rakavo celico in normalnimi celicami in so namenjena ubijanju prehitro delečih se celic, ki jim vsaka rakava celica pripada.

Nedavno je bilo ugotovljeno, da rakotvornost izvira iz dveh virov: 1) iz normalne tkivne celice, ki je prej postala izvorna celica, ali 2) iz tkivne izvorne celice.

Izkazalo se je tudi, da je sestava rakavih celic drugačna:

Večino celic sestavljajo nerakaste celice: hitro se delijo in po opravljanju tkivnih funkcij same umrejo z apoptozo; te celice so tarče standardnih kemoterapevtskih zdravil;
- bistveno manjši del sestavljajo rakave celice: to so matične celice raka, ki se z asimetrično delitvijo kopirajo in kot del rakavih celic ustvarjajo nerakaste celice.

Hkrati se matične celice raka delijo redko in počasi. To je razlog, zakaj so standardna kemoterapevtska zdravila neučinkovita proti matičnim celicam raka (J.E. Trosko et al., 2005).
Doslej v klinični praksi prevladujejo bolniki s simptomi raka, izjemno redki pa so bolniki z rakom »in situ«, tj. na kraju samem.

Ko se pojavijo simptomi, je že prepozno začeti zdraviti raka. Navsezadnje se rakave celice začnejo širiti po telesu, ko je velikost raka v tkivu katerega koli organa le 2 mm v premeru, tj. z začetkom angiogeneze in limfangiogeneze v nodulu.

Zdaj, ko je prišla eramolekularna medicina, bodo bolnika začeli zdraviti, še preden se pojavijo prvi znaki bolezni, tudi raka: na njenem samem začetku – na ravni prvega rakava celica in njegovih prvih potomcev, in še pred njegovim začetkom - na ravni predrakavih celic.

Po identifikaciji markerskega gena bolezni je mogoče ugotoviti, kateri protein ga povzroča, kar pomeni, da je treba ustvariti zdravilo proti temu proteinu ali njegovemu genu - to je "čarobna krogla", o kateri je sanjal P. Ehrlich. Na tem bo zgrajena farmakologija prihodnosti.
Nova zdravila in izdelki, ki temeljijo na označevalnih genih in proteinskih označevalcih za določeno bolezen, bodo ciljali samo na okvarjene celice in jih uničili, ne da bi poškodovali zdrave celice. Zato bolnik ne bo imel stranskih učinkov zdravil.

Matične celice raka nastane iz normalne celice ali matične celice tkiva zaradi derepresije genov fetalnih beljakovin v njej in hkratne represije supresorskih genov z metilacijo dinukleotidov CpG promotorja teh genov ali mutacij v genih. Hkrati postane bolj trdovratna kot običajna celica iste vrste.
Rakasta celica vsebuje številne trike, ki jo naredijo neranljivo in sposobno samostojnega obstoja v telesu bolnika. Tisti. Ta okvarjena celica ni samo celica, ampak celoten enocelični organizem.

1. Predbolezen.

Vsaka bolezen se začne s patologijo celice ali celic. Spremembe določenega gena ali genov celice niso diagnoza bolezni, temveč le ugotovitev verjetne nagnjenosti k njej.
Pri takšnih spremembah v reproduktivni celici se uporablja izraz - nagnjenost k bolezni, v somatski celici pa pogosteje rečejo - predbolezen.
Med predboleznijo se tak gen še ne manifestira, saj celica še nima sinteze genskega produkta - beljakovin. Ko se takšne spremembe v genih pojavijo v normalni celici, je to predrakava celica.
»Popravilo« takega gena ali genov oziroma zamenjava v celici z normalnim genom, »izklop« genov za lastnosti rakave celice, odpravi predbolezen.

2. Bolezen.

Ko celica pod nadzorom gena ali genov že ima sintezo svojih produktov – beljakovin, potem je to znak, da je gen že začel z uničujočim delovanjem v celici, kar vodi v bolezen.
Pri tem so spremembe v genu ali genih glavni vzrok celične bolezni, spremembe v lastnostih celice pa povzroča genski produkt, tj. njegove beljakovine. Te lastnosti nato tvorijo simptome določene bolezni.
Vzročni gen v celici je markerski gen, njen protein pa je markerski protein. Inhibicija vzročnega gena in njegovih produktov – beljakovin v celici – lahko ustavi bolezen.

3. Zgodnja diagnoza bolezni.

Do sedaj so številne bolezni, vključno z resnimi, vključno z rakom, diagnosticirane na stopnji njihovih simptomov. Zdravljenje mnogih bolezni v tej fazi je izredno težko ozdravljivo ali celo nemogoče.
Zdaj diagnoza katere koli bolezni, vključno z najbolj nevarna bolezen- rak bo mogoč v predsimptomatskem obdobju.

"Preden začnemo." To bo storjeno z identifikacijo genskega markerja za specifično bolezen v celici ali celicah bolnika. V zvezi z rakom bo to diagnoza predrakave celice ali celic.

"Od vsega začetka." To bo storjeno z identifikacijo v celici ali celicah ne samo markerskega gena, ampak tudi markerskega proteina za specifično bolezen. V zvezi z rakom bo to identifikacija prve rakave celice in njenih bližnjih potomcev v bolnikovem telesu.
Materiali za te študije so lahko: vzorci tkiva ozadja procesa ustreznega organa - biopsija, pa tudi kri in druge biološke tekočine bolnika.

Na kateri koli lokaciji raka pri bolniku je zaradi mozaične narave kapilar rakastega vozliča mogoče v krvi zaznati same rakave celice in njihove označevalce: označevalne gene v krvni plazmi in označevalne proteine ​​iz debla raka. celic v krvnem serumu.
Krvna plazma lahko vsebuje markerske gene iz predrakavih celic, pa tudi markerske gene iz rakavih celic, vendar jih je skoraj nemogoče razlikovati.
Teoretično je te razlike mogoče najti z uporabo MS-PCR in PCR-MMK ter proteinskih mikromrež.

