RIT in RIF sta pri poznem sifilisu negativna. Katere krvne preiskave se vzamejo za sifilis in kako se razlagajo? Možnosti zasebne analize RIF: absorpcija RIF

Laboratorijska diagnostika uporablja več testov za sifilis hkrati, da dobi najbolj natančen rezultat. To traja več časa, vendar daje najbolj natančen odgovor.

Najpogosteje je rezultat analize RIF predstavljen v številkah. Dekodiranje ima naslednje simbole:

• močno pozitiven rezultat je označen s 4 plusi (++++);
• pozitiven rezultat je označen s 3 plusi (+++);
• šibko pozitiven rezultat z 2 plusoma (++);
• dvomljiv rezultat 1 plus (+);
• negativen rezultat je označen z 1 minus (-).

Rezultat RIF za sifilis je predstavljen tudi v odstotkih, ki je odvisen od kvantitativnega kazalnika povezanih bakterij:

• če je rezultat negativen, je imobilizacija do 20%;
• s šibko pozitivnim rezultatom se imobilizacija giblje od 20 do 50%;
• s pozitivnim rezultatom je imobilizacija nad 50%.

Če je rezultat pozitivno odgovor, potem to kaže na prisotnost bolezni.

Če rezultat šibko pozitivno, potem to pomeni eno samo količino preostalih protiteles v krvi.

Negativno rezultat kaže na odsotnost treponeme pallidum, kar pomeni, da je bolnik zdrav.

Izkušeni zdravniki naše klinike bodo hitro in z visoko natančnostjo diagnosticirali sifilis. Zato smo socialno usmerjeni v vse segmente prebivalstva stroški analize RIF so poceni. Cena je predstavljena v tabeli na naši spletni strani.

Pri serološki diagnostiki sifilisa je zelo pomembno pridobiti zanesljiv in natančen rezultat.

Za izboljšanje kakovosti podatkov se izvajajo nekateri ukrepi:

• Testni serum razredčimo 200-krat (1:200), da preprečimo lažno pozitivne reakcije. Potem pravijo, da se izvaja test za sifilis RIF 200.
• V drugi možnosti, pri redčenju seruma 1: 5, se dodatno uporablja poseben absorbent, ki zbira "odvečna" protitelesa, tako da ne izkrivljajo rezultatov.

Raziskovalcem na roko igra tudi velikost treponemov. Velika mikrobna telesa spirohet so jasno vidna pod fluorescenčno mikroskopijo. Če se nanje »prilepijo« s fosforjem označene beljakovine iz seruma. Uporaba standardiziranega antigena in seruma nam omogoča maksimalno povečanje občutljivosti in specifičnosti RIF pri diagnozi sifilisa.

Možnosti zasebne analize RIF: absorpcija RIF

Ena od alternativnih metod se imenuje RIF-Abs. Od običajne metode se razlikuje po nizki razredčenosti testnega seruma - 1:5 proti 1:200, kot običajno.

Koncentrirani vzorec vsebuje veliko aktivnih beljakovinskih molekul.

Da bi se izognili in povečali občutljivost, je serum obdelan s posebnim absorbentom iz drobcev sifilitičnih spirohet. Sorbent zbere preveč aktivna protitelesa, nato pa vzorec obdelamo z industrijskim serumom, označenim s fosforjem. Zahvaljujoč tej predpripravi so izločene vse nepotrebne molekule, ki bi lahko vplivale na rezultate testa.

Postavljen je v skladu z naslednjimi indikacijami:

• Pozitiven glede na klinično dobro počutje in brez anamneze tveganja okužbe.
• Pozitiven RV pri bolnikih s kroničnimi boleznimi.
• Negativna RV, ko se pojavijo simptomi, sumljivi na sifilis.

Prvi pozitivni rezultati se pojavijo že 15-16 dan od trenutka okužbe. Če se reakcija spremeni iz pozitivne v negativno, to pomeni popolno ozdravitev sifilisa. Verjetnost lažno pozitivnega rezultata je manjša od 0,4%.

Do tega lahko pride pri pregledu bolnikov z rakom, alkoholikov, nosečnic in ljudi z motnjami imunosti.

Določen delež je posledica tehničnih napak, saj je izdelava precej kompleksna. Včasih je treba prirojeno patologijo razlikovati od pridobljene. To lahko storite, če iščete različni tipi protiteles v pacientovi krvi.

Protitelesa proti sifilisu razreda M (IgM) se pojavijo kmalu po okužbi in so veliko hitrejša od IgG. Omogoča vam, da jih prepoznate analiza za absorpcijo RIF sifilisa IgM. Če so rezultati te reakcije pozitivni, potem lahko govorimo o nedavni okužbi. Tako lahko primere ponovne okužbe ločimo od recidiva ali odkrijemo okužbo otroka po porodu.

Na podlagi rezultatov te tehnike analize RIF se sklepa tudi o učinkovitosti zdravljenja zgodnjega sifilisa.

Če sumite na sifilis, se obrnite na izkušenega venerologa.

Analiza za sifilis se izvaja z uporabo številnih metod za odkrivanje patogena. Z razvojem patologije se pojavi veliko število specifičnih znakov, zato je treba ugotoviti natančno diagnozo bolna oseba je celovito pregledana. Splošni krvni test ni zelo informativen in se ne uporablja za diagnosticiranje te spolno prenosljive okužbe.

Vrste raziskav in biomateriali za analizo

Za prepoznavanje bolezni se uporabljajo različne tehnike in biomateriali. Vklopljeno zgodnje faze Sifilis se določi z bakterioskopskim testom. Vzorci se pregledajo pod mikroskopom. Naprava vam omogoča odkrivanje sevov patogenov. Kasneje se opravijo serološke preiskave krvi. Zahvaljujoč njim se v vzorcih odkrijejo antigeni in protitelesa sifilisa.

Metode za določanje spolno prenosljivih okužb so razdeljene v 2 kategoriji:

• Neposredna identifikacija patogenih mikroorganizmov. Sem spadajo: mikroskopija temnega polja, analiza RIT (okužba kuncev z biomaterialom za raziskave), metoda PCR - polimeraza. verižna reakcija(z njegovo pomočjo najdemo genetske elemente patogena).
• Posredni (serološki) testi omogočajo odkrivanje protiteles proti patogenu. Proizvajajo se imunski sistem, kot odgovor na okužbo.

Serološke tehnike so razdeljene v dve kategoriji: treponemske in netreponemske.

• Netreponemski, vključno z: testom s toluidinskim rdečim, analizo RSC, testom RPR, preiskavo krvi z uporabo ekspresne metode RMP.
• Treponemal, vključno z: imunobloting, RSK test, RIT analiza, RIF študija, RPGA test, ELISA analiza.

Informacijska vsebina testov za okužbo je različna. Najpogosteje se izvajajo glavne vrste testov za sifilis, ki vključujejo serološke metode.

Biomaterial za raziskave

Za identifikacijo Treponema pallidum, patogena, ki izgleda kot spirala in povzroča sifilis, se vzamejo vzorci:

• venska kri;
• cerebrospinalna tekočina (izloček iz hrbteničnega kanala);
• vsebina bezgavk;
• razjedno tkivo.

Če je potrebno opraviti teste za odkrivanje sifilisa, se kri daruje ne samo iz kubitalne vene, ampak tudi iz prsta. Na izbiro biomateriala in metode preiskave vplivata resnost okužbe in opremljenost diagnostičnega centra.

Neposredna raziskava

Prepričljiv dokaz sifilisa je identifikacija povzročiteljev okužbe pod mikroskopom. Na ta način povzročitelja najdemo pri 8 od 10 preiskovancev, negativen izvid pri preostalih 2 pacientih ne pomeni, da nista okužena.

Študija se izvaja na primarni in sekundarni stopnji (stopnji) bolezni, za katero je značilen pojav kožnih izpuščajev in sifilomov (razjed) na epitelnih tkivih ali sluznicah. V izcedku iz lezij najdemo patogene, ki povzročajo spolno prenosljive bolezni.

Natančneje, kompleksen test, imenovan RIF, imunofluorescenčna reakcija, lahko odkrije treponeme. Vzorec za raziskavo je predhodno obdelan s fluorescentnimi protitelesi. Spojine, ki lahko svetijo, se zlepijo z bakterijami. Pregled vzorcev pod mikroskopom, v primeru okužbe, laboratorijski tehnik vidi peneče patogene.

Test se uporablja za zgodnjo diagnozo bolezni. Dlje ko bolezen traja, manjša je občutljivost raziskovalnih metod. Poleg tega pade po zdravljenju izpuščajev in razjed antiseptiki in pri bolnikih, ki se zdravijo. Občasno študija daje lažno negativne in lažno pozitivni.

Analiza RIT je zelo natančna metoda za odkrivanje sifilisa. Pri izvajanju testa morate dolgo čakati na rezultate. Dokler okuženi zajec ne pokaže znakov okužbe. Test se uporablja zelo redko, kljub temu, da je izjemno natančen.

Z uporabo verižna reakcija polimeraze Sifilis določajo genetski elementi patogenov. Edina pomanjkljivost PCR je visoka cena.

Netreponemski testi

Takšni krvni testi pomagajo prepoznati protitelesa, ki se pojavijo kot odziv na kardiolipin, spojino, povezano s splošno strukturo membran patogenov.

Wassermanova reakcija (RW ali RW)

Najbolj znan test za sifilis je Wassermanova reakcija. RV je vključen v kategorijo reakcij vezave komplementa (CFR). Nove metode RSC se bistveno razlikujejo od tradicionalnih RW. Vendar so označeni, kot prej, s pojmom "Wassermannova reakcija".

Imunski sistem sintetizira protitelesa (markerje) kot odgovor na invazijo treponem. Odkrijejo jih s krvnim testom za sifilis z uporabo Wassermanove reakcije. Pozitiven rezultat RW potrjuje, da je subjekt okužen.

Reakcija hemolize – indeks RT analize. Z njim sodelujeta dve snovi: hemolitični serum in ovčje rdeče krvne celice. Serum je narejen z imunizacijo zajca z ovčjimi rdečimi krvnimi celicami. dejavnost biološka tekočina zmanjšano s segrevanjem.

Indikatorji RV so odvisni od tega, ali je prišlo do hemolize ali ne. V vzorcu brez markerjev pride do hemolize. V tem primeru je reakcija na antigene nemogoča. Komplement se porabi za interakcijo z ovčjimi rdečimi krvnimi celicami. Ko so v vzorcu markerji, kompliment reagira z antigeni. V tem primeru se hemoliza ne pojavi.

Treponemalni testi za sifilis. Splošen opis.

Za zanesljivo diagnosticiranje sifilisa in odkrivanje protiteles proti sifilitu v bolnikovem telesu (v krvnem serumu ali cerebrospinalni tekočini) se uporabljajo posebne tehnologije. laboratorijske raziskave- tako imenovane serološke metode.

Pri izvajanju diagnostičnih testov za sifilis se uporabljajo različne serološke reakcije: aglutinacija, precipitacija, imunofluorescenca, fiksacija komplementa, encimski imunski test itd. Vse te serološke reakcije temeljijo na interakciji antigenov in protiteles.

Imenujejo se specifični serološki testi treponema ker ti testi uporabljajo treponemo pallidum ali njene antigene, torej antigene treponemalnega izvora. Namen treponemskih testov je identificirati specifična protitelesa proti antigenskim strukturam povzročitelja sifilisa, to je protitelesa, usmerjena specifično proti sami bakteriji T. Pallidum in ne proti telesnim tkivom, ki jih poškoduje treponema. Specifična protitreponemska protitelesa razreda IgM se lahko odkrijejo že ob koncu drugega tedna bolezni.

7. Lažno pozitivni in lažno negativni rezultati

Pozitivni rezultati RV za sifilis pri posameznikih, ki ne trpijo za to boleznijo, se imenujejo lažno pozitivni. Delež lažno pozitivnih rezultatov pri zdravih osebah je 0,2-0,25 %. Če je odstotek nespecifičnih lažno pozitivnih rezultatov RT pri zdravih ljudeh zelo majhen, potem je lahko pri nekaterih boleznih visok.

Vse nespecifične rezultate seroloških reakcij lahko razdelimo v naslednje glavne skupine:

1. Bolezni, ki jih povzroča prisotnost skupnih antigenov v podobnih patogenih (spirohetah): ponavljajoča se vročina, frembeije, bejel, pinta, ustna treponema, leptospira.

2. Pozitivne reakcije, ki jih povzročajo spremembe v metabolizmu lipidov in spremembe serumskih globulinov. Sem spadajo pozitivni rezultati pri nosečnicah, bolnikih s protinom, lipidnimi motnjami kot posledica zastrupitve s svincem, fosforjem, po jemanju natrijevega salicilata, digitalisa itd. Med te reakcije je treba vključiti tudi pozitivne reakcije pri nekaterih nalezljivih boleznih ( tifus, malarija, pljučnica, gobavost, endokarditis, kolagenoza, miokardni infarkt, pretres možganov, onkološke bolezni ciroza jeter itd.)

3. Tehnične napake. Nepravilna izbira odmerka komplementa, neupoštevanje pogojev in rokov shranjevanja reagentov, izključitev kontrolnih vzorcev krvnega seruma iz testa, uporaba kontaminiranih epruvet in instrumentov.

8. Modifikacija Wassermanove reakcije

Obstajajo modifikacije Wassermanove reakcije v kvalitativni in kvantitativni različici, na mrazu, s cerebrospinalno tekočino.