Če so v krvni plazmi bolnika najdeni označevalni geni, značilni za rakavo celico, v serumu istega vzorca krvi pa ni ustreznih označevalnih proteinov, bi to lahko pomenilo prisotnost predrakavih celic.
Odkrivanje markerskih genov iz rakave celice v krvni plazmi pacienta bi lahko označili kot prvo stopnjo zgodnje diagnoze raka, saj so nepravilnosti v genih glavni vzrok za transformacijo normalne celice v rakavo. Potem je odkrivanje markerskih proteinov iz rakavih celic v pacientovem krvnem serumu druga stopnja zgodnje diagnoze raka, saj je markerski protein genski produkt.

4. Zdravljenje bolezni.

Da bi to naredili, bodo označevalni geni in celični označevalni proteini za vsako bolezen uporabljeni kot tarče za zdravila in povzročitelje.
Gre za nova zdravila in sredstva, ki bodo specifično delovala samo na okvarjene celice, za raka pa so to matične celice raka, ne da bi vplivale na normalne matične celice. To pomeni, da bodo ta zdravila in zdravila selektivna in individualna za posameznega bolnika (A.I. Archakov, 2000).

5. Kriteriji za ozdravitev bolezni in nadzor.

Markerski geni in markerski proteini bodo omogočili odkrivanje okvarjenih celic pri kateri koli bolezni, ko jih v telesu pacienta še ni mogoče odkriti z drugimi metodami.
Omogočili bodo odkrivanje raka pri bolniku, ko je velikost vozlišča rakavih celic v tkivu s premerom 2 mm (A.S. Belokhvostov, 2000).
Število ali titer označevalnih genov in označevalnih proteinov v krvi iz okvarjenih celic določene bolezni ali iz izvornih celic raka bo omogočilo spremljanje procesa zdravljenja bolezni in rezultatov zdravljenja bolnika.
Če se titer markerjev med zdravljenjem ne zmanjša, je treba spremeniti taktiko zdravljenja. Popolna odsotnost markerjev dva do tri tedne po koncu zdravljenja – znak, da je bolnik bolezen prebolel.

Zelo priročno bo takšno kontrolo izvajati z uporabo biočipov: DNK čipov za markerske gene in proteinskih čipov za proteinske markerje okvarjenih celic določene bolezni in izvornih celic raka.

Vir: Materiali tretje letne ruske onkološke konference
29. november - 1. december 1999, Sankt Peterburg

MOŽNOSTI MOLEKULARNE DIAGNOSTIKE V ONKOLOGIJI. K.P. Hanson
Raziskovalni inštitut za onkologijo poimenovan po. prof. N.N. Petrova

Napredek genetike in molekularne biologije v zadnjih desetletjih je močno vplival na razumevanje narave nastanka in napredovanja malignih tumorjev. Končno je bilo ugotovljeno, da je rak heterogena skupina bolezni, od katerih je vsaka posledica kompleksa genetskih motenj, ki določajo lastnost nenadzorovane rasti in sposobnost metastaziranja. te sodobna znanja so odprle bistveno nove možnosti pri diagnostiki in zdravljenju malignih novotvorb.

Vpliv specifičnih genetskih motenj, ki so v ozadju rasti tumorja, je omogočil odkrivanje specifičnih molekularnih označevalcev in na njihovi podlagi razvil teste za zgodnjo diagnozo tumorjev.

Znano je, da se neoplastična transformacija celic pojavi kot posledica kopičenja dednih (germinativnih) in pridobljenih (somatskih) mutacij v protoonkogenih ali supresorskih genih. Prav te genetske motnje se lahko uporabljajo predvsem za odkrivanje maligne celice v kliničnem materialu.

Najprimernejši substrat za molekularno diagnostiko je DNK, saj dolgo časa vztraja v tkivnih vzorcih in se zlahka razmnožuje s pomočjo t.i. verižna reakcija s polimerazo (PCR). To omogoča izvedbo diagnostike tudi z minimalno količino testnega materiala.

Poleg prepoznavanja mutacij v onkogenih in supresorskih genih se v diagnostične namene uporabljajo tudi spremembe, ki jih zaznamo v ponavljajočih se zaporedjih DNK, t.i. mikro sateliti.

Pri primerjavi seznanjenih tumorskih vzorcev in normalnih tkiv lahko zaznamo izgubo enega od alelov v tumorju (izguba heterozigotnosti (HL)), kar odraža prisotnost kromosomskih delecij, ki so podlaga za inaktivacijo supresorskih genov.

Zaključujemo serijo člankov o raku.
Danes vam bo podrobno povedal, kaj je molekularno testiranje in kako vpliva na diagnozo.

Na fotografiji: Vladislav Mileiko, vodja oddelka,
biomedicinski holding "Atlas".

Da bi razumeli, kako deluje molekularna diagnostika in kakšno mesto zavzema v onkologiji, moramo najprej razumeti mehanizme, ki se pojavljajo v tumorju.

Molekularni procesi v tumorjih

Mutacije v protoonkogenih in supresorskih genih, ki so odgovorni za delitev in smrt celic, vodijo do tega, da celica preneha slediti navodilom in nepravilno sintetizira beljakovine in encime. Molekularni procesi uhajajo izpod nadzora: celica se nenehno deli, noče odmreti in kopiči genetske in epigenetske mutacije. Zato se maligne neoplazme pogosto imenujejo bolezen genoma.

V tumorskih celicah se lahko pojavi na stotine tisoč mutacij, a le nekatere prispevajo k rasti tumorja, genetski raznolikosti in napredovanju. Imenujejo se vozniki. Preostale mutacije, mutacije "potnika", same po sebi celice ne naredijo maligne.

Pogonske mutacije ustvarjajo različne populacije celic, kar zagotavlja raznolikost tumorjev. Te populacije ali kloni se različno odzivajo na zdravljenje, pri čemer so nekateri odporni in povzročijo ponovitev bolezni. Poleg tega lahko različna občutljivost klonov na terapijo privede do radikalne spremembe v molekularnem profilu med zdravljenjem: tudi celice, ki so na začetku populacije nepomembne, lahko pridobijo prednost in ob koncu zdravljenja postanejo prevladujoče, kar povzroči odpornost in razvoj tumorja.

Molekularna diagnostika

Pogonske mutacije, spremembe v količini ali strukturi beljakovin se uporabljajo kot biomarkerji – tarče, za katere se izbere zdravljenje. Več ko je tarč znanih, natančnejša je lahko izbira potencialno učinkovitih režimov zdravljenja.

Ločevanje pogonskih mutacij od drugih in določanje molekularnega profila tumorja ni enostavno. V ta namen se uporablja tehnologija sekvenciranja, fluorescenčne in situ hibridizacije (FISH), mikrosatelitske analize in imunohistokemije.

Metode sekvenciranja naslednje generacije lahko prepoznajo gonilne mutacije, vključno s tistimi, zaradi katerih je tumor občutljiv na ciljno zdravljenje.

S tehnologijo FISH se obarvajo področja kromosomov, na katerih se nahaja določen gen. Dve povezani večbarvni piki sta himerni ali fuzijski gen: ko so zaradi preureditve kromosomov odseki različnih genov povezani skupaj. To lahko povzroči, da onkogen pride pod vpliv regulacije drugega bolj aktivnega gena. Na primer, zlitje genov EML4 in ALK je ključnega pomena v primeru pljučni rak. Protoonkogen ALK se aktivira pod vplivom njegovega preureditvenega »partnerja«, kar vodi v nenadzorovano delitev celic. Onkolog lahko ob upoštevanju prestrukturiranja uporabi zdravilo, ki bo usmerjeno proti aktiviranemu produktu gena ALK (Crizotinib).

Fluorescenčna in situ hibridizacija (FISH).

Mikrosatelitska analiza pokaže stopnjo motenj v sistemu popravljanja DNA, imunohistokemija pa beljakovinske biomarkerje, ki se nahajajo na površini, v citoplazmi in jedrih tumorskih celic.

Vse te študije so vključene v nov izdelek biomedicinskega holdinga Atlas - Solo test. S tem testom onkolog prejme informacije o molekularnem profilu tumorja in o tem, kako vpliva na potencialno učinkovitost širokega spektra protitumorska zdravila.

Samostojni raziskovalci preučujejo do 450 genov in biomarkerjev, da bi ocenili, kako bi se lahko tumor odzval na bolj ciljno usmerjeno zdravljenje raka. Za nekatere od teh analizo biomarkerjev narekuje proizvajalec. Za druge uporabljajo podatke klinična preskušanja in priporočila mednarodnih onkoloških skupnosti.

Poleg izbire tarč za ciljno terapijo molekularno profiliranje pomaga odkriti mutacije, zaradi katerih je tumor nasprotno odporen na določeno zdravljenje, ali genetske značilnosti, ki so povezane s povečano toksičnostjo in zahtevajo individualno izbiro odmerka zdravila.

Za raziskave se uporablja biopsijski material ali parafinizirani bloki pooperativnega materiala.

Molekularno profiliranje zagotavlja dodatne informacije o bolezni, vendar ni vedno uporabna za izbiro zdravljenja. Na primer v primerih, ko je standardna terapija dovolj učinkovita ali indicirana kirurško zdravljenje. Možno je identificirati klinične situacije, v katerih je takšno testiranje lahko najbolj koristno:

• Redka vrsta tumorja;
• Tumorji z neznanim primarnim žariščem (ni znano, kje se je prvotno pojavil tumor, ki je metastaziral);
• Tisti primeri, ko je potrebna izbira več možnosti za uporabo ciljne terapije;
• Možnosti standardne terapije so izčrpane in potrebno je eksperimentalno zdravljenje ali vključitev bolnika v klinične raziskave.

Strokovnjaki solo projekta svetujejo onkologom ali pacientom in predlagajo, ali je v določenem primeru potrebna preiskava.

Precizna medicina in klinične raziskave

Ponavadi v zdravniška praksa uporabiti splošne strategije za zdravljenje bolnikov s specifično diagnozo. Ena strategija se uporablja za drobnocelični pljučni rak, druga pa za nedrobnocelični pljučni rak. Ta metoda ni vedno primerna za onkološke bolezni. Zaradi razlik na molekularni ravni, tudi znotraj iste vrste tumorja, lahko bolniki prejmejo neučinkovito ali nepotrebno zdravljenje.

Z naraščajočimi raziskavami in izumom tarčnih zdravil se je pristop k zdravljenju raka začel spreminjati. Za podaljšanje obdobja brez recidivov in pričakovane življenjske dobe bolnika je treba upoštevati molekularni profil tumorja, odziv telesa na zdravila in kemoterapijo (farmakogenomika) ter poznati glavne biomarkerje.

Precizna medicina lahko bistveno izboljša prognozo posameznega bolnika, se izogne ​​resnim stranskim učinkom onkoloških zdravil in bistveno izboljša kakovost bolnikovega življenja. Toda ta metoda ima tudi slabosti.