Predelava avtodoma na mrazu se je izkazalo za bolj občutljivo. Posebnost metode uprizoritve Wassermanove reakcije na mrazu so trifazni temperaturni režimi, pri katerih pride do fiksacije komplementa. To reakcijo izvajamo tudi s kardiolipinom in treponemskim antigenom.

Poleg kvalitativne ocene RF obstaja metoda za njeno kvantitativno izjavo z različnimi razredčinami krvnega seruma (1:10, 1:20, 1:80, 1:160, 1:320). Titer reagina je določen z največjo razredčitvijo, ki še daje močno pozitiven rezultat (4+). Kvantitativno določanje stopnje RV je pomembno pri diagnostiki nekaterih oblik sifilisa in pri spremljanju učinkovitosti terapije.

9. Področje uporabe

V Rusiji je RSKt del niza standardnih seroloških testov za sifilis (SSR).

Wassermanova reakcija s treponemskim in kardiolipinskim antigenom (RSKt) se uporablja za

• diagnoza vseh oblik sifilisa,
• nadzor nad učinkovitost zdravljenja,
• pregledi oseb, ki so imele spolni stik z bolnikom s sifilisom,
• pregled oseb s kliničnim in anamnestičnim sumom na sifilis
• med preventivnim pregledom za sifilis bolnikov v psihiatričnih in nevroloških bolnišnicah, darovalcev in nosečnic, vključno z osebami, poslanimi na splav.

Trenutno je po odredbi Ministrstva za zdravje Ruske federacije priporočljivo zamenjati RSCT z bolj občutljivimi treponemskimi metodami (ELISA ali RPGA).

V tujini se Wassermanova reakcija s treponemskim antigenom že dolgo ne uporablja v klinični laboratorijski praksi in ni vključena v seznam standardnih testov, ki jih priporoča Svetovna zdravstvena organizacija.

Kompleks klasičnih seroloških reakcij (CSR)

KSR- To kompleks reakcij, ki se uporablja za serodiagnozo sifilisa kot standardna metoda. Ta kompleks reakcij vključuje Wassermannovo reakcijo s kardiolipinskim antigenom (izvleček iz govejega srca, obogaten z lecitinom in holesterolom) in treponemskim antigenom (z ultrazvokom obdelana suspenzija apatogenih gojenih bledih treponemov) ter reakcijo mikroprecipitacije (MPR) z plazme ali inaktiviranega seruma, ki je obložen s kardiolipinskim antigenom

CSR postanejo pozitivni sredi primarnega obdobja (njena delitev na seronegativne in seropozitivne je natančno določena s CSR), v sekundarnem obdobju so CSR pozitivni pri 98-100% bolnikov, v terciarnem obdobju pa le pri 60-70 %. To pomeni, da se s podaljševanjem trajanja bolezni pozitivnost CSR postopoma zmanjšuje.

Prednosti DAC:

1) Poceni, enostavnost in hitrost namestitve. To še posebej velja za reakcijo mikroprecipitacije: RMP je trenutno glavna presejalna (selekcijska) metoda;

2) Netreponemski testi so priročni za spremljanje ozdravitve sifilisa.

Slabosti DAC:

1) Subjektivnost pri ocenjevanju rezultatov reakcij ("na oko");

2) Nizka občutljivost pri poznih oblikah sifilisa;

3) Pomanjkanje specifičnosti v primerjavi z več sodobni testi. Pri njihovem izvajanju pogosto opazimo lažno pozitivne reakcije (FPR).

LPR lahko povzroči navzkrižna reaktivnost med bledo spiroheto in drugimi mikrobi, motnje presnove lipidov in beljakovin, nestabilnost celične membrane, tvorba avtoprotiteles. LPR opazimo pri akutnih (malarija, infekcijska mononukleoza itd.) In kroničnih (tuberkuloza, gobavost, hepatitis, borelioza itd.) okužbah, miokardnem infarktu, cirozi jeter, kolagenozah (zlasti pri SLE), onkopatologiji, cepljenju, uživanju drog, zloraba alkohola in mastne hrane. Lažno pozitivni rezultati se lahko pojavijo v zadnjih tednih nosečnosti, po porodu in pri nekaterih ženskah med menstruacijo. Lažno negativni rezultati DSC so lahko povezani z okužbo s HIV.

RIT, RIBT - Reakcija imobilizacije treponeme pallidum

Imobilizacijski test treponeme pallidum (TPI) je klasična metoda, ki se uporablja za odkrivanje specifičnih treponemskih protiteles. Reakcija RIBT uporablja kot antigen patogeno Treponema pallidum T. pallidum (sev Nichols), gojeno v kunčjih modih. RIBT temelji na izgubi gibljivosti žive treponeme pallidum po izpostavitvi protitelesom iz bolnikovega krvnega seruma in komplementa. Rezultati se ocenijo z mikroskopijo v temnem polju. Čeprav je bil test RIBT uveden v klinično prakso kot specifičen test za sifilis, je delovno intenziven, tehnično zapleten, dolgotrajen in drag za uporabo.

1. Zgodovina metode RIBT

Imobilizacijski test Treponema pallidum (TPI) je pravzaprav prvi specifični test za diagnosticiranje sifilisa. To reakcijo sta leta 1949 uvedla ameriška raziskovalca R. W. Nelson in M. M. Mayer in jo podrobno obravnavala v znanstvena dela v naslednjih desetletjih. Neuspešni poskusi uporabe živih treponem v testih so bili narejeni že prej. Zahvaljujoč dejstvu, da je Nelsonu uspelo ustvariti okolje, v katerem so treponemi ostali sposobni preživeti do 8 dni, je bila njegova raziskava uspešna.

2. Princip metode RIBT

Metoda temelji na pojavu izgube gibljivosti bledih treponem v prisotnosti imobilizirajočih protitreponemskih protiteles krvnega seruma in komplementa v anaerobnih pogojih. Antigen je živa patogena Treponema pallidum, pridobljena iz kuncev, umetno okuženih s sifilisom.

3. Nastavitev testa RIBT

Reakcija vključuje testni serum, komplement in antigen. Krvni serum preiskovanca dodamo živim treponemam, pridobljenim iz tkiva kunčjih testisov po umetni okužbi. Če so v serumu antitreponemska protitelesa-imobilizini, se treponema pallidum preneha premikati (imobilizira). Protitelesa proti imobilizinu so pozna antitreponemska protitelesa.

Reakcijo izvajamo s toplotno inaktiviranimi serumi ali z vzorci serumov, posušenih na voščenem papirju (suhe kapljice). Inaktivacijo seruma s segrevanjem izvajamo 30 minut pri temperaturi 56°C. Pred odvzemom krvi preiskovanec ne sme prejemati zdravil, zlasti penicilina. Jemanje zdravil se prekine za čas trajanja možna zamuda v organizmu.

Kot antigen se uporablja bakterija seva Nichols, pridobljena iz 7-10 dni starega kunčjega sifilitičnega orhitisa (vnetja testisa). Obdobje od trenutka vzpostavitve reakcije do beleženja njenih rezultatov traja 18-20 ur, zato je za ohranitev sposobnosti preživetja in dobre mobilnosti mikroorganizmov potrebno okolje za preživetje.

RIBT uporablja dopolnilo morskega prašička. Za pridobitev komplementa je treba v sterilnih pogojih odvzeti kri iz več morskih prašičkov.

V primeru bakterijske kontaminacije se komplement zavrne. Konzerviranega komplementa ni mogoče uporabiti pri imobilizacijski reakciji Treponema pallidum, ker je strupen za mikroorganizme.

Reakcija imobilizacije uporablja presežek komplementa. Njegova količina je v veliki meri odvisna od okolja preživetja Treponema pallidum.

RIBT se postavi v sterilne škatle, predhodno obsevane z baktericidom kvarčna svetilka v 45-60 minutah. Vsak krvni serum se pregleda v dveh epruvetah: izkušena in nadzor. Testni serum in antigen dodamo v obe epruveti v zahtevanih količinah. V epruveto vlijemo aktivni komplement, v kontrolno epruveto pa enako količino inaktiviranega krvnega seruma. morski prašiček. Po polnjenju se vsebina epruvet z rahlim stresanjem premeša.

RIBT se pojavi v anaerobnih pogojih. Epruvete s sestavinami postavimo v mikroanaerostat, iz katerega z vakuumsko črpalko izsesamo atmosferski zrak in iz jeklenke črpamo mešanico plinov (95 delov dušika in 5 delov ogljikovega dioksida). Mikroanaerostat z epruvetami postavimo v termostat (35°C) za 18-20 ur.

Rezultate RIBT ocenimo po odstranitvi cevk iz termostata in mikroanaerostata (tj. po 18-20 urah poskusa). S Pasteurjevo pipeto nanesemo kapljico vsebine epruvete na predmetno stekelce, ki ga pokrijemo s pokrovom in pregledamo v temnopoljskem mikroskopu (objektiv 40, okular 10X). V različnih delih preparata pregledamo več vidnih polj, pri čemer v vsakem preštejemo število mobilnih in nepremičnih bledih treponemov. Štetje se začne z zdravilom iz kontrole in nato iz epruvete.

Pri postavljanju reakcije se uporablja 5 kontrolnih študij: z očitno pozitivnimi in negativnimi krvnimi serumi, z aktivnim in inaktiviranim komplementom ter gojiščem za preživetje Treponema pallidum. Kontrolni negativni krvni serum se uporablja za presojo stopnje gibljivosti Treponema pallidum v tem poskusu. Kontrola pozitivnega krvnega seruma - za oceno stopnje imobilizacijske aktivnosti v pogojih tega poskusa. Izvedena je študija aktivnega in inaktiviranega komplementa ter okolja, da se ugotovi njihov učinek na gibljivost Treponema pallidum.

Če v poskusu primanjkuje komplementa, imobilizacijska protitelesa ne pokažejo pravilno svoje aktivnosti in treponeme ostanejo mobilne. Zato se po poskusu določi preostali komplement, da se oceni, ali je gibljivost Treponema pallidum v epruvetah nastala zaradi pomanjkanja komplementa. V ta namen se uporablja hemolitični sistem - mešanica suspenzije ovčjih eritrocitov in razredčenega hemolitičnega seruma, ki se hrani v termostatu.

Preostanek komplementa se določi z dodajanjem zahtevanega volumna hemolitičnega sistema v vsako epruveto. Epruvete postavimo v termostat pri 37° za 45 minut. V epruvetah naj bi prišlo do hemolize rdečih krvničk, v kontrolnih epruvetah pa do zakasnitve hemolize. Odsotnost hemolize v epruvetah kaže na nezadostno količino komplementa, v teh primerih je treba študijo ponoviti. Ponovnega testiranja krvnega seruma ne izvajamo le, če ugotovimo 100-odstotno imobilizacijo treponeme pallidum.

4. Obračunavanje rezultatov RIBT

Štetje imobiliziranih treponem, ki so izgubile svojo mobilnost, se izvaja pod mikroskopom z metodo mikroskopije v temnem polju. Od raziskovalca se zahteva sposobnost ocenjevanja gibanja treponem. Pozoren mora biti na intenzivnost gibov, ki jih izvaja Treponema pallidum. Pri tej bakteriji ni vedno mogoče opaziti valovitih kontrakcij in upogibnih gibov, včasih le rotacijskih. Prav tako morate znati razlikovati med aktivnimi gibi treponem in gibi s pretokom tekočine.

Za oceno rezultatov reakcije se izračuna odstotek imobilizacije bledih treponem, to je razmerje med mobilnimi in nepremičnimi treponemi v poskusu (z aktivnim komplementom) in kontrolo (z neaktivnim komplementom) po formuli:

X = (M – C) × 100/M

kjer je M število mobilnih treponem v kontroli; C je število mobilnih treponem v poskusu; X - % imobilizacija. IN praktično delo odstotek imobilizacije se določi iz predhodno sestavljene tabele z uporabo zgornje formule.

Reakcija imobilizacije Treponema pallidum je ocenjena kot

• pozitivno med imobilizacijo 51 - 100% treponema,
• šibko pozitivno: 31 - 50% nepremične treponeme,
• dvomljivo: 21 - 30% nepremične treponeme,
• negativno: 0 - 20% nepremične treponeme.

Reakcija imobilizacije Treponema pallidum postane pozitivna ob koncu primarnega - začetku sekundarnega obdobja sifilisa (od 7-8. tedna od trenutka okužbe ali več). Vendar pa je RIBT malo uporaben za diagnosticiranje zgodnjih faz sifilisa, saj se protitelesa, ki imobilizirajo Treponema pallidum in se odkrijejo v reakciji, pojavijo šele 3-6 tednov po okužbi. Protitelesa za imobilizin spadajo v razred imunoglobulinov IgG. V krvi se pojavijo pozneje kot reagini (antikardiolipinska protitelesa), kasneje kot fluoresceinska protitelesa (zaznamo z RIF in ELISA) in precipitini (zaznamo jih pri raku mehurja).

V prihodnje ostaja RIBT pozitiven. Pri poznih oblikah sifilisa obstaja visoka občutljivost reakcije. V primeru sekundarnega, poznega sifilisa, nevrosifilisa, prirojenega sifilisa je pozitiven rezultat RIBT zabeležen v 95–100% primerov. Pri terciarnem sifilisu s specifičnimi lezijami notranjih organov in živčnega sistema, ko je RV pogosto negativen, RIBT daje pozitivne rezultate v 98 - 100% primerov.

RIBT za dolgo časa je bil priznan kot najbolj specifičen test za sifilis. Po literaturi je specifičnost RIBT 99%, občutljivost se giblje od 79 do 94%. Po TsNIKVI je občutljivost RIBT (skupaj za vse stopnje sifilisa) 87,7%.

7. Obseg metode

Področje uporabe RIBT se postopoma oži zaradi trajanja namestitve, visokih stroškov in delovne intenzivnosti. RIBT je precej zapletena in draga analiza, ki zahteva visoko usposobljeno osebje in prisotnost vivarija. V zvezi s tem se je uporaba te metode v zadnjih letih močno zmanjšala. V ZDA se ta test trenutno uporablja samo v raziskovalnih laboratorijih.

Glede na kompleksnost in visoko ceno RIF in RIBT jih je smiselno uporabljati za diagnosticiranje poznih in latentnih oblik sifilisa. RIBT ohranja svoj položaj "reakcijskega razsodnika" pri diferencialni diagnozi zgodnjih latentnih oblik sifilisa in lažno pozitivnih rezultatov. Ta reakcija je lahko koristna pri diagnosticiranju nevrosifilisa in kadar so rezultati drugih seroloških testov neskladni.

RIBT postane pozitiven mnogo kasneje kot RIF in RV. Zato se ne uporablja za diagnosticiranje nalezljivih oblik sifilisa.

RIBT, tako kot RIF, se med antisifilitično terapijo zelo počasi negativizira. Zaradi tega ni primeren za spremljanje napredka antisifilitičnega zdravljenja.

Lažno pozitivni rezultati (FPR) z RIBT so redki in so bili opaženi predvsem pri številnih treponematozah (frambazija, pinta, bejel), ki jih v Rusiji ni, pa tudi pri gobavosti, sarkoidozi, SLE, tuberkulozi, cirozi jeter. jeter in nekatere druge redke bolezni, ki niso sifilične narave. S staranjem bolnikov se število lažno pozitivnih rezultatov RIBT povečuje.

RIBT je lahko lažno pozitiven, če testni serum vsebuje treponemocidne snovi (npr. peniciline, tetracikline, eritromicin), ki povzročajo nespecifično imobilizacijo treponeme pallidum.To je lahko posledica jemanja pacienta treponemocidnih antibiotikov, zato preiskave ne opravimo. za osebe, ki so prejemale antibiotike za prejšnji mesec. Krv za RIBT je mogoče testirati ne prej kot 2 tedna po koncu jemanja antibiotikov in drugih antisifilitičnih zdravil.

9. Spremembe imobilizacijske reakcije treponeme pallidum

Poleg mikroanaerostatske tehnike obstaja melanžna metoda RIBT po N.M. Ovčinnikov. Anaerobne pogoje pri postavljanju reakcije ustvarimo tako, da reakcijsko zmes postavimo v melanger (mešalnik levkocitov), ​​katerega oba konca zapremo z gumijastim obročem. Tehnika melange reakcije vam omogoča, da delate brez vakuumske črpalke, jeklenke z mešanico dušika in ogljikovega dioksida ali mikroanaerostata. Primerjalna študija na velikem kliničnem materialu je dala rezultate, ki niso slabši od klasične anaerostatske tehnike.

10. Lastnosti, prednosti in slabosti RIBT

RIBT je tehnično zapletena in draga diagnostična metoda. Tehnologija zahteva znatna sredstva za vzdrževanje kuncev in izvajanje testiranja. Ta delovno intenziven test se trenutno uporablja predvsem v znanstvene namene. V večini tujih držav se RIBT že skoraj 40 let praktično ne uporablja v diagnostične namene, ampak le v raziskovalnem delu.

Slabosti reakcije:

• RIBT zahteva delo z živo patogeno Treponema pallidum seva Nichols, ki ostaja nalezljiva za ljudi kljub prilagoditvi na zajce
• uprizarjanje reakcije je zapleteno, dolgotrajno in drago
• potreben je vivarij
• za postavitev reakcije, beleženje rezultatov in vzdrževanje vivarija je potrebno visoko usposobljeno osebje
• subjektivnost ocene rezultatov
• pomanjkanje avtomatizacije
• te serološke metode ni mogoče standardizirati.
• reakcija ni uporabna v ozadju tekoče antisifilitične terapije
• nezmožnost uporabe za nadzor zdravljenja. RIBT pri bolnikih s sifilisom lahko ostane pozitiven več let (in celo življenje), kljub prejemu popolnega zdravljenja.
• reakcija lahko daje lažno pozitivne rezultate pri bolnikih z malignimi tumorji, sladkorno boleznijo, gobavostjo, avtoimunskimi boleznimi, pljučnico in hudo kardiovaskularno patologijo.

Prednosti RIBT so:

1) dovolj visoka občutljivost;

2) Visoka specifičnost.

RIF (Imunofluorescenčna reakcija)

Imunofluorescenčna reakcija (RIF) je hitra diagnostična metoda za identifikacijo mikrobnih antigenov ali določanje protiteles. Testi, ki temeljijo na detekciji fluorescenčnega signala, veljajo za enega najboljših testov za sifilis.

1. Zgodovina metode

Test fluorescenčnih treponemskih protiteles (FTA) so leta 1957 prvič razvili Deacon in soavtorji (Deacon, Falcone in Harris).

2. Načelo metode

Metoda RIF temelji na dejstvu, da lahko tkivni antigeni ali mikrobi, obdelani z imunskimi serumi s protitelesi, označenimi s fluorokromi, svetijo v UV žarkih fluorescenčnega mikroskopa. Bakterije v brisu, obdelanem s takšnim luminiscenčnim serumom, svetijo po obodu celice v obliki zelene obrobe.

Kot antigen v RIF uporabimo suspenzijo živega patogenega bledega treponema seva Nichols iz kunčjega orhitisa, ki ga posušimo na predmetnem stekelcu in fiksiramo z acetonom. Pacientov krvni serum dodamo Treponemi pallidum, posušimo in fiksiramo v steklu z acetonom.

Po izpiranju zdravilo obdelamo s serumom, ki vsebuje protitelesa proti humanim imunoglobulinom, označenim s fluoresceinom. Preparat ponovno speremo in pregledamo pod fluorescentnim mikroskopom. Če testni serum vsebuje antitreponemska fluoresceinska protitelesa, opazimo rumeno-zelen sijaj treponem.

3. Metoda izvajanja raziskave z metodo RIF

Antigen, fiksiran na stekelcu (patogena Treponema pallidum), obdelamo s testnim serumom. Po pranju zdravilo obdelamo s fluorescenčnim serumom proti humanim imunoglobulinom, označenim s fluorokromom. V tem primeru se nastali fluorescenčni kompleks (antihumani globulin + fluorescein tioizocianat) veže na humani globulin na površini treponeme pallidum, kar zagotavlja sijaj treponeme pallidum pod fluorescenčnim mikroskopom.

Za odkrivanje kompleksov antigen-protitelo se uporablja luminiscenčni serum, ki predstavlja protivrstne (protičloveške) imunoglobuline, konjugirane s FITC. Prisotnost protiteles proti treponem v serumu se določi s sijajem treponem pri pregledu pod fluorescentnim mikroskopom. Test se izvaja v kvalitativni in polkvantitativni različici.

4. Računovodstvo rezultatov

Vizualizacija rezultatov RIF se izvaja s fluorescenčnim mikroskopom. Rezultate ocenjujemo glede na stopnjo luminiscence treponemov v pripravku. V prisotnosti protiteles je viden sijaj treponem, če pa protiteles proti treponem v serumu ni bilo, potem treponemi niso vidni. Stopnja luminiscence posušene blede treponeme, pritrjene na steklo, je označena s "plusi" (od "–" do "++++"). Negativen rezultat - brez sijaja ali ravni ozadja - 1+.

5. V katerih obdobjih bolezni je bolje uporabiti

Imunofluorescenčna reakcija (RIF) je precej občutljiva v vseh fazah okužbe, od konca inkubacijske dobe do poznega sifilisa. Primarno obdobje sifilisa v klasičnem poteku se začne 3-4 tedne po okužbi. RIF postane pozitiven v prvih dneh primarne menstruacije ali celo na koncu inkubacijska doba, od 3. tedna po okužbi. Rezultati RIF ostajajo pozitivni v vseh obdobjih, tudi v poznih oblikah.

RIF postane pozitiven nekoliko prej kot RV. Po nekaterih podatkih se pozitivni RIF pojavi pri 80% bolnikov s primarnim seronegativnim sifilisom. V sekundarnem obdobju je RIF pozitiven skoraj v 100% primerov. Pri latentnem sifilisu je vedno pozitiven, pri poznih oblikah bolezni in prirojenem sifilisu pa daje 95 - 100 % pozitivnih rezultatov.

6. Občutljivost in specifičnost

Imunofluorescenčna reakcija (RIF) je skupina metod z visoko občutljivostjo in specifičnostjo. RIF je občutljiv v vseh fazah okužbe, od inkubacijske dobe do poznega sifilisa. Po podatkih WHO je občutljivost RIF za primarni sifilis 70-100%, za sekundarni in pozni sifilis - 96-100%, specifičnost - 94-100%. Po TsNIKVI je občutljivost RIF za vse oblike sifilisa 99,1%.

Specifičnost RIF lahko povečamo s predhodno obdelavo testnega seruma s sorbentom - ultrazvočnim treponemskim antigenom, ki veže skupinska protitelesa (RIF-abs).

7. Obseg metode

RIF se uporablja:

• kot potrditvena reakcija pri zgodnjem latentnem sifilisu
• pri postavljanju retrospektivne diagnoze
• za razlikovanje latentnih oblik sifilisa in lažno pozitivnih rezultatov testa za sifilis.
• kot potrditveni test za nevrosifilis.

RIF se pogosto uporablja kot potrditveni test, vendar ni namenjen rutinski uporabi ali presejanju, ker ga je tehnično težko izvesti. Za izvedbo RIF je potreben vivarij ali nabava suspenzije patogene Treponema pallidum, kar omejuje možnosti reakcije. Vendar pa so se v zadnjih letih na domačem trgu začeli pojavljati testni sistemi, ki omogočajo izvedbo reakcije v odsotnosti vivarija in lastnega laboratorijskega seva patogene Treponema pallidum.

8. Viri in vzroki napak med proizvodnjo, lažno pozitivnih in lažno negativnih rezultatov

LPR so ob diagnozi RIF redki (pri kolagenozah, boreliozah).

RIF še vedno velja za enega najboljših testov za sifilis, "zlati standard" serodiagnostike. RIF je lažje nastaviti kot RIBT,

Kljub visoki diagnostični vrednosti je razširjena uvedba RIF v vsakodnevna praksa ovirajo potreba po uporabi žive T. pallidum, visoki stroški in trajanje študije. Nastavitev reakcije je delovno intenzivna. Poleg tega je ocena rezultatov RIF subjektivna.

Prednosti RIF in RIBT sta:

1) Visoka občutljivost (zlasti za RIF);

2) Visoka specifičnost (zlasti za RIBT).

Slabosti RIF in RIBT:

1) Tehnična zapletenost, visoki stroški metod.

2) Subjektivnost ocenjevanja rezultatov, pomanjkanje avtomatizacije;

3) RIF in RIBT pri bolnikih s sifilisom lahko ostaneta pozitivna več let (in celo življenje), kljub popolnemu zdravljenju. Zato teh reakcij ni mogoče uporabiti za spremljanje ozdravitve.

10. Spremembe metode

V praksi se za serodiagnozo sifilisa uporablja in uporablja več modifikacij imunofluorescenčne reakcije:

• RIF-abs– najbolj občutljiva metoda serodiagnostike sifilisa, postane pozitivna prej kot druge reakcije (od 3. tedna po okužbi);
• RIF-200(ob diagnozi se serum bolnika razredči 200-krat) – zelo specifična metoda za serodiagnostiko sifilisa.
• RIF-10(10-kratna razredčitev testnega seruma) je bolj občutljiva metoda kot RIF-200.
• RIF-ts izvajajo z alkoholom.
• RIF-abs-IgM- odkrivanje zgodnjih antitreponemskih protiteles razreda IgM.

1. Najbolj razširjena sprememba je RIF-abs- imunofluorescenčna reakcija z absorpcijo. Pred izvedbo reakcije bolnikov serum osiromašimo z mešanico nepatogenih treponem, da odpravimo navzkrižne reakcije. Skupinska protitelesa odstranimo iz testnega seruma s pomočjo kulture treponem, uničenih z ultrazvokom, kar bistveno poveča specifičnost reakcije. Ker se testni serum uporablja v razredčini 1:5, je RIF-abs zelo občutljiv.

Glavne indikacije za uporabo RIF-abs v klinični praksi so:

• diagnoza latentnih in poznih oblik sifilisa,
• odkrivanje lažno pozitivnih rezultatov CSR in raka mehurja, zlasti pri nosečnicah in somatskih bolnikih s sumom na sifilis,
• za postavitev retrospektivne diagnoze bolezni.

RIF-abs ni zelo informativen pri ocenjevanju rezultatov zdravljenja: pri 85% bolnikov, ki so prejeli ustrezno antisifilično terapijo, pozitivni rezultati RIF trajajo več let.

Ta reakcija se imenuje "zlati standard" za serodiagnozo sifilisa. Uporablja se za arbitražne primere, vendar je za zanesljiv rezultat potrebna sveža koncentrirana suspenzija T. pallidum seva Nichols iz sedemdnevnega orhitisa pri kuncu, ki je ni mogoče zamrzniti.