Obstaja vse več ciljnih zdravil, ki imajo dve glavni omejitvi: večina molekularno ciljnih učinkovin zagotavlja le delno zaviranje signalnih poti in mnoga so preveč strupena, da bi jih uporabljali v kombinaciji.

Predstavljajte si, da ste arhitekt v Moskvi. Soočeni ste s težko nalogo - rešiti problem prometnih zamaškov med prometnimi konicami z izgradnjo enega mostu. Molekularne mehanizme lahko primerjamo z gibanjem avtomobilov, most pa je glavno zdravilo, ki naj bi rešilo glavni problem. Zdi se, da lahko ta problem reši več zdravil (niz mostov), ​​ki ciljajo na glavne molekularne nenormalnosti. Toda toksičnost zdravil se povečuje in je lahko nepredvidljiva.

Pridobili smo boljše razumevanje molekularnih procesov maligni tumorji, vendar sedanje metode za uvajanje natančne onkologije v klinično prakso močno zaostajajo. Da bi pospešili preučevanje tarčne terapije, so znanstveniki razvili dva nova pristopa – Basket in Umbrella.

Bistvo metode Basket je, da so za študijo izbrani bolniki z določenim biomarkerjem, ne glede na lokacijo in ime tumorja. Maja 2017 je FDA odobrila takšno zdravljenje za biomarker, imenovan mikrosatelitska nestabilnost visoka (MSI-H) ali napaka pri popravljanju neusklajenosti (dMMR).

Molekularne nenormalnosti se razlikujejo ne samo med bolniki, ampak tudi znotraj istega tumorja. Heterogenost je velik problem v onkologiji, za katerega je bila zasnovana zasnova študije Umbrella. Pri Umbrella metodi bolnike najprej izberemo po vrsti maligne neoplazme, nato pa upoštevajte genetske mutacije.

Takšne študije ne pomagajo le pri zbiranju informacij o učinku tarčnih zdravil – včasih so edina možnost za bolnike, ki se ne odzovejo na zdravljenje. standardno zdravljenje registriranih zdravil.

Klinični primer

Odločili smo se dati jasen primer, kako bi lahko izgledala uporaba naprednega molekularnega profiliranja.

Bolnik s kožnim melanomom in metastazami v jetrih se je posvetoval z onkologom. Zdravnik in pacient sta se odločila za molekularno profiliranje, da bi pridobila več popolne informacije o bolezni. Pacientu so opravili biopsijo in vzorce tkiva poslali na testiranje. Kot rezultat diagnoze so v tumorju odkrili več pomembnih genetskih motenj:

• Mutacija v genu BRAF. Označuje aktivacijo onkogene signalne poti RAS-RAF-MEK, ki je vključena v celično diferenciacijo in preživetje.
• Mutacija v genu NRAS. Označuje dodatno aktivacijo signalne kaskade RAS-RAF-MEK.
• Dedna varianta gena TPMT. Kaže na posebnosti metabolizma protitumorskega zdravila Cisplatin.

Na podlagi rezultatov kliničnih študij in priporočil lahko pridemo do naslednjih zaključkov:

• Zdravila iz skupine zaviralcev BRAF (Vemurafenib) so lahko potencialno učinkovita, poleg tega pa lahko prisotnost mutacije NRAS služi kot dodatna podlaga za predpisovanje dvojne blokade signalne kaskade - v kombinaciji z zaviralci MEK (Trametinib).
• Čeprav ni odobrene terapije, ki bi neposredno ciljala na onkogen NRAS, je znano, da mutacije v njem povečajo verjetnost uspeha zdravljenja pri imunoterapiji (ipilimumab in pembrolizumab).
• Podedovana genetska varianta v genu TPMT kaže na povečano individualno toksičnost cisplatina, ki zahteva prilagoditev odmerka pri predpisovanju režimov, ki vsebujejo platino.

Tako dobi zdravnik možnost krmarjenja med možne možnosti zdravljenje, ki ne temelji le na kliničnih parametrih bolnika, temveč tudi ob upoštevanju molekularnih značilnosti tumorja.

Molekularna diagnostika ni zdravilo za vse rakave bolezni. Toda to je pomembno orodje za onkologa, ki vam omogoča pristop k zdravljenju malignih tumorjev z novega zornega kota.

Hvala, ker ste prebrali in komentirali naše gradivo o onkologiji. Tukaj celoten seznamčlanki.

»Redko se lahko odpovemo svojemu ljubljenemu
klinično hipotezo in še naprej zdraviti bolnike na tak način
kako so z njimi ravnali dolga desetletja...
Medtem pa je prišel čas za spremembo obstoječih paradigem.«

Richard Schilsky, predsednik ASCO

»Najtežje bolezni zahtevajo največ močna zdravila, natančno uporabljen ..."
Hipokrat

Napoved zdravljenja raka je odvisna od klinični stadij bolezen (TNM), biologijo tumorja in prejeto zdravljenje. Sodobni dosežki klinične onkologije so nesporni. In kljub očitnim uspehom pri ustvarjanju novih zdravil proti raku vsak dan na tisoče bolnikov z rakom jemlje zdravila, ki jim ne pomagajo. Za nekatere bolnike bo empirično zdravljenje koristno in varno. Vendar pa je lahko za mnoge druge bolnike terapija neuporabna in strupena.

Do konca 90. let. XX stoletje Citotoksična kemoterapija je dosegla svoje meje. Razvoj molekularne biologije in osredotočenost na personalizirano medicino sta privedla do bistveno novega pristopa k zdravljenju bolnikov z uporabo novih generacij molekularno tarčnih zdravil. Blokiranje proliferacije rakavih celic je bilo doseženo s selektivno inhibicijo njegovih glavnih signalnih poti - ligandov, membranskih receptorjev, znotrajceličnih proteinov.
Kljub očitnim uspehom novega pristopa pa se je ob koncu prvega desetletja postgenomske dobe pojavila nujna potreba po reviziji te nove paradigme zdravljenja, ki je bila posledica veliko število klinični neuspehi zaradi razvoja pridobljene odpornosti tumorja.