2. V ZSSR je bil nameščen v dveh modifikacijah - RIF-10 in RIF-200, tj. z redčenjem testnega seruma za 10 in 200-krat. RIF-200 - testni serum je razredčen 200-krat, da se zmanjša število lažno pozitivnih rezultatov. To zagotavlja visoko specifičnost reakcije, vendar se njena občutljivost nekoliko zmanjša. RIF-10 je bolj občutljiv, vendar pogosteje daje nespecifične pozitivne rezultate kot RIF-200, ki je zelo specifičen. RIF-10 je bolj občutljiv, RIF-200 in RIF-abs pa sta bolj specifična.

Ocenjuje se, da je občutljivost RIF-200 in RIF-abs 84–99 %, specifičnost pa 97–99 %.

3. RIF-ts izvajajo z alkoholom. Reakcija se izvede z uporabo celotne cerebrospinalne tekočine za identifikacijo specifičnih lezij centralnega živčnega sistema.

4. Reakcija RIF-abs-IgM predlagan za odkrivanje zgodnjih antitreponemskih protiteles razreda IgM. To reakcijo lahko uporabimo za diagnosticiranje prirojenega sifilisa, zgodnjih oblik sifilisa in diferencialno diagnozo primerov ponovne okužbe in serorelapsa.

Znani sta 2 različici te reakcije:

– FTA-ABS-IgM, ki temelji na uporabi v drugi fazi reakcije konjugata anti-IgM (s fluoresceinom označena protitelesa proti humanim IgM) namesto antihumanega fluorescenčnega globulina;

– Ruska različica RIF-abs-IgM, označena s tem, da se testiranemu krvnemu serumu doda sorbent, ki odstrani protitelesa IgG, RIF-abs pa se daje s preostalimi protitelesi IgM.

Glavne indikacije za testiranje RIF-abs-IgM so:

- serodiagnoza prirojenega sifilisa v odsotnosti očitnih manifestacij prirojenega sifilisa na koži in sluznicah pri otroku;

– diferencialna diagnoza ponovne okužbe in klinično-serološkega ali serološkega recidiva sifilisa, pri kateri bo RIF-abs-IgM negativen, RIF-abs pa pozitiven;

– ocena učinkovitosti zdravljenja zgodnje pridobljenega ali prirojenega sifilisa: po ustreznem zdravljenju postane RIF-abs-IgM v naslednjih 3-6 mesecih negativen.

To reakcijo lahko uporabimo za odkrivanje prirojenega sifilisa. Znano je, da velike molekule IgM ne morejo skozi zdravo placento. Posledično se lahko protitelesa razreda M proti treponemi pallidum pojavijo v otrokovem telesu zaradi kršitve pregradne funkcije posteljice ali pa jih proizvaja telo otroka s sifilisom. Protitelesa razreda IgM se v krvi bolnika s sifilisom pojavijo že v prvih tednih bolezni, protitelesa razreda IgG pa kasneje. Ločeno določanje protiteles obeh razredov se izkaže za izjemno koristno pri diagnosticiranju prirojenega sifilisa pri otrocih, saj bo prisotnost protiteles razreda IgM pri otroku v prvem mesecu življenja pokazala, da jih tvori telo otroka s sifilisom. , medtem ko bo odkrivanje samo protiteles IgG pokazalo materin izvor slednjih.

Nastavitev reakcije 19S(IgM)-RIF-abs vključuje predhodno ločevanje z uporabo gelske filtracije večjih molekul 19S IgM iz

frakcije manjših molekul 7S IgG. Nadaljnja študija reakcije RIF-abs krvnega seruma, ki vsebuje samo frakcijo 19S IgM,

odpravlja vse možne vire napak. Toda tehnika za uprizarjanje te reakcije je zapletena in delovno intenzivna ter zahteva posebno opremo in specialistično usposabljanje.

Imunska adhezijska reakcija (RIP, TPIA - Treponema pallida immunoadherence).

Ta reakcija temelji na uporabi pojava, ki ga je leta 1912 opisal Rieckenberg. RIP temelji na dejstvu, da se virulentna tkivna treponema, senzibilizirana s serumom bolnika s sifilisom, v prisotnosti komplementa in eritrocitov prilepi na površino eritrocitov in se med centrifugiranjem odnese z njimi v usedlino in izgine. iz supernatanta.

Za postavitev reakcije uporabimo naslednje sestavine: testni serum, antigen, komplement, rdeče krvne celice darovalca, izotonično raztopino natrijevega klorida. Kot antigen uporabljamo suspenzijo seva blede treponeme Nichols.

Domači in tuji avtorji v 50-60 letih so ta test najbolj raziskali v zvezi s serodiagnozo sifilisa. Dokazi o vrednosti RIP kot diagnostičnega testa so bili nedosledni. Reakcija je zahtevala maksimalno natančnost, saj je netočno doziranje sestavin ali presežek ali pomanjkanje testnega materiala v pripravku povzročilo nezanesljive rezultate.

V Rusiji je obsežno raziskavo izvedel L.V. Sazonov, ki je dobil podobne rezultate pri RIP in RIT z uporabo sveže pripravljene suspenzije patogenega seva pallidum treponema Nichols. Vendar pa je uporaba segretega ali s fenolom konzerviranega antigena močno popačila rezultate reakcije in povzročila nestabilnost antigena. Priporočite ta test za zamenjavo RIT L.V. Sazonova je menila, da je to nemogoče.

G.P. Avdeeva, ki je uporabila druge temperaturne in časovne režime pri proizvodnji antigena, je pri študiju RIP dobila drugačne rezultate. Po njenih podatkih je občutljivost te reakcije višja od občutljivosti KCP in RIT, vendar nekoliko slabša od RIF, specifičnost RIP, RIT in RIF pa je blizu.

Vendar pa pomanjkanje industrijske proizvodnje antigena za RIP ni omogočilo širše študije in uvedbe tega testa v prakso.

RPHA reakcija pasivne hemaglutinacije

Reakcija pasivne hemaglutinacije (RPHA) je pogost serološki test, ki je trdno uveljavljen v laboratorijski praksi. ima dokaj visoko stopnjo učinkovitosti pri raziskovanju.

1. Zgodovina metode RPGA

O uporabi RPHA za diagnozo sifilisa sta prvič poročala G. Blumental in W. Bachman (1932). Leta 1965 je bil predlagan indirektni ali pasivni hemaglutinacijski test za diagnosticiranje sifilisa. O spremembi reakcije z uporabo različnih antigenov je poročal Ratlev T. v letih 1965 - 1967. Mikromodifikacijo RPGA je predlagal Sokh R.M. in soavtorji 1969. Prvi komercialni testni sistem so razvili japonski znanstveniki Tomisava et. al. leta 1969

2. Princip metode RPGA

Iz pripravljene homogene suspenzije eritrocitov, »nabitih« z antigeni, se ob dodatku testnega seruma, ki vsebuje protitelesa, izloči oborina v obliki kosmičev. Nastala oborina je sestavljena iz rdečih krvnih celic, "zlepljenih" s protitelesi, in se imenuje "hemaglutinirati". Suspenzija rdečih krvničk je pripravljena vnaprej in dobavljena kot del diagnostičnih testnih sistemov.

Proces lepljenja rdečih krvničk, ki imajo na površini antigene, se imenuje "hemaglutinacija". Vezava nastane pod delovanjem specifičnih protiteles (aglutininov). Reakcija se imenuje "pasivno", Ker lastni antigeni eritrocitov ne reagirajo, sami eritrociti pa opravljajo izključno pomožno indikatorsko funkcijo.

Pasivna (posredna) hemaglutinacijska reakcija je vrsta aglutinacijske reakcije, pri kateri se kot nosilci antigena uporabljajo eritrociti (iz grške háima - kri) in ne drugi delci. Na splošno se pri aglutinacijski reakciji pod vplivom protiteles zlepijo in oborijo mikrobi ali druge celice – ne nujno rdeče krvne celice, ampak na primer delci lateksa, bakterije ali drugi korpuskularni delci, ki nosijo antigen.

Pri reakciji pasivne hemaglutinacije za diagnosticiranje sifilisa se kot antigen uporabljajo ovčji ali ptičji eritrociti, obloženi z antigeni Treponema pallidum. Ko dodamo serum, ki vsebuje specifična protitelesa, se rdeče krvne celice zlepijo (aglutinacija).

Reakcija RPGA je razvrščena kot imunološka metoda, ker temelji na specifični interakciji patogenega antigena treponeme pallidum s protitelesom. Po "mrežni teoriji" je aglutinacija posledica "navzkrižnega povezovanja" površinskih molekul antigena z molekulami protiteles (imunoglobulini).

3. Nastavitev reakcije pasivne hemaglutinacije

RPGA je nameščen v plastičnih tabletah ali v epruvetah z razredčino bolnikovega krvnega seruma, ki mu je dodan eritrocitni diagnostik.

Postopek spajanja antigena z eritrociti imenujemo senzibilizacija, tako dobljeni umetni korpuskularni antigen pa senzibilizirani eritrociti. Diagnostika eritrocitov imenujemo eritrociti, senzibilizirani z antigenom.

Za pripravo diagnostikuma uporabimo eritrocite ovac ali ptic (običajno piščancev), najprej obdelane s formaldehidom in nato s taninom, ki jih senzibiliziramo z ultrazvočnim antigenom patogene treponeme pallidum (sev Nichols) ali rekombinantnimi proteini treponema pallidum (TpN15, TpN17, TpN47). Uporabimo lahko tudi ovčje eritrocite, senzibilizirane z ultrazvočnim antigenom gojene Treponema pallidum.

Testira se le serum (ne uporabljajte krvne plazme). Hemolizirani in motni vzorci niso primerni. Nesenzibilizirani eritrociti služijo kot negativna kontrola (za izključitev prisotnosti antieritrocitnih protiteles). V vsaki seriji produkcij se uporabljajo pozitivne in negativne kontrole.

V jamice (vdolbinice) imunološke tablete se dodajo vzorci preiskovanega krvnega seruma in preiskovanih rdečih krvničk. Če pacientov krvni serum vsebuje specifična antitreponemska protitelesa, potem ko se testni serum doda v jamico z antigenom, pride do tvorbe kompleksov antigen-protitelo, povezanih s površino nosilcev (eritrocitov). Vizualno se to kaže z lepljenjem rdečih krvničk, to je hemaglutinacijo, ki je vidna s prostim očesom. Imunski kompleksi "protitelo-antigen-eritrocit", ki pod vplivom gravitacije postopoma padajo navzdol, se porazdelijo po celotni površini dna luknje in tvorijo značilno sliko "obrnjenega dežnika".

Glede na količino protiteles v testnem vzorcu se slika "obrnjenega dežnika" spreminja od maksimuma, ki zavzema celotno površino dna jamice, do majhnega območja v osrednjem, najnižjem delu (z jasnino v središče in tvorba intenzivnejšega obroča usedlih rdečih krvničk na periferiji).

Imunski kompleksi ne nastanejo, če v vzorcu ni specifičnih protiteles ali ko reakciji dodamo kontrolne (intaktne) rdeče krvničke. Istočasno se rdeče krvne celice postopoma zbirajo na najnižji točki dna luknje in tvorijo figuro v obliki kompaktne točke ali "gumba", včasih z rahlo čistino v sredini.

Če krvni serum osebe vsebuje protitelesa proti eritrocitom, se bo v vsakem primeru oblikoval "dežnik" - tako v reakciji s testnimi eritrociti kot s kontrolnimi eritrociti. V tem primeru je priporočljivo uporabiti druge medicinske tehnologije za identifikacijo specifičnih antitreponemskih protiteles.

Možen je fenomen prozona (nezmožnost reakcije zaradi presežka protiteles), ki ga lahko odpravimo z redčenjem seruma.

4. Upoštevanje rezultatov reakcije pasivne hemaglutinacije

Rezultati RPGA se upoštevajo vizualno po 60-120 minutah pri nastavitvi mikro metode in po 2-4 urah ali naslednji dan pri nastavitvi makro metode. Pri uporabi večjih (jedrnih) ptičjih eritrocitov dobimo jasnejšo sliko, rezultate pa zabeležimo prej.

Možno je določiti titer (visok titer RPHA ≥ 1:2 560).

Rezultati študije so ocenjeni s sistemom 4+ (od »–« do »++++«) glede na velikost nastalega filma. Ko pride do aglutinacije, se rdeče krvne celice nahajajo na površini luknje v obliki "dežnika", in če je rezultat negativen, rdeče krvne celice prosto zdrsnejo navzdol in se kopičijo na dnu v središču luknje v obliki "gumba".

Splošno sprejeta ocena rezultatov RPGA:

4+ - pozitiven RPHA. Aglutinirane rdeče krvne celice v obliki "dežnika" enakomerno poravnajo celotno površino luknje;

3+ - pozitiven RPHA. Rdeče krvne celice poravnajo celotno površino luknje, vendar nekatere od njih "zdrsnejo" v sredino. V tem primeru se na obodu usedline oblikuje opazen obroč;

2+ - šibko pozitiven RPGA. Rdeče krvne celice tvorijo film na majhnem območju spodnjega dela luknje, ki tvori gost obroč sedimenta rdečih krvnih celic z opazno čistino v sredini;

1+ - nedoločen RPHA, rdeče krvne celice tvorijo ohlapen sediment na dnu jamice z nejasnimi robovi in ​​rahlim lumnom v sredini;

(–) - negativna RPGA, vse rdeče krvne celice ležijo na dnu jamice v obliki kompaktne usedline (»gumbi« ali obroči) na čistem okoliškem ozadju (brez okoliške zrnate usedline).