Tarče tarčne terapije in mehanizmi rezistence
Najbolj celosten pogled na razvoj in evolucijo raka sta v dveh učbeniških člankih predstavila D. Hanaan in R. Weinberg (Cell, 2000, 2011). Glede na njihove značilnosti naj tarče zdravljenja ne bi bile samo rakave celice s svojim nestabilnim genomom, posebnim tipom metabolizma, aktivno neoangiogenezo in pridobljeno sposobnostjo izogibanja rastnim signalom, kroženja v krvnem obtoku in metastaziranja. Cilji terapije morajo vključevati tudi tumorsko mikrookolje, matične celice raka in vse komponente metastatske kaskade.
Očitno je preprosto nemogoče izvajati takšen program v okviru protokola zdravljenja za določenega bolnika, tudi ob uporabi kombinacije več tarčnih zdravil. Posamezno zdravilo, tudi z edinstvenim molekularnim mehanizmom delovanja, ne more biti učinkovito pri zdravljenju genetsko heterogenega progresivnega tumorja, v katerem se pojavijo in uveljavijo številni mehanizmi odpornosti.
Posebni mehanizmi odpornosti na različna tarčna zdravila so dobro raziskani. Ti vključujejo aktivacijo alternativnih poti EGFR, ki spodbujajo preživetje celic kot odgovor na poškodbe zdravila, nastanek onkogenega obvoda in avtokrine zanke, izgubo zunajcelične domene membranskega receptorja (nastanek okrnjenega receptorja), reprogramiranje kinoma, avtofagijo, epitelno-mezenhimsko tranzicija, epigenetski mehanizmi itd.
Med napredovanjem in pod vplivom terapije se v tumorju pojavijo dodatne onkogene mutacije, spremeni se njegova molekularna pokrajina in razvije se genomska nestabilnost, ki jo danes običajno imenujemo genomski kaos (W. George, Jr. Sledge, 2011).
Za rakave celice ni značilna individualnost in variabilnost. Poleg epitelijskih celic pride do sprememb tudi v tumorsko povezani stromi. Stromalne celice so prav tako predmet molekularne evolucije, čeprav so genetsko bolj stabilna komponenta solidnega tumorja.
Mikrookolje, sestavljeno iz benignih stromalnih celic, celic imunski sistem in vnetnih celic, vpliva tudi na razvoj malignega klona in nastanek sekundarne odpornosti na terapijo.

Heterogenost kot razlog za neučinkovitost protitumorske terapije

Glavni razlog za nizko učinkovitost empirične terapije je heterogenost tumorja.
Dolga desetletja so histologi raka razvrščali glede na morfološke značilnosti, ki opisujejo različne vrste rakave celice in njihov odnos s stromo tumorja.
Tehnike molekularne analize, ki se še posebej hitro razvijajo v postgenomski dobi, so razkrile pravi obseg tumorske heterogenosti.

Individualna (intertumoralna) heterogenost
Tehnologija mikromrež za analizo stopnje izražanja tisočih genov je na začetku (2000) omogočila razvrstitev raka dojke (BC) na luminalni A, luminalni B, HER/2 in bazalni. Nekoliko kasneje je izpopolnitev molekularne taksonomije s poudarkom na bazalnih rakih identificirala dodatne podtipe. Med njimi so Claudin-low (za katerega je značilno izražanje genov, podobno matičnim celicam dojk), podtipi mezenhimskih tumorjev (geni, ki uravnavajo epitelno-mezenhimski prehod), podtipi apokrinih tumorjev z izražanjem androgenih receptorjev in aktivacijo ustreznih signalna pot, podtipi z geni aktivnosti, ki uravnavajo imunski odziv.
Nadaljnje molekularne študije raka dojke so bile povezane z izvajanjem projekta METABRIC (Molecular Taxonomy of Breast Cancer International Consortium). Ugotovljeno je bilo, da lahko na genomsko pokrajino tumorja vplivajo molekularni dogodki, kot so točkovne mutacije, insercije, delecije, ojačanja, podvajanja, translokacije in inverzije. Izkazalo se je, da so tako geni, ki niso povezani s karcinogenezo, kot geni, katerih mutacije so pogoste med razvojem raka (GATA3, TP53 in PIK3CA), lahko podvrženi somatskim mutacijam. Poleg genomske okvare pri raku dojke so bile odkrite različne epigenomske motnje (metilacija DNA), okvare na nivoju transkripcije in mikroRNA. Kot rezultat teh študij je bilo samo v luminalnem podtipu A razvrščenih še 10 različnih molekularno integrativnih grozdov, ki vplivajo na izid bolezni. Ugotovljeno je bilo tudi, da imajo vsi štirje »glavni« podrazredi in novi »dodatni« molekularni podtipi raka dojke različne profile občutljivosti na zdravila proti raku.
Molekularno genetske klasifikacije, ki vplivajo na značilnosti zdravljenja, se ustvarjajo za rak želodca, kolorektalni karcinom, rak jajčnikov in druge lokalizacije.