V tuji praksi se rezultati RPGA ocenjujejo tudi kot reaktivni (v primeru tvorbe aglutinata), šibko reaktivni (če so tvorbe nepomembne) in nereaktivni (če ni opaziti aglutinacije).

Rezultate reakcije je mogoče samodejno zabeležiti s pomočjo posebnih analizatorjev. Vsi testni sistemi poleg kvalitativnih raziskav omogočajo kvantitativno analizo z določanjem titra.

5. V katerih obdobjih bolezni je bolje uporabljati RPHA?

RPHA postane pozitiven sredi primarnega obdobja (7-8 tednov od trenutka okužbe, 3-4 tedne po pojavu šankra) in ostane pozitiven še leta po zdravljenju.

Z zelo visoko vsebnostjo protiteles proti treponemi v testnem serumu (kar je najbolj značilno za sekundarni sifilis) je možen lažno negativen rezultat RPGA (tako imenovani "prozonski" pojav).

Specifična aglutininska protitelesa se odkrijejo v krvi ljudi, ki imajo dolgo časa sifilis, zato RPGA ni mogoče priporočiti za diferencialno diagnozo ponovne okužbe ali določanje resnosti infekcijskega procesa.

RPGA se ne uporablja za nadzor zdravljenja, ker lahko ostanejo pozitivni še mnogo let po okrevanju. Hkrati se lahko uporablja kot dodatna (k raku mehurja ali k RPR) metoda pri spremljanju učinkovitosti zdravljenja s preučevanjem dinamike zmanjševanja titrov protiteles. Predpogoj za to je uporaba istega testnega sistema RPGA kot pri prvem (pred zdravljenjem) pregledu pacienta ter testiranje v istem laboratoriju.

6. Občutljivost in specifičnost RPGA

RPGA velja za zelo občutljiv in specifičen test. Ta reakcija je dragocen diagnostični test za vse oblike sifilisa, še posebej občutljiva pa je pri poznih oblikah bolezni. Glede na stopnjo bolezni se občutljivost RPGA razlikuje. Pri primarnem sifilisu je občutljivost RPGA 76% (in več), pri sekundarnem sifilisu - do 100%. Za latentni zgodnji sifilis - 97%, za pozni sifilis - 94%, s specifičnostjo 98–100%. Nižjo občutljivost pri svežih oblikah bolezni pojasnjujemo s poznejšim nastankom aglutininov.

Po podatkih državne ustanove "TsNIKVI Roszdrav" je bila občutljivost RPGA pri diagnosticiranju različnih oblik sifilisa 99,4%. Večina raziskovalcev ugotavlja 98-99% specifičnost za RPHA.

Po občutljivosti in specifičnosti RPGA ni slabša, pri poznih oblikah in prirojenem sifilisu pa je celo boljša od RIF in RIBT.

7. Področje uporabe metode RPGA

RPGA se lahko uporablja kot presejalni in potrditveni test; se lahko uporablja v polkvantitativni različici z izračunom titra protiteles. Razvita je bila kvantitativna metoda za določanje stopnje RPHA, mikrometoda in avtomatizirana mikrohemaglutinacijska reakcija.

8. Lastnosti, prednosti in slabosti RPGA

Po literaturi je RPGA dosledno zavzemal vodilno mesto v klinični praksi v večini držav sveta. RPGA je najbolj razširjen test na klinikah za spolno prenosljive bolezni v tujini.

Tehnika RPGA je enostavna za izvedbo in ne zahteva posebne opreme: potrebujete le hemaglutinacijsko ploščo. Raziskava ne traja dolgo; reakcija je zelo občutljiva in specifična. Preizkušanje metode v klinični praksi je pokazalo, da je izjemno enostavna, poceni in občutljiva. Tako kot ELISA je tudi RPGA preprosta za izvedbo, ne zahteva visoko usposobljenega osebja in posebne opreme, možna pa je tudi njena avtomatizacija.

Prednosti testa RPGA:

• enostaven za postavitev in interpretacijo,
• ne zahteva posebne opreme,
• čas za pridobitev rezultatov – 45 minut,
• primeren za množično presejanje (potrebnih je le 25 µl seruma, razredčenega 1:20),
• visoka stopnja standardizacije,
• prisotnost notranjih kontrol,
• dolg rok trajanja,
• sprejemljiva cena
• možnost avtomatizacije računovodstva.

Opozoriti je treba tudi na slabosti RPGA:

• možnost nespecifičnih reakcij v prisotnosti protiteles proti eritrocitom,
• pomanjkanje korelacije med titrom in stopnjo sifilisa,
• kasnejša pozitivna reakcija v zgodnjih fazah sifilisa,
• možnost lažno pozitivnih reakcij pri osebah, ki so uživale alkohol, odvisnikih od drog,
• občutljivost na vibracije in temperaturo v laboratoriju.

Prednosti RPGA v primerjavi z RIBT in RIF so:

• uporaba industrijskih testnih sistemov,
• možnost avtomatizacije reakcije,
• ni potrebe po delu z živo Treponema pallidum,
• ni potrebe po vivariju.

9. Viri in vzroki napak pri izvajanju RPGA, lažno pozitivnih in lažno negativnih rezultatov

Pasivni hemaglutinacijski test je razmeroma enostaven test; pri izvajanju je potrebno upoštevati vsa priporočila proizvajalcev diagnostikumov in pravila dela v kliničnem diagnostičnem laboratoriju. Storjene napake lahko povzročijo pojav in registracijo lažno negativnih in lažno pozitivnih rezultatov reakcije. Lažno pozitivni rezultati RPGA so lahko posledica vpliva človeških in bioloških dejavnikov.

Lahko pride do lažno pozitivnih rezultatov

• pri preučevanju krvnih serumov bolnikov z ne-veneričnimi treponematozami,
• zaradi revmatoidnega faktorja
• zaradi navzkrižne reakcije protiteles s treponemskim antigenom, ki nastanejo ob različnih sistemskih ali z zdravili povzročenih presnovnih motnjah,
• zaradi nenormalnih ravni imunoglobulinov;
• pri novorojenčkih - zaradi tvorbe v telesu ploda ali otroka protiteles IgM proti IgG matere, kar otežuje razlago rezultatov in diagnozo prirojenega sifilisa.

Napake, ki nastanejo zaradi vpliva človeške udeležbe na študijo:

• kontaminirane mikroplošče
• nepravilno pipetiranje
• prisotnost vibracij v laboratoriju
• Temperatura zraka v laboratoriju je izven temperaturnega območja: 18–25 stopinj

Najpogostejše tehnične napake pri izvajanju RPGA, ki vodijo do nezanesljivih rezultatov, vključujejo:

• nepravilno redčenje sestavin,
• kršitev temperature,
• kršitev inkubacijskega časa reagentov,
• kršitev rokov za nanašanje reagentov na tableto,
• neskladje med pH raztopin in zahtevanimi,
• kontaminacija laboratorijske steklene posode.

Vir napak pri nastavitvi RPGA so lahko tudi naslednje tehnične težave:

• izključitev kontrolnih krvnih serumov iz reakcije;
• neenakomerna koncentracija rdečih krvničk v diagnostikumu zaradi nezadostnega mešanja pred uporabo;
• kršitev pogojev shranjevanja diagnostičnih in kontrolnih rdečih krvnih celic; uporaba potečenih kompletov;
• uporaba kontaminiranih epruvet, konic pipet, pipet, imunoloških ploščic, raztopin pri izvajanju reakcij;
• netočnosti pri začetni razredčitvi vzorca seruma;
• nezadostna skrb pri izvajanju serijskih dvojnih razredčitev;
• neupoštevanje temperaturnih pogojev in časa inkubacije;
• prisotnost tujih vibracij in tresenje imunološke tablete med inkubacijo;
• kršitev postopka za uprizoritev RPGA, izražena v zavrnitvi izvedbe študije s kontrolnimi eritrociti.

Uporaba krvne plazme, ki vsebuje antikoagulante, ki lahko povzročijo nespecifično aglutinacijo eritrocitov (RPGA), lahko povzroči rezultate, ki jih ni mogoče interpretirati.

Število lažno pozitivnih in lažno negativnih rezultatov je manjše kot pri drugih seroloških testih. LPR pri določanju RPHA so redki in so možni pri treponematozah (frambenija, bejel, pinta). Prav tako so bili zabeleženi lažno pozitivni rezultati (skupaj manj kot 1%) pri odvisnikih od drog, pri bolnikih infekcijska mononukleoza, borelioza, gobavost, kolagenoza, ciroza jeter, limfosarkom, pa tudi pri nosečnicah.

Lažno negativni rezultati testa so lahko posledica tekmovanja med protitelesi IgM in IgG. Lažno negativni rezultati so možni tudi pri bolnikih, okuženih s HIV.

10. Modifikacije metode RPGA

Obstajajo mikro in makro modifikacije nastavitve RPHA, prva se pogosteje uporablja zaradi učinkovitosti, hitrosti nastavitve in beleženja rezultatov.

Poleg tega je bil razvit avtomatski diagnostični kompleks za analizo slike, ki je omogočil kvantitativno avtomatsko oceno rezultatov in odpravo subjektivnosti pri interpretaciji dobljenih podatkov. Kompleks strojne in programske opreme prepozna sliko, obdela podatke in poda odgovor v relativnih enotah.

Za avtomatizacijo snemanja rezultatov RPGA se uporabljajo tudi čitalci in avtomatski analizatorji.

TPPA (Treponema pallidum particle agglutination) - reakcija aglutinacije umetnih delcev za odkrivanje protiteles proti Treponema pallidum

Kratek opis testa TPPA

Trenutno se za diagnosticiranje sifilisa uporablja tudi modifikacija metode pasivne hemaglutinacije - TPPA (aglutinacija delcev Treponema pallidum), pri kateri je antigen Treponema pallidum fiksiran na delce želatine. Ker umetni polimerni delci nimajo lastnih antigenov, ki določajo biološko aktivnost, se kompleti za serodiagnostiko sifilisa na njihovi osnovi lahko štejejo za naprednejše. Uporaba biološko inertnih umetnih delcev zmanjša nespecifično aglutinacijo, ki jo običajno opazimo pri drugih nosilcih.

TPPA se uporablja za serološko diagnostiko protiteles proti različnim vrstam in podvrstam patogenih treponem. Ta test se lahko uporablja za odkrivanje protiteles proti povzročiteljem sifilisa, pinte, bejela in frmbije.

Postopek raziskovanja je zelo preprost in ne zahteva posebne opreme - uporabljajo se standardne mikroplošče v obliki črke U. Test temelji na aglutinaciji delcev želatine, senzibiliziranih z antigeni T. pallidum, protitelesi, ki jih vsebuje pacientov krvni serum.

TPPA je potrditveni treponemski test, ki je uporaben tako za testiranje majhnih vzorcev kot za množično presejanje. TPPA se v tujini uporablja kot potrditveni test in nadomešča mikrohemaglutinacijski test MHA-TP (mikrohemaglutinacijski test za protitelesa proti T. pallidum).

Občutljivost TPPA testa je med 85 % in 100 %, specifičnost pa med 98 % in 100 %. Občutljivost TPPA za primarni sifilis- 88%, za sekundarni in pozni latentni sifilis 98% -100%.

Če se TPPA uporablja za diagnosticiranje sifilisa, lahko protitelesa proti drugim treponemom (kot so T. pallidum endemicum, pertenue ali carateum) povzročijo lažno pozitivne rezultate. Na voljo so številne metode za odstranitev teh protiteles iz vzorcev seruma pred testiranjem.

Princip TPPA testa

TPPA je metoda pasivne aglutinacije delcev želatine v človeškem serumu ali plazmi. Serum, ki vsebuje protitelesa proti patogeni treponemi, reagira z delci želatine, senzibiliziranimi z antigenom seva blede treponeme Nichols, izpostavljen ultrazvoku. Kot rezultat reakcije se v vdolbinici mikrotitrske plošče oblikuje gladek film aglutiniranih delcev želatine.

Če protiteles ni, se delci usedejo na dno jamice plošče in tvorijo kompakten "gumb" neaglutiniranih delcev. Kontrolne vdolbinice z nesenzibiliziranimi delci želatine morajo prav tako pokazati ta kompaktni "gumb" za vsak serum, tj. brez aglutinacije.

Uporaba testa TPPA

TRPA je univerzalni test, ki se lahko enako uspešno uporablja tako med obveznim preventivnim pregledom populacijskih skupin za sifilis (presejanje) kot v specializiranih dermatoveneroloških ustanovah. Prednost TPPA testa je njegova visoka občutljivost, ki ni slabša od klasičnih testov, ki so bili do nedavnega »zlati standard« za serodiagnostiko sifilisa. Druge prednosti testa so visoka ponovljivost, pa tudi enostavnost in hitrost nastavitve reakcije.

Test TPPA se uporablja za potrditev pozitivnih rezultatov presejalnih testov za netreponemski sifilis, kot je test VDRL, in za oceno bolnikov z negativnimi rezultati netreponemskega testa, vendar imajo znake ali simptome, ki kažejo na pozni sifilis. Uporaba TPPA kot edinega presejalnega testa za sifilis ni priporočljiva.