Intratumorska heterogenost
Bistveno večji temeljni problem v onkologiji je intratumorska heterogenost. Zaradi soobstoja več podklonov v tumorju z različnimi sklopi molekularnih aberacij in različnimi občutljivostmi na zdravila so strategije za zatiranje ene celične frakcije glede na celoten tumor neučinkovite. Dodaten neugoden dejavnik so spremembe biologije tumorja med njegovim razvojem.
Intratumorsko heterogenost običajno delimo na prostorsko (geografsko) in časovno (evolucijsko).
Prostorska heterogenost kaže na prisotnost molekularnih genetskih razlik v specifičnih regijah tumorja, genetske razlike med primarnim tumorjem in njegovimi metastazami ter razlike med metastazami na različnih anatomskih mestih.
Glede na stopnjo genetske heterogenosti opazimo monogenomske (enaki genetski profili na različnih geografskih območjih) in poligenomske tumorje (različne subklonske celične populacije v različnih regijah).
Temeljne spremembe v genomu med razvojem tumorja se pojavijo v treh časovnih točkah: v trenutku prehoda raka in situ v invazivnega raka, med počasnim razvojem primarnega raka. invazivni rak in med metastatskim napredovanjem.
Obstaja veliko razlogov za domnevo, da se rak obnaša kot odprt, nestabilen ekosistem, katerega razvoj je odvisen od pritiska okoljskih dejavnikov, kot sta delovanje imunskega sistema in hipoksija. Na nastanek evolucijske (časovne) heterogenosti primarnega tumorja aktivno vpliva tudi protitumorsko zdravljenje, ki poteka.
V solidnem tumorju vedno obstaja redek podklon celic kritičnega pomena, ki določa končni izid bolezni. Smrt bolnika najpogosteje opazimo kot posledico izpostavljenosti telesu klona celic, ki v času začetne diagnoze ni bil dominanten in je predstavljal največ 1% vseh tumorskih celic. Prisotnost takih celic je bila dokazana na primeru malignega mieloma, raka prostata in za tumorje drugih lokacij. Analiza serijskih biopsij, ki so bile večkrat opravljene v zgodovini bolezni (od trenutka prve diagnoze do smrti bolnika), je pokazala, da klon celic, ki je preživel zaradi terapije, na začetku ni bil dominanten in se je razvil po izločitvi zdravila. drugih, "glavnih", hitro proliferirajočih klonov.
Identifikacija in odstranitev tega smrtonosnega celičnega klona, ​​ki vodi v smrt bolnika, je nujna terapevtska strategija.

Heterogenost tumorja na celični ravni
Večina trenutnih študij molekularnih aberacij je bila izvedenih na celicah, ki predstavljajo splošno populacijo tumorjev. Ob tem strukturne spremembe DNK, ki nastanejo na zgodnje faze razvoj tumorja in vodi do izbruhov genomske evolucije (tako imenovana "velika mutacijska ura"). Pomanjkljivost teh metod je bila, da raziskava ni upoštevala prisotnosti redkih podklonov z edinstvenimi genetskimi mutacijami, skritimi v skupni masi glavnih celic. V teh celicah pride do postopnega kopičenja točkovnih mutacij, kar prispeva k obsežni subklonski genetski divergenci (»majhna mutacijska ura«).
Trenutno se poskuša odpraviti to pomanjkljivost (preučevanje tumorja na ravni enega, vodilnega, malignega klona). Sodobne metode molekularnega profiliranja to omogočajo. Ugotovljeno je bilo, da tumor vsebuje t.i »mutacije voznika« in »mutacije sopotnika«. Pogonske mutacije dajejo celicam, ki nosijo takšne mutacije, prednost pri selektivni rasti. Mutacije potnikov nimajo tega učinka.
Običajno so bile kot terapevtske tarče raziskane samo gonilne mutacije. V zadnjem času pa so pozornost raziskovalcev pritegnile tudi mutacije potnikov, saj vplivajo na učinke, kot sta indukcija imunskega odziva in proteotoksični stres. Mutacije potnikov so lahko tudi tarča protitumorskih strategij.
Kopičenje številnih mutacij, ki je značilno za tumorje z genomsko in kromosomsko nestabilnostjo, lahko povzroči mutacijsko krizo. Ko je presežen optimalni prag genomske nestabilnosti, je sposobnost preživetja oslabljena in število elementov celotnega sistema se zmanjša.

Metode analize tumorskega tkiva
Metode molekularne analize tumorskega tkiva so izjemno raznolike in daleč presegajo okvire klasične histologije. Danes te metode vključujejo: metodo mikromrež, Southern blotting, Northern blotting, Western blotting, in situ hibridizacijo, polimerazo verižna reakcija(PCR), PCR z reverzno transkriptazo v realnem času, imunohistokemija, imunofluorescenčna mikroskopija, maldi-masna spektrometrija.
Analizo tumorske celice lahko izvedemo na ravni genoma (fluorescenčna in situ hibridizacija, spektralna kariotipizacija, primerjalna genomska hibridizacija), transkripcije (tehnologija mikromrež: profiliranje izražanja genov in RNA), proteoma (dvodimenzionalna gelska elektroforeza, masna spektrometrija, površinsko izboljšana laserska desorpcijska ionizacija v načinu TOF: matrična tehnologija + masna spektrometrija).
Molekularna tomografija tumorskega tkiva omogoča vizualizacijo prostorske porazdelitve proteinov, peptidov, zdravilnih spojin, metabolitov, kot tudi molekularno napovednih biomarkerjev.
Tkiva primarnega solidnega tumorja, tkiva dokončanih hematogenih metastaz (hitro rastočih in klinično pomembnih), kot tudi krožeče tumorske celice in krožečo tumorsko DNK (indikator prisotnosti "mirujočih" metastaz) je treba podvreči molekularni analizi. Biopsije tumorjev in metastaz je treba opraviti z različnih geografskih lokacij istega solidnega tumorja. Menijo, da je tekoča biopsija bolj informativna (in varnejša).