Poleg tega se lahko aglutinacijski test TPPA uporablja za pregled vzorcev cerebrospinalne tekočine pri diagnozi nevrosifilisa. V tem primeru, tako kot pri drugih seroloških testih, je treba interpretacijo rezultatov opraviti v obvezni kombinaciji z drugimi kazalci in simptomi bolezni.

Rezultati testa TPPA

Rezultat se ocenjuje po sistemu "plus" - od (–) do (2+). Rezultati testa so vidni s prostim očesom in se razlagajo na naslednji način:

Stopnja aglutinacije	Testni indikator	Tolmačenje
Aglutinirani delci dobro poravnajo dno plošče	2+	Pozitivno
Pomemben velik obroč z neravnimi zunanjimi robovi in ​​periferno aglutinacijo	1+	Pozitivno
Delci tvorijo kompakten obroč z režo v sredini in gladko gladko zunanje meje	±	Šibko pozitivno
Delci tvorijo kompakten obroč v središču luknje z rahlo vrzeljo v sredini in gladko zunanjo mejo	–	Negativno
Delci tvorijo "gumb" v središču luknje z gladko zunanjo mejo	–	Negativno

Rezultati se upoštevajo pri ugotavljanju skladnosti z zgornjim opisom. Vzorce, ki pokažejo nedoločen rezultat (±), je treba ponovno testirati. Če vzorec pokaže nedoločen rezultat pri več testih TPPA, se priporoča testiranje z drugimi metodami.

Rezultatov analize ne bi smeli obravnavati ločeno. Na primer, na v zgodnji fazi okužbe je število protiteles še premajhno, zaradi česar so TPPA in mnoge druge metode premalo občutljive. Zato je treba v primeru suma na sifilis, tudi če so rezultati testa negativni, vzorce ponovno testirati. Za postavitev diagnoze je treba upoštevati klinični simptomi, ki so na voljo bolniku, klinična anamneza in drugi podatki.

Tako kot pri reakciji RPHA lahko tudi pri TPPA pride do pojava prozona in lažno negativnega rezultata, če vzorec seruma vsebuje previsok titer protiteles.

ELISA - Encimski imunski test

Encimski imunosorbentni test (ELISA) je ena od mnogih seroloških diagnostičnih metod. nalezljive bolezni. Encimski imunski test (ELISA) v serodiagnostiki sifilisa je test za protitelesa razredov M, G in A (IgM, IgG, IgA) proti antigenom Treponema pallidum. Možno je opraviti ELISA s cerebrospinalno tekočino.

Uvedba v prakso encimskega imunskega testa (ELISA) namesto Wassermanove reakcije in drugih kardiolipinskih testov je bistveno izboljšala kakovost laboratorijske diagnostike sifilisa. Bistvena prednost te metode je možnost avtomatizacije raziskovalnega procesa, kar zmanjša vpliv človeškega faktorja.

1. Zgodovina metode ELISA

Osnovne principe encimskega imunskega testa na površini trdnofaznega nosilca je razvil E. Engvar s soavtorjem. (1971), B. Van Weeman in A. Schuurs (1971). Encimski imunski test, ki so ga razvili, sta leta 1975 prvič predlagala za diagnozo sifilisa J. Veldkamp in A. Visser, ki sta ocenila potencial tega avtomatskega testa. ELISA se je začela široko uporabljati pri diagnostiki sifilisa v osemdesetih letih prejšnjega stoletja, ko so bili razviti in certificirani diagnostični testi ter standardizirane metode testiranja. V ZSSR so metodo ELISA za diagnosticiranje sifilisa razvili V. N. Bednova, A. V. Babiy in A. V. Kotrovsky (1982, 1983).

2. Princip metode ELISA

Encimski imunski test (ELISA) je po reakcijskem mehanizmu podoben RIF (odkrijejo se enaka protitelesa). Reakcija encimskega imunskega testa je razvrščena kot imunološka reakcija, ki temelji na visoko specifični interakciji antigenov treponema pallidum s protitelesi bolnika s sifilisom.

V sifilidološki praksi se uporablja predvsem posredna različica ELISA. Načelo najpogosteje uporabljene posredne reakcije je naslednje. Na površini vdolbinic polistirenske tablete so fiksirani imunski kompleksi, ki nastanejo, ko protitelesa bolnika s sifilisom komunicirajo z antigeni Treponema pallidum. Nato jih zaznamo v barvni reakciji z uporabo specifičnih konjugatov in ustreznih substratno-kromogenih dodatkov.

Postopek izvajanja testa je sledeč: pacientov serum položimo na trdnofazni nosilec, na katerega je pritrjen antigen. Če so v njem protitelesa, se na površini nosilca tvori kompleks antigen-protitelo. Za »manifestacijo« rezultatov reakcije se uporabljajo protitelesa proti humanemu Ig, konjugirana z encimskimi markerji. Kdaj pozitivna reakcija encim, vezan na kompleks antigen-protitelo, razgradi substrat, dodan sistemu, kar povzroči razvoj barvnega obarvanja z različno intenzivnostjo.

V reakciji se določitev kompleksa AG in AT, sorbiranega na trdni fazi, izvede z uporabo antiglobulinskih protiteles, označenih z encimom, na podlagi barvne reakcije encima s substratom.

V reakciji določimo kompleks antigenov in protiteles, sorbiranih na trdni fazi, z uporabo antiglobulinskih protiteles, označenih z encimom.

ELISA omogoča odkrivanje serumskih Ig različnih razredov. Na trgu obstajajo sistemi, ki omogočajo ločeno določanje IgM in IgG ter skupnih protiteles.

Specifični antigeni, ki se uporabljajo za ELISA, so lahko različnega izvora:

ultra-glas- pridobljeni so z uničenjem bakterijske celice T. pallidum z ultrazvokom ali drugo metodo;

rekombinantni- pridobljeni so s tehnologijami genskega inženiringa z vnosom v genom bakterijske celice (na primer E. Coli) gena, ki je odgovoren za sintezo specifičnega antigena T. pallidum, čemur sledi povečanje bakterijske mase proizvajalca mikroorganizem, uničenje teh celic, izolacija in čiščenje antigena;

peptid- pridobljen kot rezultat zaporedne kemične sinteze antigenskih epitopov proteinov T. pallidum.

Telo je sposobno tvoriti protitelesa proti skoraj vsem delom molekule antigena. Pri normalnem imunskem odzivu se to običajno ne zgodi. Eden ali več imunogenih peptidov, izoliranih iz proteinskega antigena, ima posebno antigenost in večina protiteles se tvori specifično zanje. Nanje se razvije najbolj intenziven imunski odziv. Najbolj informativen ELISA je pokazal imunodominantne regije proteinov Treponema pallidum z molekulsko maso 15 kDa, 17 kDa in 47 kDa. Kot antigen smo uporabili izvleček detergenta ali sonikat patogenih treponem seva Nichols.

3. Metoda izvajanja raziskav z uporabo metode

Načelo metode je odkrivanje specifičnega kompleksa antigen-protitelo, sorbiranega na trdni fazi (površina vdolbinic plastične plošče) z antiglobulinskimi protitelesi, označenimi z encimom (peroksidazo), z uporabo barvne reakcije s substratom, vzetim v kvantitativno spektrofotometrično.

Antigeni, ki se uporabljajo za senzibilizacijo vdolbinic polistirenske plošče, so lahko:

• lizat- pridobljen kot posledica uničenja Treponema pallidum z ultrazvokom;
• peptid- pridobljen kot rezultat kemične sinteze proteinskih fragmentov Treponema pallidum in ima antigensko reaktivnost, podobno prvotnim proteinom patogena;
• rekombinantni- pridobljeno z uporabo metod genski inženiring, ki nosi antigenske determinante, identične Treponemi pallidum.

V sifilidološki praksi se običajno uporablja posredna različica ELISA.

4. Računovodstvo rezultatov

Pri ELISA za vizualizacijo reakcije antigen-protitelo encim (alkalna fosfataza ali hrenova peroksidaza) reagira s substratom, ki spremeni barvo. Intenzivnost barve določa pozitivnost reakcije (od “–” do “++++”). Rezultate ELISA lahko ocenimo vizualno s 4-točkovnim sistemom ali instrumentalno v obliki digitalnih indikatorjev optične gostote, pridobljenih na posebnih čitalnikih (kot je Multiscan) pri valovni dolžini 492 nm. Ker Rezultati so ocenjeni spektrofotometrično, kar odpravlja subjektivno interpretacijo.

5. V katerih obdobjih bolezni je bolje uporabiti

Čas za ELISA pozitivnost je od 4. tedna po okužbi. Rezultati ELISA (kot tudi RIF) postanejo pozitivni v prvih dneh primarnega obdobja ali ob koncu inkubacije in ostanejo pozitivni v vseh obdobjih. ELISA je še posebej dragocena pri zgodnji diagnozi sifilisa - pozitivne rezultate za odkrivanje protiteles je mogoče dobiti že ob koncu inkubacijske dobe bolezni (to je 4-6 tednov po okužbi).

6. Občutljivost in specifičnost

ELISA je zelo občutljiv in specifičen test, kar je njegova prednost. ELISA je blizu RIF glede mehanizma reakcije, občutljivosti in specifičnosti, ker V obeh reakcijah sodelujejo ista protitelesa. Večina raziskovalcev ugotavlja visoko specifičnost in občutljivost na vseh stopnjah bolezni. Občutljivost različnih variant ELISA po G. A. Dmitrievu doseže 98–100%, specifičnost pa 96–100%. Po TsNIKVI je občutljivost ELISA za sifilis 99,1% (odredba št. 87 M3 Ruske federacije).

Možnost trdne faze ELISA (encimski imunosorbentni test, ELISA) je ena najbolj občutljivih serološke reakcije, kar omogoča odkrivanje 0,0005 μg/ml protiteles in 0,000005 μg/ml antigenov.

7. Obseg metode

Metodo priporočamo pri pregledu nosečnic, kontaktnih oseb, darovalcev in predstavnikov rizičnih skupin. ELISA se lahko uporablja kot presejalni in potrditveni test. V razmeroma kratkem času svoje zgodovine se je ELISA razvila iz indikativnega testa v potrditvenega. Pri diagnozi sifilisa se test uporablja tudi kot potrditveni test za vzorce, ki kažejo pozitivne rezultate z uporabo različnih netreponemskih testov in RPGA.

Metoda ELISA se lahko uporablja v kvantitativni različici z izračunom indeksa pozitivnosti ali reaktivnosti, ki vam omogoča, da ocenite raven protiteles v vzorcu.

Trenutno v Rusiji uporabo encimskega imunskega testa za diagnozo sifilisa ureja Odredba Ministrstva za zdravje Ruske federacije št. 87 z dne 26. marca 2001 "O izboljšanju serološke diagnoze sifilisa" (Dodatek št. 1 " Presejalni testi in diagnostični testi za sifilis). Odredba načrtuje zamenjavo RSC v kompleksu seroreakcij (SRC) z ELISA in RPGA.

8. Viri in vzroki napak med proizvodnjo, lažno pozitivnih in lažno negativnih rezultatov

Encimski imunski test je zapletena večstopenjska študija, pri kateri je treba dosledno upoštevati vsa priporočila proizvajalcev diagnostičnih kompletov, pravila za prilagajanje in konfiguracijo opreme, uporabljene v študiji.

Vir napak pri izvajanju ELISA so lahko naslednje točke:

Študija reakcije hiperlipidemičnega, hemoliziranega krvnega seruma ali vzorcev z znaki bakterijske rasti;

Ne izvajajte zamrznitve vzorca biološkega materiala dvakrat ali večkrat; po potrebi ponovite študijo, uporabite serum iz podvojene epruvete;

Kršitev pogojev shranjevanja imunosorbenta in raztopine za pranje; uporaba pretečenih testnih kompletov;

Uporaba reakcijskih komponent iz drugih diagnostičnih kompletov;

Kršitev časa reakcijskih stopenj;

Sušenje vdolbinic imunološke plošče na stopnjah reakcije;

Ponovna uporaba plastičnih posodic (plastičnih pladnjev) za pripravo mešanice kromogena in substrata;

Neupoštevanje pogostosti meroslovne kontrole parametrov delovanja uporabljenih naprav (pralnik in spektrofotometer);

Uporaba kontaminirane laboratorijske steklene posode pri pripravi reakcij: bučke, merilni valji, epruvete, pipete, pipetne konice;

Nezadostna temeljitost pri izvajanju razredčitev vzorcev biološkega materiala;

Napake pri vnosu vzorca biološkega materiala v ustrezno vdolbino plošče;

Napake pri prenosu rezultatov študije v dnevnik registracije, protokol študije ali obrazec za odgovore.

Skrbno izvajanje priporočil navodil za uporabo diagnostičnih testnih kompletov, redno preverjanje točnosti pipetnih dozirnikov in avtomatskih naprav ter uporaba notranjih pozitivnih in negativnih kontrol omogočajo pridobivanje rezultatov ELISA testa z visoko ponovljivostjo.

9. Lastnosti, prednosti in slabosti

ELISA je sodobna, obetavna metoda za serodiagnostiko sifilisa zaradi svoje enostavnosti, ponovljivosti in dostopnosti. Določanje protiteles z ELISA je idealna diagnostična metoda, primerna za hkratno preiskavo večjega števila vzorcev. Zaradi svojih prednosti je pridobil popularnost v vseh državah.

Raziskovalna tehnologija ELISA zahteva skladnost z vsemi priporočili proizvajalcev komercialnih diagnostičnih testnih kompletov in temeljitost raziskovalnega postopka. Za izvedbo raziskav v ELISA je potrebno kupiti dodatno posebno opremo. Uprizoritvena tehnika zahteva več kot dolgo časa v primerjavi z RMP, RPR in RPGA.

Prisotnost avtomatizacije več stopenj ali celotnega procesa kot celote vam omogoča hkratno preučevanje velikega števila vzorcev biološkega materiala z visoko stopnjo standardizacije študije, kar zmanjšuje subjektivni element pri ocenjevanju rezultatov in zmožnost shranjevanja fiksnih študijskih protokolov, kar vam omogoča arhiviranje študijskih podatkov in ponovni dostop do njih za retrospektivno analizo.

Prednosti:

• Omogoča diferencirano in skupno določanje IgM in protitelesa IgG na povzročitelja sifilisa.
• visoka občutljivost in specifičnost, ki se približuje 100 %
• ponovljivost
• zmožnosti avtomatizacije

Prednosti ELISA vključujejo visoko specifičnost (96-100%) in občutljivost (98-100%), ki jo ugotavlja večina raziskovalcev.

Prisotnost avtomatizacije več stopenj ali celotnega procesa kot celote vam omogoča hkratno preučevanje toka z velikim številom vzorcev biološkega materiala z visoko stopnjo standardizacije študije, kar zmanjšuje subjektivni element pri ocenjevanju rezultatov. , možnost shranjevanja fiksnih raziskovalnih protokolov, kar vam omogoča arhiviranje raziskovalnih podatkov in ponovni dostop do njih za retrospektivno analizo.

Bistvene slabosti ročnih metod, vključno z določanjem protiteles proti antigenom T. pallidum z ELISA testom, so:

~ morebitne kadrovske napake med raziskavo (spogled, malomarnost, kršitev tehnologije);

~ nezmožnost popolne standardizacije raziskovalnega procesa z ročno različico ELISA;

~ povečano tveganje okužbe osebja.

10. Spremembe metode

Poleg klasične indirektne ELISA metoda past ELISA. Leta 1989 so ga predlagali O. E. Ijsselmudien et al. za odkrivanje protiteles IgM proti antigenom Tr. pallidum. Metoda ima visoko specifičnost in občutljivost.

Prečiščena protitelesa proti človeškim imunoglobulinom razreda M se sorbirajo na površini vdolbinic plošče in po inkubaciji testnega seruma se vsi IgM vežejo na nosilec. Prisotnost antigen-specifičnega Tr. med povezanimi IgM. pallidum odkrijemo s Tr. pallidum, konjugiran z encimom.

Ta metoda vam omogoča odkrivanje protiteles ne le razreda IgM, temveč tudi razredov IgG in IgA. Da bi to naredili, se vdolbinice plošč senzibilizirajo z afinitetno prečiščenimi protitelesi določenega razreda proti človeškim imunoglobulinom. V tem primeru se protitelesa tega razreda ujamejo iz seruma in odkrivanje treponemskih specifičnih protiteles izvedemo tako, da jih kombiniramo s konjugatom, ki predstavlja povezavo treponemskega antigena z encimom.

Uporaba različice vabe encimskega imunskega testa zmanjša tveganje za lažno pozitivne reakcije, revmatoidni faktor kri, navzkrižne reakcije med imunoglobulini razredov M in G. Pri pregledu novorojenčkov so v tem primeru izključeni tudi lažno pozitivni rezultati testov, povezani z odkrivanjem IgM, usmerjenega proti materinemu antitreponemskemu IgG.

Testi ELISA so v tujini kot možnosti našli široko uporabo. encimski imunski test (EIA) in sistem ICE sifilis. Pri slednjem se v celicah plošče sorbira mešanica protiteles proti IgM in IgG ter trije rekombinantni proteini T. pallidum. Pozitivni rezultati se testirajo v istem testnem sistemu v dvojniku, da se dobi končni rezultat.

V Rusiji so razvili številne testne sisteme za serodiagnozo sifilisa z uporabo metode ELISA z domačimi reagenti. Ti sistemi imajo visoko specifičnost in občutljivost.

Poleg naštetega obstajajo tudi druge možnosti ELISA, vključno s tistimi, ki omogočajo neposredno detekcijo povzročitelja v krvi (direktna ELISA), dot-ELISA z reakcijo na nitrocelulozne trakove, ELISA s kapilarno krvjo, pa tudi imunobloting, ali Western Blot, s hkratnim odkrivanjem AT na različne sestavine patogena.

Sodobna izboljšana modifikacija ELISA je imunobloting.

ICA (imunokemiluminiscenčni test), ICL (imunokemiluminiscenčni)

Z razvojem laboratorijske diagnostike v okviru modernizacije zdravstvenega varstva v Ruski federaciji je v prakso laboratorijev vstopila avtomatizacija laboratorijskih raziskav, kar omogoča standardizacijo analitičnih faz raziskav. To pomaga izboljšati kakovost diagnoze. Z uvedbo avtomatizacije so se začele uporabljati nove visokotehnološke metode z visoko občutljivostjo in specifičnostjo, kot je kemiluminescenčni imunski test (CLIA)

Kemiluminiscenca je proces oddajanja fotonov med prehodom elektronsko vzbujenih oksidativnih produktov kemične reakcije v prvotno energijsko stanje. Med reakcijo kemiluminiscence se sprosti znatna količina energije, kvantni izkoristek oddane svetlobe pa je precej visok. Od vseh neizotopskih metod zagotavlja kemiluminiscenca najvišjo občutljivost. Pri imunometričnih metodah je občutljivost kemiluminiscence večja od občutljivosti radioimunskega testa.

Metoda imunokemiluminiscence (ICL) je trenutno našla svojo uporabo pri diagnostiki tumorskih markerjev, avtoimunske bolezni sladkorna bolezen, srčni markerji, hormoni ( Ščitnica, nadledvične žleze, ženski in moški spolni hormoni), torch okužbe, virusni hepatitis, virusi skupine herpes.

Na podlagi metode imunokemiluminiscence so bili razviti številni visoko občutljivi in ​​specifični (98-100%) testni sistemi za diagnostiko sifilisa, ki se uporabljajo predvsem v tujini.

Metoda kot antigene uporablja rekombinantne lipoproteine, pridobljene z metodami genskega inženiringa, ki so popolni analogi antigeni T. pallidum.

Metoda ICA na podlagi rezultatov klinično preskušanje je bil priznan in se priporoča za uporabo pri laboratorijski diagnostiki sifilisa v Ruski federaciji kot presejalni in potrditveni test, če je v laboratorijih na voljo ustrezna oprema. Leta 2012 je bil ICA kot presejalni in potrditveni test za diagnozo sifilisa vključen v Klinične smernice za obravnavo bolnikov s spolno prenosljivimi okužbami in urogenitalnimi okužbami.

Tako uporaba visokotehnološkega ICA, ki je z uvedbo avtomatizacije postala del prakse tako svetovne kot domače laboratorijske diagnostike, zagotavlja naslednje prednosti:

• odprava vpliva subjektivnih dejavnikov na analitični stopnji študije
• varnost osebja pri izvajanju raziskav na potencialno okuženem biološkem materialu
• povečanje hitrosti, s katero bolnik prejme rezultate
• standardizacija študija in nadzor kakovosti študija
• zagotavljanje zanesljivih in zanesljivih rezultatov bolnikom
• visoka kakovost kliničnih laboratorijskih raziskav.

Po občutljivosti je metoda ICA primerljiva z radioimunsko metodo, po enostavnosti izvedbe, varnosti za osebje in številnih drugih parametrih pa jo prekaša.

Metoda ICA, ki ima visoko občutljivost in specifičnost (98–100%), omogoča kvantitativno določanje ravni protiteles proti povzročitelju sifilisa in se lahko uporablja za potrditev sifilične okužbe in presejanje. Omejitve uporabe: ni mogoče uporabiti za spremljanje učinkovitosti terapije, lahko daje lažno pozitiven rezultat.

Imunokromatografija (ICH).

Metode za odkrivanje protiteles, specifičnih za treponeme, ki temeljijo na metodah imunokromatografije (ICH), so relativno nove za uporabo v Ruski federaciji. Tako kot pri ICA metodi se kot antigeni uporabljajo rekombinantni lipoproteini, pridobljeni z metodami genskega inženiringa (na primer: antigeni Tp15, Tp17, Tp47) in biosintetični peptid TmpA. Našteti antigeni se v različnih kombinacijah uporabljajo tudi kot del imunosorbentov pri ELISA in imunoblotingu.

Metoda ICG vam omogoča hitro določanje vsebnosti treponeme specifičnih protiteles proti povzročitelju sifilisa v vzorcih seruma in polne krvi brez uporabe posebne laboratorijske opreme in se uporablja pri zagotavljanju primarne zdravstvene oskrbe, tudi za epidemiološke indikacije.

Omejitve uporabe: ni mogoče uporabiti za spremljanje učinkovitosti terapije, lahko daje lažno pozitiven rezultat.

PBT (preprosti hitri testi ob postelji)

Relativno nedavno se je v serodiagnostiki sifilisa začela razvijati tako imenovana preprosta hitra preiskava (SRT) ali testi ob postelji (Point-of-care - POC). Enostavno hitri testi ob bolnikovi postelji ali pa imunokromatografske preiskave omogočajo hitro določanje vsebnosti treponem specifičnih protiteles proti povzročitelju sifilisa v vzorcih seruma in polne krvi brez uporabe posebne laboratorijske opreme in se lahko uporabljajo pri izvajanju osnovnega zdravstvenega varstva. , tudi za epidemiološke indikacije. Omejitve uporabe: ni mogoče uporabiti za spremljanje učinkovitosti terapije, lahko daje lažno pozitiven rezultat.

Ti testi temeljijo na imunokromatografskem določanju protiteles proti treponemskim antigenom Treponema pallidum in se izvajajo na trakovih; v tem primeru lahko uporabimo tako polno kri kot serum (Herring A., Ballard R. et al, 2006). Format testa omogoča izvajanje raziskav brez posebne opreme in brez uporabe električne energije. Zaradi relativno nizke občutljivosti in specifičnosti pa se ti testi v praksi še ne uporabljajo veliko.

Imunobloting (Western Blot)

V zadnjih letih so se pojavile raziskovalne metode, namenjene odkrivanju in analizi vsebnosti protiteles vsakemu antigenu Treponema pallidum ločeno. Ena od teh metod je metoda imunoblotinga (ali blotting, immunoblotting, Western blot), ki se uporablja za določanje protiteles IgG ali IgM proti Treponemi pallidum. Metoda imunoblotinga je modifikacija encimskega imunskega testa - različica ELISA.

Imunobloting je eden izmed najbolj sodobne metode serodiagnostiko sifilisa in se aktivno uporablja v tujini. Ime (»Western blotting«) je dobil kot šaljiv odgovor na imena tehnik za določanje DNK (»Southern blotting«) in RNK (»Northern blotting«).

1. Zgodovina metode

Imunobloting (Western blot) uporabljamo za določanje protiteles IgG ali IgM proti antigenom treponeme pallidum (Herremans M. et al., 2007).

2. Klasični imunoblot

Klasični imunoblot(Western Blot analiza) združuje encimski imunski test in uporabo elektroforetske metode. Antigenski proteini povzročitelja sifilisa se predhodno ločijo z elektroforezo in prenesejo na nosilec - nitrocelulozno membrano (trak). Ta prenos se imenuje blotting. Nato ta nosilec z ločenimi pikami (bloti) obdelamo s testnim serumom in protitelesi proti IgG ali IgM, označena z encimi ali radioaktivnimi snovmi. Metoda vključuje uporabo naravnih ali rekombinantnih proteinov treponeme.

elektroforeza je ločevanje nabitih spojin na podlagi njihove mobilnosti v elektroforetskem polju. Ko se v mediju uporabi potencialna razlika, se pozitivno nabite molekule premaknejo proti negativno nabiti elektrodi, negativno nabite molekule pa proti pozitivni elektrodi.

Večina globularnih proteinov je sestavljenih tako, da se večina nabitih skupin, in sicer hidrofilnih, nahaja na površini proteina, medtem ko so nenabiti, hidrofobni ostanki vgrajeni v notranjost globule. V električnem polju proteini migrirajo glede na svoj naboj proti nasprotno nabiti elektrodi.

Elektroforetsko ločevanje proteinov poteka v sintetičnem gelnem mediju na osnovi poliakrilamida. Za ločevanje beljakovin glede na njihovo molekulsko maso se beljakovinska zmes pred elektroforezo predhodno inkubira v prisotnosti natrijevega dodecil sulfata (SDS).

Podrobne študije tujih znanstvenikov Weber in Osborn (1969) so pokazale, da je po taki obdelavi edini dejavnik, ki lahko vpliva na mobilnost proteinov v poliakrilamidnem gelu (PAGE), velikost proteina oziroma njegova molekulska masa. To je omogočilo uporabo metode elektroforeze PAGE v prisotnosti SDS za dokaj natančno določanje molekulske mase proteinov in peptidov. V tuji literaturi so to metodo poimenovali SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis).

Profil reaktivnosti v klasičnem WB testu z naravnimi antigeni (metoda elektroforeze v poliakrilamidnem gelu z natrijevim dodecil sulfatom). (1) - kontrola pozitiven rezultat, (2) - kontrola negativen rezultat, (3-6) - klinični vzorci.