Od empirične do personalizirane terapije
Tumor je odprt in nestabilen biološki sistem, ne kaže samo individualne heterogenosti, ampak tudi spreminja svoje molekularne značilnosti skozi evolucijo, zlasti med metastatskim napredovanjem. Tako dominantni kot nedominantni kloni solidnih tumorskih celic in celice tumorskega mikrookolja so podvrženi spremembam.
Uporablja se strategija za zatiranje proliferacije vseh tumorskih celic kombinirano zdravljenje. Koncept kombiniranega (simultanega ali zaporednega) zdravljenja sta prva predlagala Goldie in Coldman pred več kot 30 leti. Koncept je združeval pojme, kot so rast tumorja, povečanje pogostosti mutacij v njem, nastanek odpornih celičnih klonov in razvoj odpornosti.
Danes strategija sodobnega zdravljenja raka vključuje uporabo kombinacij citostatikov, citostatikov in tarčnih zdravil ter celo kombinacijo dveh tarčnih zdravil (zaviralcev tirozin kinaze in monoklonskih protiteles). Ta strategija temelji na uporabi zatiranja tumorja zdravila, ki prizadene skupino primarnih, hitro proliferirajočih celic. Življenjski cikel teh celic je določena z aktivnostjo gonilnih mutacij. Na splošno je stabilnost sistema razložena s številnimi dejavniki, vključno z aktivnostjo potniških mutacij, katerih vloga se v terapevtskih protokolih ne upošteva.
Strategija personalizirane terapije, ki je danes glavna paradigma protitumorsko zdravljenje, upošteva nenehno spreminjajočo se pokrajino celotnega »tumorskega polja«: heterogenost klonov primarnega solidnega tumorja, heterogenost krožečih tumorskih celic ter fenotipsko in presnovno heterogenost »spečih« rakavih celic v številnih metastatskih niše kostni mozeg in visceralnih organov.

Caris Molecular Intelligence Services
Zamisel o identifikaciji posameznih napovednih tumorskih markerjev, ki bi lahko napovedali rezultate protitumorske terapije, se je pojavila leta 2008, ko je profesor Daniel D. Von Hoff ustvaril edinstven laboratorij Caris Molecular Intelligence Services (ZDA). Danes se za molekularno profiliranje tumorskih tkiv v laboratoriju uporablja kombinacija metod - IHC, CISH, FISH, Next-Generation Sequencing, Sanger Sequencing, Pyro Sequencing, PCR (cobas ®), Fragment Analysis.
V tem laboratoriju so v nekaj letih opravili molekularno tomografijo pri 65 tisoč bolnikih z več kot 150 histopatološkimi podtipi malignih tumorjev. Celostni pristop, ki temelji na uporabi ne ene metode (na primer samo imunohistokemične), temveč kombinacije molekularnih metod, omogoča identifikacijo posameznih napovednih tumorskih označevalcev za posameznega bolnika in na podlagi te analize sprejemanje odločitev o personalizirana terapija.
Ekspresija nekaterih proteinov (ali pomnoževanje genov) zahteva predpisovanje ustreznih zdravil, ekspresija drugih proteinov izključuje predpisovanje določenega zdravila. Tako je izražanje TOPO1 prednostno za dajanje irinotekana, izražanje RRM1 je za dajanje gemcitabina, izražanje MGMT je osnova za dajanje temozolamida ali dakarbazina, izražanje TOPO2A s hkratnim pomnoževanjem HER2 omogoča za zdravljenje z doksorubicinom, liposomskim doksorubicinom in epirubicinom.
Za predpisovanje trastuzumaba je treba poleg odkrivanja izražanja/pomnoževanja HER/2 za napovedovanje odpornosti na zdravila pregledati PTEN (IHC) in PIK3CA (NGS).
Po drugi strani pa izražanje TS zahteva izogibanje uporabi fluorouracila, kapecitabina in pemetrekseda; izražanje SPARC (IHC), TLE3 (IHC), Pgp (IHC) zahteva izogibanje docetakselu, paklitakselu, nab-paklitakselu.
S takšno kombinacijo tumorskih markerjev, kot so ER (IHC), HER2 (IHC), HER2 (CISH), PIK3CA (NGS), everolimusa in temsirolimusa ne smemo predpisovati.
Kombinacija sodobne metode biološko slikanje omogoča identifikacijo molekularnih napovednih tumorskih markerjev za vsako znano citotoksično zdravilo ali tarčno zdravilo, ki se danes uporablja v klinični onkologiji. Podoben pristop, ki temelji najprej na molekularnem profiliranju tumorskega tkiva, prepoznavanju posameznih napovednih tumorskih markerjev v njem in šele nato razvoju načrta strategije zdravljenja, je bil dokazan v številnih kliničnih študijah. Ena od njih je študija Bisgrove, v kateri so sodelovali TGen, Scottsdale Healthcare in Caris Dx.
Zasnova te študije je bila revolucionarna. Glede na dejstvo, da je vsak tumor individualen, so avtorji načrta študije zavrnili randomizacijo bolnikov v več skupin glede na anatomsko lokacijo tumorja ali samo eno imunohistokemično značilnost. V tej študiji ni bilo primerjalnih skupin - vsak bolnik je deloval kot lastna kontrola.
V študiji je sodelovalo skupno 66 bolnikov iz 9. centri za raka ZDA: 27 % – BC, 17 % – CRC, 8 % – OC, 48 % – druge lokalizacije. Pred vključitvijo v študijo so vsi bolniki prejemali terapijo za metastatskega raka po splošno sprejetih standardih - skupaj 2 do 6 vrstic. Po zadnjem napredovanju se je nadaljevalo zdravljenje na osnovi molekularnega profiliranja.
Rezultati študije so pokazali, da se je čas do napredovanja pri bolnikih z rakom dojke povečal za 44%, pri raku debelega črevesa in danke - za 36%, pri raku jajčnikov - za 20%, pri drugih lokalizacijah - za 16%. Opozoriti je treba, da so vsi bolniki v času vključitve v študijo razvili sekundarno odpornost na zdravljenje z zdravili, in splošno sprejeta priporočila za njihovo nadaljnje zdravljenje ni bilo. Tako sklepamo, da za agresivne, redke tumorje, pa tudi progresivne tumorje z razvito odpornostjo, ni alternative molekularnemu profiliranju in personaliziranemu zdravljenju.