Pri testiranju na sifilis s to metodo se Treponema pallidum, predhodno prečiščena in razdrobljena na sestavne dele, podvrže elektroforezi v poliakrilamidnem ali agaroznem gelu. V tem primeru so antigeni, vključeni v njegovo sestavo, ločeni po molekulski masi.

Nato se z uporabo navpične elektroforeze antigeni prenesejo na trak nitroceluloze, ki sedaj vsebuje spekter očesu nevidnih antigenskih trakov, značilnih za Treponema pallidum.

Pri izvajanju analize se testni material (serum, bolnikova krvna plazma itd.) Nanese na nitrocelulozni trak (trak). Če so v vzorcu specifična protitelesa, se med procesom inkubacije močno vežejo na strogo ustrezne (komplementarne) antigenske pasove in tvorijo kompleks "antigen-protitelo".

Po odstranitvi nevezanih imunoglobulinov med pranjem lističa sledi inkubacija s konjugatom - z encimi označenimi protitelesi proti človeškim imunoglobulinom (protitelesa proti človeškim IgG ali IgM), med katero se z encimi označena protitelesa pritrdijo na obstoječe komplekse antigen-protitelo na površini membrana.

Po odstranitvi nevezanega konjugata med inkubacijo s substratno raztopino encim interagira s substratom, kar povzroči razvoj barvne reakcije - obarvanje območij membrane (v obliki trakov), kjer se nahajajo posamezni antigeni treponeme pallidum, protitelesa proti katerim so bili v testnem serumu. Intenzivnost obarvanja je odvisna od količine vezanih protiteles iz seruma. Rezultat reakcije se oceni vizualno.

Prisotnost trakov na določenih območjih nitrocelulozne plošče potrjuje prisotnost protiteles proti strogo določenim antigenom Treponema pallidum v testiranem serumu.

Imunodeterminante 15, 5, 17, 44,5, 47 kD, določene s to metodo, imajo diagnostični pomen za sifilis. Ig G imunobloting je po občutljivosti in specifičnosti podoben RIF z absorpcijo (RIF abs). Ig M imunobloting lahko služi kot diagnostični test za prirojeni sifilis.

3. Imunoblot v obliki linearnega imunskega testa

Linijski imunski test (LIA) omogoča sočasno določanje protiteles proti antigenom Treponema pallidum v človeškem serumu ali plazmi. Antigeni so predhodno naneseni na testne lističe, ki so dobavljeni kot del komercialnih diagnostičnih kompletov.

Trakovi so izdelani iz nitrocelulozne membrane, poliamida s plastično podlago ali najlonske membrane s plastično podlago. Med proizvodnjo se na testni listič namesti več diskretnih antigenov v obliki ločenih antigenskih linij. Poleg teh sifilisnih antigenov se na vsak trak nanesejo še štiri kontrolne črte: streptavidin in kontrolni vzorci (3 +, 1 + in ± črta reza).

Trakovi uporabljajo umetne antigene, pridobljene z metodami genskega inženiringa - rekombinantne beljakovine ali sintetične polipeptidne konstrukte. To so analogi površinskih antigenov Treponema pallidum - TpN15, TpN17, TpN47 in TmpA z molekulskimi masami 15, 17, 47 kDa in 44,5 (TmpA), kjer je kDa = kiloDalton. Z njihovo pomočjo se določijo serumska protitelesa proti različnim imunodominantnim komponentam patogena.

Testni vzorec inkubiramo v kiveti, kamor namestimo tudi indikatorski trak. Protitelesa proti T. pallidum se določijo z vezavo na antigene, nanesene na testne lističe. Če so v vzorcu prisotna za T. pallidum specifična protitelesa, tvorijo vezi z različnimi antigenskimi linijami. Ko protitelesa v testnem serumu medsebojno delujejo z diskretnimi antigeni T. pallidum, nameščenimi na testnem traku, nastane kompleks antigen-protitelo v obliki vizualno zaznavnih barvnih trakov.

Ob upoštevanju rezultatov imunoblotinga ocenimo reaktivnost seruma za vsakega od antigenov posebej. Popolnoma pozitiven odgovor je izdan, ko je rezultat pridobljen hkrati z dvema ali tremi predstavljenimi antigeni.

Raziskovalni postopki se izvajajo ročno ali na posebnem analizatorju z interpretacijo rezultatov s pomočjo specializiranega računalniškega programa za nalezljive bolezni.

Zaradi visoke stopnje čiščenja rekombinantnih antigenov in hkratnega odkrivanja protiteles proti najbolj imunogenim determinantam povzročitelja sifilisa ima metoda visoko občutljivost in specifičnost.

4. Računovodstvo rezultatov

Za odčitavanje intenzivnosti obarvanja antigenskih trakov na trakovih so razvili fotometre, katerih delovanje temelji na odboju signala, kar izključuje subjektivna ocena in nudi možnost avtomatizacije.

5. V katerih obdobjih bolezni je bolje uporabiti

Testi z imunoblotingom lahko odkrijejo specifična protitelesa proti antigenom Treponema pallidum v zelo zgodnji fazi bolezni. Najpomembnejša protitelesa pri diagnozi sifilisa so protitelesa proti antigenom Treponema pallidum TpN15, TpN17, TmpA in TpN47. Ti antigeni so membranski proteini z molekulsko maso 15, 17, 44,5 oziroma 47 kDa.

Ko Treponema pallidum vnesemo v človeško telo, se antisifilitična protitelesa pojavijo v tem vrstnem redu: najprej se razvije imunski odziv na antigene TpN17, nato na TpN47, za TpN15 in kasneje na vse TmpA. Ob upoštevanju rezultatov testov se reaktivnost seruma na vsakega od njih oceni posebej. Na primer, ko linearni blot pokaže reaktivnost samo na antigenski liniji TpN17 in TpN47, to pomeni, da je bolezen v zgodnji fazi. Bolj ko antigenske linije postanejo reaktivne, bolj napreduje okužba. Pri zdravljenju sifilisa se vzorec reaktivnosti v tem testu spremeni.

Določanje IgM na beljakovine z molekulsko maso 15,17, 41, 47 kDa omogoča identifikacijo 29,2% bolnikov s sekundarnim sifilisom, 12,5% z zgodnjim latentnim sifilisom in 8,0% s serorezistenco. Za iskanje IgG na iste molekule je značilna občutljivost 61,6 % za serorezistenco in 100 % za sekundarni in zgodnji latentni sifilis.

6. Občutljivost in specifičnost

Glede na literaturo sta občutljivost in specifičnost testa zelo visoki - 99,6-100 oziroma 99,3-99,5%. Pri klasični metodi to dosežemo z elektroforetično ločitvijo proteinov, gliko- in lipoproteinov ter največjo specifičnostjo detekcije imunskih serumov ali monoklonskih protiteles. Pod optimalnimi pogoji lahko imunobloting zazna antigen v količinah, manjših od 1 ng v volumnu testa.

Tudi občutljivost linearnega blota je 99,6 %, specifičnost pa se giblje med 99,3 % in 99,5 %.

Po mnenju strokovnjakov je imunobloting z rekombinantnimi visoko specifičnimi antigeni po občutljivosti in specifičnosti podoben RIF-abs.

Po podatkih iz tuje literature in rezultatih študije na TsNIKVI ima metoda imunoblotinga visoko občutljivost (98,8-100%) in specifičnost (97,1-100%) za diagnosticiranje sifilisa.

7. Obseg metode

Imunobloting (imunoblot) je zelo specifična in zelo občutljiva referenčna metoda. Visoka občutljivost in specifičnost omogočata, da se ta metoda šteje za potrditveni test za sifilis. Metoda se lahko uporablja za potrditev diagnoze, pa tudi v primerih, ko drugi treponemski testi dajejo dvomljive in nasprotujoče si rezultate. Z uporabo imunoblotinga lahko potrdite diagnozo pri bolnikih s pozitivnimi ali nedoločenimi rezultati testa, vključno s tistimi, pridobljenimi z RPGA ali ELISA.

8. Viri in vzroki napak med proizvodnjo, lažno pozitivnih in lažno negativnih rezultatov

Lažno pozitivni rezultati so zelo redki. Lažno negativni rezultati so prav tako precej redki in jih opazimo pri bolnikih z imunsko pomanjkljivostjo - pogosteje pri okuženih s HIV in z učinkom diagnostičnega "okna" zaradi zamude pri sintezi protiteles, pa tudi v primeru napak v fazi diagnoze.

Uporaba sodobnih testnih sistemov narekuje strogo upoštevanje vseh zahtev tako za material kot za izvedbo reakcije. V bistvu je vir napak kršitev reda in tehnologije študije (zlasti za klasični Western blot) ter neupoštevanje priporočil proizvajalcev testnih kompletov. . Napake se lahko pojavijo tudi med zbiranjem, dostavo, shranjevanjem vzorcev seruma in med testiranjem. Poleg poškodovanih vzorcev med drugim možni razlogi- uporaba pretečenih testnih kompletov, pa tudi napake pri analizi rezultatov študije.

9. Lastnosti, prednosti in slabosti

Edinstvenost imunoblota je v visoki informativnosti in zanesljivosti rezultatov.

Test ne zahteva visoko prečiščenih antigenov, referenčnih ali kontrolnih serumov. Identifikacija tarče protitelesa temelji na molekulski masi proteina, s katerim reagirajo protitelesa iz bolnikovega seruma. V eni sami reakciji je mogoče zaznati vezavo protiteles na več antigenov, od katerih je mogoče vsakega natančno opredeliti. Zaradi tega ima imunobloting številne prednosti pred drugimi metodami za dokazovanje protiteles, katerih rezultati so odvisni od standardizacije, občutljivosti, kakovosti substrata, nestabilnosti ali netopnosti določenih antigenov.

Metoda je lahko ponovljiva, razmeroma enostavna za izvedbo in interpretacijo rezultatov, omogoča določanje spektra protiteles proti več antigenom T. pallidum hkrati in ovrednotenje prispevka k splošna reakcija protitelesa različne specifičnosti.

Uporaba visoko prečiščenih rekombinantnih in peptidnih antigenov zmanjša nespecifično serumsko reaktivnost. Z uporabo metode se je mogoče izogniti delovno intenzivnim in subjektivnim metodam, ki predstavljajo nevarnost za raziskovalca (inokulacija sevov G. pallidum, delo s patogeno T. pallidum pri postavljanju reakcije). To določa prednost metode imunoblotinga pred drugimi treponemskimi testi (RIF in še posebej RIBT) za diagnosticiranje sifilisa.

10. Spremembe metode

Obstaja več komercialnih testnih sistemov, ki temeljijo na tej metodi. Nekatere so narejene v formatu Western blot, so sestavljeni iz trakov, na katere so prenesene beljakovinske komponente T. pallidum, ki so bile predhodno ločene z elektroforezo v poliakrilamidnem gelu.

Drugi so v formatu linearni madež, so sestavljeni iz trakov, na katerih so v obliki diskretnih linij sorbirani rekombinantni in sintetični polipeptidi - analogi površinskih antigenov T. pallidum, TpN15, TpN17, TpN47 in TmpA.

Rezultate Western blota je težje interpretirati, ker trakovi odkrijejo veliko različnih protiteles, od katerih so mnoga skupinsko specifična. Nasprotno pa je razlaga rezultatov črtnega blota enostavna; Poleg tega dodatne kontrolne črte, nanesene na trak, omogočajo polkvantitativno oceno ravni protiteles proti štirim antigenom T. pallidum.

xMAP tehnologija

xMAP - sodobna tehnologija, ki omogoča večparametrične študije s hkratnim odkrivanjem več analitov v enem biološkem vzorcu. Kot trdna faza se uporabljajo barvne mikrosfere, prevlečene z reagenti za zajemanje (oligonukleotidi, protitelesa, antigeni).

Preskusni vzorec se doda raztopini, ki vsebuje mikrokroglice. Analiti, odkriti v vzorcu, se vežejo na ustrezno mikrosfero, nato pa se raztopini doda detekcijsko sredstvo (detekcijska protitelesa, fluorescenčna oznaka). Za detekcijo določanega analita se uporablja sistem dveh laserjev, ki omogoča tako kvalitativno oceno prisotnosti analita v vzorcu (za to se uporablja rdeči laser, ki razvršča mikrosfere po barvah) kot kvantitativno oceno prisotnosti analita v vzorcu. ocena vsebnosti analita v vzorcu (za to se uporablja zeleni laser).

Študija se izvaja samodejno na analizatorjih, kot so Bio-Plex 200 (bio-rad), Bio-Plex2200 (bio-rad), Luminex100 (luminex), Luminex200 (luminex), opremljenih s programsko opremo.

Produktivnost tehnologije xMAP bistveno presega produktivnost klasičnega encimsko-imunskega testa (ELISA) z bistveno manjšim volumnom biomateriala.

Tehnologija xMAP, ki ima visoko analitično občutljivost, se trenutno uporablja za reševanje številnih kliničnih problemov. Z njegovo pomočjo lahko v enem vzorcu biološkega materiala hkratno detektiramo znane tumorske markerje, srčne markerje, markerje akutne faze in sladkorna bolezen, širok spekter citokini, kemokini, rastni faktorji. Hkratna detekcija več analitov v enem biološkem vzorcu lahko bistveno skrajša čas pregleda bolnika. Do danes so bili razviti številni testni sistemi za odkrivanje protiteles proti povzročiteljem SPO, zlasti sifilitične okužbe, z metodo xMAP.

ZDRAVSTVENI DOM"Na Samotechnaya"

Sprejem po dogovoru! Sobota Nedelja.