Sprememba načrta kliničnega preskušanja
Ločeno je treba opozoriti, da paradigma personalizirane terapije v onkologiji aktivno spreminja splošno sprejeto zasnovo kliničnih preskušanj. Vse pogosteje se sliši, da je treba rezultate kliničnih preskušanj, ki temeljijo na randomizaciji in stratifikaciji bolnikov v več populacij in kohort, ponovno preučiti ob upoštevanju individualne intra- in intertumorske heterogenosti. Posledično postaja oblikovanje sodobnih kliničnih preskušanj vse bolj personalizirano.
Primeri takšnih najnovejših sodobnih zasnov so glavni protokoli, preskušanja v košarici, prilagodljiva zasnova preskušanj in končno študije N-od-1. Glavna ideja novih modelov je naslednja. Študijo sponzorira več farmacevtskih podjetij, ki imajo zdravila z različnimi tarčami in različnimi molekularnimi mehanizmi delovanja za zdravljenje raka te lokalizacije. Bolniki so vključeni v študijo po morebitnem popolnem molekularnem profiliranju tumorja. S sodelovanjem v eni študiji lahko bolnik, odvisno od prisotnosti ustreznih tarčnih proteinov, eno za drugim prejme najučinkovitejša zdravila. Med terapijo lahko izvajamo individualno prilagajanje odmerka zdravila ali pa uporabimo koktajl kombinacije različnih zdravil, po katerih se je med zdravljenjem pojavila potreba. Napredovanje tumorja in toksičnost nista razlog za prekinitev zdravljenja, temveč le za spremembo vrste terapije. Na klinično odločitev vplivajo rezultati molekularnega profiliranja tumorja, ki se izvede takoj po napredovanju tumorja ali naslednjem zdravljenju. Tako lahko bolnik med študijo prejme popolnoma drugačno zdravilo, kot mu je bilo prvotno predpisano.
Nazadnje že obstajajo sledi za samo enega bolnika – študije N-od-1. Ta zasnova je najbolj skladna s paradigmo personalizirane terapije. Ta pristop bo v bližnji prihodnosti omogočil ustvarjanje individualni pripravki za zdravljenje raka.
Vendar pa se še danes v klinični praksi vodilnih onkoloških centrov v ZDA, Evropi in na Japonskem široko uporabljajo personalizirani terapevtski protokoli, ki temeljijo na molekularnem profiliranju tumorja, kar omogoča doseganje kliničnih rezultatov nove ravni. Takšni globalni centri vključujejo Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, Center za personalizirano genetsko medicino na Harvardu, Inštitut za personalizirano medicino pri MD Anderson, Center za personalizirano zdravstveno nego na Ohio State University.
Od januarja 2014 je v Ukrajini na voljo molekularno profiliranje tumorskih tkiv, ki temelji na platformi Caris Molecular Intelligence Services. To je postalo mogoče zaradi AmaxaPharma, ki je uradni partner Caris Life Sciences na področju molekularnega profiliranja tumorskega tkiva v vzhodni Evropi. Od januarja 2014 je zahvaljujoč temu sodelovanju molekularno profiliranje s strani Molecular Intelligence v Ukrajini že opravilo več deset bolnikov z redkimi tumorji, za katere ni standardnih terapij, ter bolnikov z rakom s primarno in pridobljeno kemorezistenco. Pridobljeni so bili prvi rezultati, ki se bistveno razlikujejo od rezultatov empiričnega pristopa.
Možnost molekularnega profiliranja je pri nas omogočila, da se približamo rešitvi problema personaliziranega zdravljenja raka.

Zaključek
Heterogenost tumorja je globoka klinične posledice za bolnike z rakom. Za sprejemanje pravilnih kliničnih odločitev je potrebno imeti najpopolnejšo sliko o biologiji rakave celice in njenem mikrookolju. Molekularno profiliranje primarnih tumorskih tkiv, hematogenih metastaz, tumorskih celic v obtoku in celic metastatske niše nam omogoča velik korak k uvedbi personaliziranega programa zdravljenja raka.

ČLANKI NA TEMO Onkologija in hematologija

06.01.2019 Onkologija in hematologija Promeneva diagnoza raka jajčnikov: izvedljivost vsakodnevnih diagnostičnih slik Uporaba mikafungina v hematologiji

Invazivna glivične okužbe(IGI) povečajo obolevnost, umrljivost, dolžino hospitalizacije in s tem povezane stroške pri hematoloških onkoloških bolnikih s hudo imunsko pomanjkljivostjo. Ti bolniki imajo veliko število medsebojno povezani dejavniki tveganja za razvoj IGI, kot so oslabljene anatomske ovire, imunska supresija, nevtropenija zaradi kemoterapije, odpoved ledvic ali jeter, hiperglikemija in reakcija presadka proti gostitelju, pa tudi zdravljenje z antibiotiki širokega spektra ali kortikosteroidi, vstavljanje centralnih venskih katetrov...

06.01.2019 Onkologija in hematologija Sklep srečanja za strokovnjake o problematiki trombocitopenije v praksi onkologov in hematologov

Trombocitopenija je skupina bolezni in sindromov, za katere je značilen hemoragični sindrom, ki se razvije kot posledica zmanjšanja števila trombocitov v periferni krvi.<150×109/л....